发根农杆菌介导转化小金海棠的影响因素

为了研究发根农杆菌介导的小金海棠的遗传转化体系,采用农杆菌侵染的方法,对影响Ri质粒诱导小金海棠产生发状根的各种因素进行了研究,结果发现,Ri质粒转化小金海棠形成发状根的效率,受发根农杆菌种类、浓度、生理状态及小金海棠外植体的种类、外植体在菌液中的侵染时间、共培养时间、基本培养基等多种因素的影响,加入20mg/L AS对转化效率影响不大。采用稀释5倍的处于对数生长期的8196菌株,感染小金海棠无菌苗幼嫩叶片5-10min,在MS培养基上共培养2d后转入含卡那霉素10mg/L、头孢霉素250mg/L的1/4MS诱导培养基上培养一个月,发根诱导效率最高可达93.3%.随机选择50条诱导的发根进行GUS染色,结果发现有96%发根GUS染色呈阳性。对48条GUS阳性的发根进行PCR检测,其阳性率为100%。高效的发根诱导体系为发根的进一步再生及转入外源基因奠定了基础。     

农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立

为建立农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)遗传转化体系,以草坪型高羊茅品种凌志的胚性愈伤组织为受体材料,通过gus基因瞬时表达检测,研究了多种因素对农杆菌介导转化的影响。结果表明,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件为:愈伤组织在含BAP和NAA各0.5mg/L的培养基上预培养3d;菌液浓度OD600值0.7,感染时间15min;农杆菌预培养基和悬浮培养基以及共培养基中添加100μmol/L的乙酰丁香酮;共培养温度23℃,共培养时间3d,共培养基pH值5.2。不同浓度潮霉素筛选效果试验表明,采用低浓度(50mg/L)潮霉素连续筛选,再生获得的转基因植株数最多,因此是最为可取的筛选方式。     

农杆菌介导春小麦遗传转化体系的优化研究

采用携带GUS基因双元表达载体p1301-Pubi-Ecppc的根癌农杆菌菌株C58c1、LBA4404和EHA105对4个春小麦品种的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。结果表明,3M1.5为最佳诱导培养基;扬麦158和扬麦10是用于小麦遗传转化的良好基因型。对农杆菌转化条件进行进一步优化,得出用农杆菌C58c1侵染预培养15d的扬麦158幼胚愈伤组织,当侵染液浓度为OD6000.8、侵染40min、共培养3d时,可以提高农杆菌介导小麦遗传转化的筛选频率和PCR阳性率。对所得到的具有hyg抗性的愈伤和抗性植株进行GUS基因化学组织检测和PCR分子鉴定,初步证明Ecppc基因已整合到小麦再生植株基因组中。本研究初步建立了农杆菌介导小麦的遗传转化体系。     

高粱茎尖再生体系及其遗传转化影响因子的研究

本文对高粱茎尖再生体系及其转化影响因子进行了研究。不同基因型的茎尖再生频率有很大差异,说明基因型是影响茎尖再生的一个重要因素。在9种不同的激素组合中,以0.25MG/L KT、0.5MG/LBAP和0.25MG/L IAA对茎尖的再生效果最好。在MS培养基的基础上,采用B5培养基维生素并添加200MG/L L-ASN,10MG/L抗坏血酸和100MG/L PVP可提高茎尖再生频率。对农杆菌介导高粱茎尖转化的因子进行了优化,获得较高转化频率的条件为:茎尖预培养时间3D,在OD600值为0.5农杆菌菌液中感染10MIN,共培养3D。     

小油桐外植体的KN1基因遗传转化及其超量表达的转基因植株

本研究采用农杆菌介导法将KN1基因遗传转化小油桐,并获得了转基因植株。在研究中分析了农杆菌菌液菌液的浓度、侵染时间和外植体的大小对遗传转化效率的影响以及KN1基因超量表达对转基因植株再生的影响。研究结果表明：以苗龄15d左右的小油桐无菌苗子叶为外植体,农杆菌菌液浓度OD600为0.6～0.8时,侵染8min,外植体大小为（0.8×0.8）～（1.0×1.0）mm时,遗传转化效果最好;对抗性芽及再生植株进行GUS及PCR检测结果表明,KN1基因已经整合到小油桐植物基因组中。KN1基因的超量表达可提高小油桐再生芽分化,影响转化芽及植株的外观形态及叶片的表型,包括芽及植株矮小,茎杆粗壮;叶片缩小,边缘分裂,对称性丧失,无子叶柄等。     

RS基因转化胡萝卜及高白藜芦醇转基因胡萝卜株系筛选

摘要：白藜芦醇是具有抗病及多种保健功能的芪类次生代谢物,胡萝卜则是富含β胡萝卜素等多种营养成分的重要蔬菜。本研究着眼于创建具有白藜芦醇保健功能的胡萝卜新种质资源，在对葡萄白藜芦醇合成酶（Resveratrol synthase 简称RS）基因针对在胡萝卜中表达的密码子优化基础上构建无潮霉素抗性基因的转化载体pCB－RS－hyg-，应用农杆菌介导遗传转化方法将pCB和pCB－RS－hyg-共转化到胡萝卜并获得再生植株。经过T0、T1和T2代的逐代筛选，获得2个白藜芦醇含量较高的转基因胡萝卜株系，为进一步开发利用以及相关代谢途径的分子生物学研究奠定了重要基础。     

白藜芦醇合成酶(RS)基因转化胡萝卜及高白藜芦醇转基因胡萝卜株系的筛选

白藜芦醇是具有抗病及多种保健功能的芪类次生代谢物,胡萝卜(Daucus carota var.sativa)则是富含β胡萝卜素等多种营养成分的重要蔬菜。研究着眼于创建具有白藜芦醇保健功能的胡萝卜新种质资源,在对葡萄(Vitis vinifera L.)白藜芦醇合成酶(resveratrol synthase,RS)基因在胡萝卜中高效表达的密码子优化基础上构建无潮霉素磷酸转移酶(HPT)抗性基因的转化载体pCB-RS-hyg-,应用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将pCB和pCB-RS-hyg-共转化到胡萝卜并获得再生植株。经过T0、T1和T2代的逐代筛选,获得2个白藜芦醇含量较高(11.34和15.23mg/g)的转基因胡萝卜株系。     

不同种植方式对水稻植株发根力的影响

采用剪根水培和3H核素示踪的方法研究了种植方式对水稻植株不同生育阶段发根力的影响。结果表明:发根力指标在整个生育期内呈单峰曲线,单株根长、根数和根重均在孕穗期达到峰值;3种种植方式中,常耕插秧处理的植株在拔节至抽穗期发根力最强,而免耕留茬抛秧处理的发根力最低。抽穗后10d,免耕留茬抛秧处理的新根重、新根3H-同化物比活度、总活度和分配比例均最高。新根干重与新根的3H-同化物分配比例呈极显著正相关,与穗的3H-同化物分配比例呈极显著负相关。     

滇黄芩毛状根的诱导及其黄芩苷含量测定

本文利用发根农杆菌A grobacterizum rhizogenes1.2556感染滇黄芩再生苗的茎段和叶片,建立了毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的茎、叶外植体表面产生,在无外源激素的MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。毛状根茎段的诱导率较叶片高,最高可达到14.44%;经rolB基因PCR分析和甘露碱纸电泳检测,证明Ri质粒T-DNA已整合到滇黄芩基因组中并表达;毛状根在附加6-BA2mg/L和NAA0.2mg/L的MS固体培养基上直接诱导不定芽,并在MS培养基上生根,形成再生植株。获得的毛状根系经MS液体培养基培养30d后通过HPLC都能检测到黄芩苷,其中1个转化系黄芩苷含量为2.59%,是药材黄芩的0.20倍,而从3年单位时间黄芩苷生成量计算,毛状根是药材黄芩的7.18倍。本研究建立的毛状根培养体系,将对滇黄芩转基因技术的完善和利用毛状根生产黄芩苷的生物转化提供了实验基础。     

甘蓝型油菜抗病虫双价基因转化体系的建立

以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品种浙双758子叶柄外植体为受体,建立农杆菌介导转化体系,研究乙酰丁香酮、羧苄青霉素浓度和潮霉素筛选浓度等对农杆菌遗传转化效果的影响。结果发现,羧苄青霉素对农杆菌的抑制效果以500mg/L最佳,且对子叶柄外植体愈伤组织诱导和分化的影响最小,愈伤组织诱导率和芽再生率分别为75.2%和65.1%。5.0mg/L的潮霉素能完全抑制未转化再生植株的生长,使其最终褐化死亡,在此潮霉素筛选浓度下,获得了32株转化再生植株。共培养时培养基中添加100μmol/L AS的芽再生率为3.9%,显著高于未添加AS的芽再生率（2.0%）,说明共培养阶段添加酚类物质乙酰丁香酮有利于转化载体T-DNA的转化。部分转化再生植株经PCR和Southern杂交检测呈阳性,病虫害接种试验表明转化植株对菌核病和小菜蛾有较好的抗性。