正响应盐胁迫的甘蔗6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的克隆

从甘蔗中克隆获得1个6PGDH基因的cDNA序列,记为Sc6PGDH(登录号:KF921299).该基因序列含有1个1467 bp的完整开放阅读框,推导编码488个氨基酸残基.生物信息学分析可知,Sc6PGDH基因编码的蛋白分子质量为53.6561 ku,为酸性稳定的亲水蛋白,含有信号肽,可能定位于内质网膜上,具有该类蛋白典型的保守结构域6PGD,且与分离自谷子、玉米和水稻的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列同源性分别高达96.11%、95.70%和93.24%,表明该基因在进化过程中比较保守.原核生物生长试验结果显示,甘蔗Sc6PGDH基因的表达蛋白可以显著增强大肠杆菌Rosetta菌株的耐盐性,推测该基因可能参与了生物体对盐胁迫的应答过程.     

米曲霉6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd)的克隆及生物信息学分析

采用PCR技术从米曲霉CICC2012菌株基因组中克隆6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd),并利用生物信息学手段对其氨基酸序列、进化树、理化性质、蛋白质结构等进行分析.序列测定和分析结果表明.gnd基因序列长为1 723 bp.包含1个1 551 bp的开放阅读框,编码516个氨基酸;gnd基因编码的6PGDH氨基酸序列与黄曲霉6PGDH基因的同源性为99％,存在的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点分别有11,2和6个;6PGDH蛋白分子量为57.3 kD,等电点为5.63; gnid基因编码蛋白二级结构α-螺旋区域占44.57％,β-折叠区域占12.79％.无规则卷曲区域占42.64％;氨基酸残基11～195位点为NADP+结合区域.     

黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

以黄瓜品种露丰为材料,根据已报道的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH)的保守氨基酸序列设计简并引物,利用RT-PCR技术获得黄瓜6PGDH的cDNA同源片段,命名为CSPG(登录号为EU815934)。该片段长度为1 207 bp,包含一个936 bp的开放阅读框(编码311个氨基酸)和271 bp的Poly A 3′非翻译区末端,无内含子;该基因编码的氨基酸序列与拟南芥、大豆、水稻、玉米、菠菜的6PGDH基因有75%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对6PGDH基因的转录水平进行分析,结果表明:该基因在叶、根、茎中均有表达,高温胁迫下的表达量高于常温对照,说明6PGDH基因与热胁迫相关。     

甘蔗ADP/ATP转运蛋白酶基因克隆及其序列的生物信息学分析

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是C4光合途径作物,有着特殊的能量代谢系统,研究其能量代谢过程的ADP/ATP转运蛋白酶基因具有重要的意义.采用同源克隆原理结合PCR技术克隆甘蔗AAC转运蛋白酶基因,并应用生物信息学方法,对其进行多序列比对分析、物理性质分析、三级结构预测、亚细胞定位、跨膜区域预测和疏水性分析.结果表明,克隆获得了甘蔗AAC cDNA序列的全长为1170bp,包括一个可编码387个氨基酸的完整ORF.生物信息学分析显示,AAC家族基因的N端序列相对不保守,C端序列高度保守;其分子量是42.265 kD,理论等电点是9.79,预测其为稳定的蛋白;GRAVY值为-0.099;含有6个跨膜区域;其6个跨膜螺旋(TM1-TM6)跨越磷脂双分子层结构,盐桥可能是通过中间的3个连接螺旋α1～α3共同构成的;定位在细胞质的概率为60.9%.获得了甘蔗AAC完整ORF序列,并通过生物信息学预测该基因所编码的蛋白为一个稳定跨膜蛋白,且可能定位在细胞质,为甘蔗AAC基因的深入研究和应用奠定初步基础.     

淡色库蚊烯醇化酶全长基因的克隆及生物信息学分析

根据已获得的致倦库蚊抗性品系与敏感品系差异表达的EST片段(GeneBank号:EC093827.1),设计特异扩增引物,运用RACE技术从淡色库蚊抗性品系中扩增出该基因的全长cDNA序列,并分析其生物信息学特性,获得淡色库蚊烯醇化酶基因cDNA全长1 311bp序列,编码433个氨基酸,该基因编码的蛋白为水溶性蛋白,具有13个磷酸化位点。同源比对及系统进化分析表明,该基因于不同物种间高度保守,其氨基酸序列与同属蚊科的致倦库蚊同源性高达97.8%,并在其保守结构域中含有多个高度保守的氨基酸位点,推测该基因与淡色库蚊的氯菊酯抗性有一定相关性,并初步预测其在蚊虫产生抗药性过程中的可能机制。     

甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifH基因的克隆与序列分析

【目的】了解甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的生物信息学,为揭示甘蔗内生固氮菌DX120E的固氮分子机理提供理论依据。【方法】根据NCBI上其他固氮菌株的nif H序列设计引物,对内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E菌进行PCR扩增;运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。【结果】甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nif H基因的ORF为882bp,Gen Bank登录号为KF732646.1,与Klebsiella pneumoniae 342、Klebsiella variicola At-22等6种固氮菌的nif H基因氨基酸序列同源性高达95.0%-99.0%。DX120E nifH蛋白与Klebsiella pneumoniae 342的亲缘关系最近,与非克雷伯氏菌固氮菌的亲缘关系较远。生物信息学分析显示,菌株DX120E的nif H基因编码293个氨基酸,起特别重要的氨基酸残基非常保守。该基因在N端有11个氨基酸残基即酪氨酸—甘氨酸—赖氨酸—甘氨酸—甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—赖氨酸—丝氨酸—苏氨酸—苏氨酸,其属于典型结合ATP的基序结构。nif H蛋白分子量为32.07k D,pI为4.92,为酸性蛋白;其具有2个ASN糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,6个CK2磷酸化位点,6个PKC磷酸化位点。疏水性预测显示该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽。【结论】变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的推导氨基酸序列与克雷伯氏菌固氮菌属具有较高的同源性,该基因在甘蔗生物固氮过程中可能起重要作用。     

不结球白菜BrCBF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中克隆到1个抗寒相关基因,命名为BrCBF,基因登陆号为DQ402470.其cDNA全长1 003 bp,含有648 bp的完整开放阅读框,编码216个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与拟南芥、荠菜、甘蓝型油菜编码的氨基酸序列有极高的同源性,且具有CBF典型的保守结构域AP2.     

不结球白菜BrCBF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中克隆到1个抗寒相关基因,命名为BrCBF,基因登陆号为DQ402470.其cDNA全长1 003 bp,含有648 bp的完整开放阅读框,编码216个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与拟南芥、荠菜、甘蓝型油菜编码的氨基酸序列有极高的同源性,且具有CBF典型的保守结构域AP2.     

甘蔗转化酶抑制子(SoInvInh1)基因克隆和表达分析

采用cDNA末端快速克隆(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,以甘蔗未成熟茎cDNA为模板克隆转化酶抑制子,命名为SoInvInh1,GenBank登录号KF575175。SoInvInh1基因的cDNA序列全长为678bp,3′-UTR长146bp。开放阅读框长531bp,编码176个氨基酸,预测分子质量和等电点分别为18.09ku和8.52。SoInvInh1不含内含子序列。预测该蛋白N端具有1个信号肽和跨膜结构,19—172位氨基酸是PMEI蛋白的保守结构域。不同物种间InvInh蛋白氨基酸序列同源性较低,但都具有4个保守的Cys位点。荧光定量PCR分析表明在甘蔗茎、叶、花序和花序轴中都能检测到SoInvInh1基因表达。在甘蔗生长的不同时期,SoInvInh1在叶中表达无明显规律。而在工艺成熟期和生理成熟前期SoInvInh1整体上表现为幼茎中基因表达量高,而老茎中基因表达量低,表明茎中该基因可能与酸性转化酶活性相关。     

甘蔗乙烯受体基因Sc-ERS的克隆与序列分析

根据已知乙烯受体基因的序列信息,设计1对简并引物和1对特异引物,对甘蔗叶片基因组DNA进行PCR扩增,获得1个甘蔗乙烯受体基因（Sc-ERS）的片段,其大小为4310 bp,包含1个由5个外显子和4个内含子组成的4219 bp大小的完整编码区。Sc-ERS编码区与玉米乙烯受体ERS1基因（AY359578）、水稻乙烯受体ERS1基因（AY043031）编码区的同源性分别为91.4%、61.6%;推导Sc-ERS编码的蛋白包含636个氨基酸残基,与玉米、水稻乙烯受体基因所编码蛋白的氨基酸同源性分别为94.1%、89.4%。其推导蛋白结构分析结果显示,Sc-ERS编码的蛋白和玉米、水稻ERS1所编码的蛋白相同,在N段保守区含有3个跨膜结构,并由3个跨膜结构、GAF结构、HisKA和HATPase_c组成功能域。核苷酸序列分析和蛋白质结构分析结果表明,Sc-ERS基因属于ERS1基因。     

应用改良TAIL-PCR克隆黄瓜6PGDH基因上游序列

运用改良的热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)对黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6-phosphogluconate dehydrogenase gene, 6PGDH)的上游序列进行了克隆。与最初的TAIL-PCR相比较,主要改进之处有:(1)根据Primer 5.0软件计算结果从随机RAPD引物库中筛选出合适的上游引物,低严谨和高严谨反应中的退火温度也分别进行了调整;(2)将热不对称交替反应继续应用到第3轮PCR扩增反应中以提高特异目的条带和减少非目的条带。经过3轮PCR扩增反应最终获得位于黄瓜6PGDH起始密码子ATG上游长度为517 bp新序列。试验结果表明,应用改良TAIL-PCR能快速、有效地克隆与已知区域相邻的序列。     

杜仲肉桂醇脱氢酶基因全长cDNA克隆及序列分析

以杜仲(Eucommia ulmoides Olive)4、5月份新长成的杜仲幼嫩叶片为材料,在克隆一段肉桂醇脱氢酶(cin-namyl alcohol dehydrogenase,CAD)基因的基础上,以杜仲cDNA为模板,采用cDNA末端快速扩增法(Rapid ampli-fication of cDNA Ends,RACE)克隆了5’端828 bp和3’端798 bp cDNA序列,经5’RACE产物和3’RACE产物序列拼接,获得全长为1243bp的杜仲CAD cDNA序列,开放阅读框编码243个氨基酸,命名为EuCAD(GenBank登录号:DQ142643)。与GenBank中序列比对分析发现,该cDNA序列与苹果树、桉树、红橡树中的CAD基因序列同源性均为81%,预测编码的氨基酸序列与苹果树、桉树、红橡树的同源性分别为73%、70%和70%,因此认为是杜仲肉桂醇脱氢酶基因。该基因为首次从杜仲中克隆,为探索木质素的合成调控机理奠定基础。     

木薯锌指转录因子MeDi19-1基因克隆及表达分析

【目的】克隆木薯锌指转录因子基因MeDi19-1,分析其编码蛋白特征、亚细胞定位、转录激活活性及在木薯不同组织中的表达水平,为探究MeDi19-1基因在木薯中的作用机制提供理论参考。【方法】从木薯KU50扩增MeDi19-1基因编码区（CDS）序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并构建pNC-Green-SubC-MeDi19-1融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白的亚细胞定位情况。利用酵母系统确定其转录激活活性,并基于木薯不同组织转录组数据分析其组织表达特性。【结果】MeDi19-1基因CDS序列（OL620080）长度为618bp,共编码205个氨基酸残基,蛋白分子量为22416.79 Da,理论等电点（pI）为6.10,属于不稳定疏水蛋白,含有Di19蛋白家族典型的锌指结构域zf-Di19。MeDi19-1蛋白的二级结构中含有无规则卷曲（53.66%）、α-螺旋（40.49%）、延伸链（4.39%）和β-转角（1.46%）。MeDi19-1蛋白氨基酸序列与橡胶树（Hevea brasiliensis）Di19蛋白氨基酸序列（XP_021655585.1）相似性最高,为83.50%。MeDi19-1基因启动子元件含有脱落酸（ABA）、赤霉素和茉莉酸等激素响应元件及胁迫响应元件和光响应元件。MeDi19-1蛋白亚细胞定位于细胞膜和细胞核中,具有转录激活活性,且活性区域在C端。MeDi19-1基因在叶、叶中脉和储藏根中相对表达量较高。【结论】MeDi19-1基因属于Di19基因家族成员,具有组织表达特异性,主要在叶、叶中脉和储藏根中发挥调控作用,其编码蛋白在木薯组织中作为转录因子参与调节多项生理活动。     

烟草高亲和钾转运蛋白基因NtHAK5克隆及表达模式分析

【目的】克隆烟草高亲和钾转运蛋白基因（NtHAK5）,并分析其在不同非生物胁迫下的表达模式,为深入探究该基因在烟草抵御低钾胁迫等非生物胁迫中的功能和作用机制提供理论参考。【方法】从普通烟草K326中扩增NtHAK5基因编码区（CDS）序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并构建pBWA (V) HS-NtHAK5-GLosgfp融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白的亚细胞定位情况。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测NtHAK5基因在不同组织和不同非生物胁迫条件下的表达特性,以无胁迫处理（正常供钾2 mmol/L K+）的植株为对照（CK）。【结果】烟草NtHAK5基因CDS序列全长2418 bp,共编码805个氨基酸残基,其编码蛋白的分子量为89874.00 Da,理论等电点（pI）为8.65,属于稳定性疏水蛋白,含有HAK家族蛋白典型的跨膜结构域。NtHAK5基因的二级结构中α-螺旋占40.12%,延伸链占24.97%,无规则卷曲占26.21%,β-折叠占8.70%。NtHAK5蛋白与烟草NtHAK1和黄花烟草NrHAK1蛋白的氨基酸相似性分别为40.69%和40.44%,与拟南芥AtHAK5相似性最高,为58.26%。NtHAK5基因启动子含有厌氧、低温、干旱、脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）响应的相关顺式作用元件。NtHAK5蛋白定位在细胞膜上。低钾胁迫处理下和正常供钾（CK）条件下,NtHAK5基因在根、茎、老叶和新叶中均有表达,且均以老叶中相对表达量最高。NtHAK5基因在干旱胁迫、冷害处理、盐胁迫和低钾胁迫下的相对表达量显著高于CK （P<0.05）,但在低氮和低磷条件下的相对表达量与CK无显著差异（P>0.05）。【结论】 NtHAK5基因属于HAK基因家族成员,具有明显组织表达特异性,参与烟草植株对干旱胁迫、冷害胁迫、盐胁迫和低钾胁迫等非生物胁迫响应,推测其编码的蛋白在烟草组织中作为K+转运体参与非生物胁迫下K+的吸收、转运和再利用。     

澳洲坚果MiSTPP6基因克隆及低温胁迫下表达分析

【目的】克隆澳洲坚果丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1）家族基因（MiSTPP6）,并分析其不同组织及低温胁迫下的表达模式,为澳洲坚果PP1家族基因的抗寒分子机制提供理论依据。【方法】基于澳洲坚果转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆MiSTPP6基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测其在不同组织及低温胁迫下的表达情况。【结果】从澳洲坚果中克隆获得MiSTPP6基因（GenBank登录号为MT374553）,其cDNA全长2129bp,最大的阅读框（ORF）长度为948bp,编码315个氨基酸残基,含有PP1蛋白家族的典型结构域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE）。MiSTPP6蛋白为稳定的亲水性蛋白,以丝氨酸磷酸化为主,可能定位于细胞质,属于非分泌型蛋白或膜蛋白,与已知植物PP1蛋白的氨基酸序列具有很高的相似性。MiSTPP6蛋白的二级结构由α-螺旋(占40.00%)、无规则卷曲(占32.38%)、延伸链（占18.41%）和β-转角（占9.21%）,其三级结构与模板蛋白4v0u.1.A的结构相似度为80.60%,GMQE值为0.89。MiSTPP6基因在根、茎、叶、刚开放的小花和谢花后30~45d的小果中均有表达,其中,MiSTPP6基因在刚开放的小花中的相对表达量最高。4 ℃低温胁迫后0.5~24.0h,MiSTPP6基因在澳洲坚果苗期叶片中的相对表达量较对照明显下调,整体上呈持续下降的趋势。【结论】MiSTPP6属于PP1家族基因,具有组织表达特异性,可能在澳洲坚果抗寒分子机制中发挥重要的调控作用。     

甘蓝BobHLH121基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】克隆甘蓝bHLH转录因子（BobHLH121）基因,分析其在不同组织及低温胁迫下的表达模式,为深入研究bHLH转录因子在甘蓝低温响应中的作用机理提供理论参考。【方法】克隆BobHLH121基因编码区（CDS）序列,利用生物信息学软件进行预测分析,并构建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白亚细胞定位情况。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测BobHLH121基因在低温胁迫下的相对表达量。【结果】BobHLH121基因CDS长度为1367bp,定位于C06染色体上,其编码311个氨基酸,蛋白分子量为34.89 kD,理论等电点（pI）为5.42,不稳定系数为52.29,疏水性平均系数为-0.733,说明该蛋白为不稳定的亲水性蛋白,且呈酸性,定位于细胞核。BobHLH121蛋白的二级结构主要由α-螺旋（占30.87%）、延伸链（占9.32%）、β-转角（占2.89%）和无规则卷曲（占56.91%）组成,具有保守的HLH结构域。BobHLH121蛋白与拟南芥（NP_191768.2）、琴叶拟 南 芥（EFH52923.1）、亚 麻 荠（XP_01909381.1）、荠 菜（XP_023638997.1）、油 菜（CDY65446.1）、白 菜（XP_009104362.1）和萝卜（XP_018442860.1）等多种植物bHLH蛋白的氨基酸相似性分别为55.6%、54.8%、52.0%、50.3%、76.4%、73.9%和61.1%。系统发育进化树分析结果显示,BobHLH121与拟南芥（NP_191768.2）和琴叶拟南芥（EFH52923.1）bHLH蛋白在同一小分支上。BobHLH121基因启动子区域存在植物生长发育、非生物胁迫、激素应答和光响应大量的顺式作用元件。BobHLH121基因在叶片的相对表达量显著高于其他组织（P<0.05,下同）,在其他组织中的相对表达量均较低。低温胁迫6~12h时BobHLH121基因的相对表达量较低温处理0h（对照）显著降低,在低温处理24h时急剧升高,显著高于其他处理时间,低温处理48 h时又显著降低,表明该基因可能在低温胁迫下延迟表达。【结论】BobHLH121基因含有bHLH家族典型的HLH保守结构域序列,具有明显的组织表达特异性,可能参与甘蓝叶片的生长发育调控,且响应低温胁迫,可能在甘蓝耐寒性中发挥调控作用。     

猪链球菌2型广西分离株毒力基因表型分析

【目的】了解广西致病性猪链球菌2型（SS2）菌株的毒力基因表型,为广西SS2的防制提供分子生物学依据。【方法】应用PCR技术对分离自发病猪的SS2菌株进行荚膜多糖糖基转移酶基因（CPS2J）、溶菌酶释放蛋白基因（MRP）、细胞外蛋白因子基因（EF）、溶血素基因（SLY）和谷氨酸脱氢酶基因（GDH）5种毒力基因检测。【结果】60%菌株的基因表型为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY＋/GDH＋,30%为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY-/GDH-,10%为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY-/GDH＋。【结论】CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY＋是广西致病性SS2菌株的主要基因表型,与从江苏、四川SS2疫区分离获得的菌株基因表型一致,今后应加强对SS2毒力基因的监测,严防SS2疫情暴发。     

猪链球菌2型广西分离株毒力基因表型分析

【目的】了解广西致病性猪链球菌2型（SS2）菌株的毒力基因表型,为广西SS2的防制提供分子生物学依据。【方法】应用PCR技术对分离自发病猪的SS2菌株进行荚膜多糖糖基转移酶基因（CPS2J）、溶菌酶释放蛋白基因（MRP）、细胞外蛋白因子基因（EF）、溶血素基因（SLY）和谷氨酸脱氢酶基因（GDH）5种毒力基因检测。【结果】60%菌株的基因表型为CPS2J+/MRP+/EF+/SLY+/GDH+,30%为CPS2J+/MRP+/EF+/SLY-/GDH-,10%为CPS2J+/MRP+/EF+/SLY-/GDH+。【结论】CPS2J+/MRP+/EF+/SLY+是广西致病性SS2菌株的主要基因表型,与从江苏、四川SS2疫区分离获得的菌株基因表型一致,今后应加强对SS2毒力基因的监测,严防SS2疫情暴发。     

大青杨纤维素合成酶PuCesA6基因cDNA的克隆及序列分析

以大青杨总RNA为模板,通过反转录PCR获得纤维素合成酶PuCesA6基因的全长cDNA序列。序列分析结果表明：其cDNA序列全长3778bp,开放读码框序列3264bp,共编码1087个氨基酸。PuCesA6基因编码的氨基酸序列具备被子植物纤维素合酶基因的特征：锌指结构域、高变区I（HVR—I）、高变区II（HVR—II）与β-糖苷转移酶有关的保守结构域以及8个跨膜区。通过多氨基酸序列比对发现,与光皮桦B1CesA5相似度最高,为89％;其次是玉米ZmCesA8,相似度为80％,且8类CesA的锌指结构与c末端氨基酸序列高度保守。34种CesA蛋白序列的分子进化分析表明,大青杨PuCesA6蛋白与欧洲颤杨PtrCesA6蛋白亲缘关系最近,相似度达99％;和光皮桦BICe．sA5、大桉EgCesA6蛋白同聚为一类。