德州驴生长激素基因的克隆与序列分析

摘要：【研究目的】为了研究德州驴生长激素基因的多态性及其对生长发育的影响,【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果,在线设计引物,应用PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的德州驴GH基因DNA序列及其推定cDNA、氨基酸序列进行分析。【结果】结果表明德州驴GH基因DNA序列约为1928bp,包含完整的5个外显子和4个内含子,德州驴GH基因DNA序列与德宝矮马67、蒙古马、猪、牛、绵羊和人GH基因序列的同源性分别为98.8%、98.2%、79.4%、68.3%、70.9%和68.3%,cDNA编码的氨基酸序列同源性分别为99.5%、98.6%、97.2%、89.8%、88.9%和68.4%。【结论】表明GH基因在进化上非常保守。     

蒙古羊卵巢组织差异表达基因ADAMTS1的电子克隆及RT-PCR验证

在单、双羔蒙古羊卵巢组织抑制性消减杂交的基础上,以其差异表达片段ADAMTS1基因序列为种子序列,采用GenBank的BLAST检索系统首先对蒙古羊的ADAMTS1基因序列片段进行了电子延伸,其次在获得蒙古羊AD-AMTS1基因的cDNA全序列后设计引物,采用RT-PCR方法进一步克隆了蒙古羊ADAMTS1基因。结果显示,试验所得序列与电子延伸序列的同源性为99.4%,序列长为2 420 bp包括836 bp 3'UTR区域和1 578 bp的完整开放读码框,共编码525个氨基酸。Blastn比对发现蒙古羊ADAMTS1基因序列与牛、猪和人的同源性分别为94%,87%,82%;对氨基酸序列进行blastp比对发现与牛、猪和人的同源性分别为91%,90%,87%。采用SMART程序预测其结构功能域发现蒙古羊ADAMTS1蛋白质有4个结构功能域:1个富半胱氨酸结构域和3个血小板反应蛋白。     

猪骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及序列分析

目的：克隆猪骨形态发生蛋白4（BMP-4）成熟肽基因。方法：提取猪肾的总RNA,通过RT-PCR技术扩增出目的基因,并将其回收后与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,进行阳性克隆的筛选与鉴定。结果：琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物,显示结果与预期片段大小一致,质粒PCR检测、酶切鉴定证实重组克隆中插入了PCR产物,测序结果揭示BMP-4成熟肽cDNA长为351bp,编码116个氨基酸。序列对比表明,猪与人、小鼠、牛、绵羊BMP-4成熟肽cDNA序列的同源性分别为94.87%、90.60%、94.87%、94.59%,而相应的氨基酸同源性分别为99.12 %,99.12 %,100 %、100%。 结论：首次成功地克隆了猪BMP-4成熟肽编码基因,对于进一步研究猪BMP-4全基因结构、功能及其与繁殖性能的关系有重要的意义。     

牛BMP-15基因cDNA的克隆和序列分析

BMP-15基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用,克隆了牛BMP-15成熟肽编码区的cDNA序列并进行序列分析,旨在为BMP-15在牛繁殖性能方面的进一步研究奠定理论基础。根据其他物种BMP-15基因的保守序列设计特异性引物,扩增牛的cDNA序列。从牛卵巢中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出牛BMP-15cDNA序列。将此片段克隆到PMD18-T载体中,经菌落PCR鉴定和DNA序列测定分析验证,证实所克隆序列BMP-15为骨形态发生蛋白,符合骨形态发生蛋白基因的特征。序列分析表明,该cDNA包含有1 185 bp组成的开放读码框(ORF),该ORF编码394个氨基酸,与绵羊、猪、人、小鼠等动物氨基酸序列比对发现同源性分别为98.5%,87.6%,74.0%,69.4%。     

猪脂肪特异性蛋白27基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,本试验克隆并分析了猪脂肪特异性蛋白27(fat specific protein 27)基因.各种组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E. coli JM109 ,检测阳性克隆并测序。猪FSP27基因的cDNA 序列,其全长为745bp,开放阅读框为11-727bp,编码有238个氨基酸。同源分析结果表明,猪FSP27的核酸序列与人、小鼠和牛的同源性分别为86%、77.6%、82.3%,氨基酸序列的同源性分别为83.2%、74.4%、79.3% 。组织分布结果显示：猪FSP27基因在多种组织均有分布。克隆的猪FSP27基因并注册GenBank (Accession.EU395789)。     

蒙古羊BMP15全长DNA序列的克隆与分析

BMP15基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用.根据其他物种BMP15基因的保守序列设计特异性引物,扩增蒙古羊的全长DNA序列.从蒙古羊的血液中提取总DNA,采用PCR技术扩增出蒙古羊BMP15 DNA序列.将此片段克隆到PMD18-T载体中,经菌落PCR鉴定和DNA序列测定分析验证,证实所克隆序列BMP15为骨形态发生蛋白,符合骨形态发生蛋白基因的特征.序列分析表明,该DNA包含两个外显子序列和一个内含子序列以及两端的非翻译序列,全长6 642 bp,编码393个氨基酸,蒙古羊与牛的同源性最高(98.6%),与猪的同源性为90.5%.     

Aspergillus niger 乳糖酶基因的克隆及序列分析

利用PCR及RT-PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)菌株DL116中克隆到了乳糖酶基因组DNA，cDNA序列(GENBANK ACCESSION No.EF103141)。序列分析表明，乳糖酶基因组DNA序列长3368bp，其中含有8个内含子，cDNA编码区长2967bp，共编码988个氨基酸，氨基酸序列中共含有12个潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行了同源性比较     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因同源片段的克隆与序列分析

在盐和干旱等渗透胁迫条件下,一些植物会积累甘氨酸甜菜碱(简称甜菜碱)作为渗透调节物质,甜菜碱在植物体内由胆碱经两步氧化形成,催化这两步反应的酶分别是胆碱单氧化物酶(cholinemonooxyge-nase,CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase,BADH)。由于甜菜碱的合成途径简单,进行遗传操作方便,在诸多抗逆性基因中甜菜碱合成酶基因被看作是最有希望的胁迫抗性基因。其中,BADH基因的全长cDNA序列首先被从藜科植物菠菜(Spinaciaoleracea)中克隆到,此后人们相继以该基因为参照,研究其它植物中的BADH基因。本文作者在以菠菜BADH基因为对照研究菊科植物的BADH基因时,根据已发表BADH基因的保守区序列设计了一对PCR兼并引物,以菠菜基因组DNA为模板,采用PCR法扩增出长分别为825bp(seq1)和822bp(seq2)的两个DNA片段,经测序和序列分析,seq1与GenBank中登录的菠菜BADH基因的基因组序列(U69142)一致,其外显子区与已发表的该基因的cDNA序列(M31480)一致,seq2与U69142序列的同源性为68%,其外显子区与M31480序列的同源性为83.93%。而且,在由该核苷酸序列推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶高度保守的十肽VTLELGGKSP,说明该基因为菠菜BADH基因的同源基因。根据现有文献分析,菠菜中可能存在两个BADH的同工酶,作者所克隆基因片段所属的基因可能编码菠菜BADH的另一个同工酶。该序列已在GenBank中登录,登录号:DQ070842。     

绵羊显性白位点基因（KIT）cDNA的克隆与序列分析

显性白位点基因座位编码一种跨膜蛋白-----肥大细胞生长因子受体,这种受体对黑色素细胞的形成、成熟及增殖迁移有重要作用。本研究克隆了绵羊KIT基因的部分编码序列,首次获得绵羊KIT基因的cDNA序列。并与其它动物相应区域作了同源性比较,结果表明：绵羊KIT基因exon11-19 cDNA长1003bp,编码含331个氨基酸残基的蛋白;蛋白质同源性比较显示,绵羊与牛、羊、猪、人、马等的同源性大于94%;通过对绵羊该蛋白进行结构域及结构分析,为进一步研究KIT基因与绵羊毛毛色的关系奠定了一定的理论基础。     

鸭IGF-IR基因部分序列克隆、鉴定及在胚胎期胸肌组织中的差异表达分析

为了克隆分析鸭IGF-IR基因部分的cDNA序列,并研究该基因的组织表达规律。通过同源性比对,克隆了IGF-IR基因cDNA部分片段,并运用生物信息学方法分析了不同物种序列进化关系,运用荧光绝对定量PCR技术检测了IGF-IR mRNA在肉用型品种高邮鸭和蛋用型品种金定鸭胚胎期不同发育时期胸肌中的表达。序列分析结果表明：克隆得到的鸭IGF-IR基因cDNA270 bp片段长度,其核苷酸序列与鸡、人、小鼠、大鼠、猪、牛的IGF-IR基因相应核苷酸序列的同源性分别为95%、79%、78%、77%、78%、76%;荧光绝对定量结果表明：IGF-IR基因在胸肌中呈“波浪形”表达,在21胚龄表达量最高,与17、25、27胚龄和7日龄差异显著(P<0.05);IGF-IR基因在品种间表达量除21胚龄时差异显著外(P<0.05),其余各胚龄差异均不显著(P>0.05),表明IGF-IR mRNA的表达在所研究品种胚胎期的胸肌中相对稳定。     

萼脊兰Actin基因片段的克隆及序列分析

从萼脊兰叶片中克隆Actin基因,为研究其生理功能及其他基因在萼脊兰中的表达和调控奠定基础。根据GenBank中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计简并引物,以萼脊兰叶片总RNA为模板,利用RT-PCR技术得到了3个Actin基因片段。序列分析结果表明,3个Actin基因片段长度均为1062 bp,编码354个氨基酸,具有Actin基因的功能位点;与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列的同源性在80%以上,氨基酸序列的同源性在96%以上。本研究中得到的3个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为SeACT1、SeACT2和SeACT3,并在GenBank注册,登录号分别为JN981138、JN981139和JN981140。     

苎麻ACC合酶基因(BnACS1)的克隆和表达分析

根据苎麻转录组测序中的ACS基因片段, 利用RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆了该基因的全长cDNA序列, 命名为BnACS1, 在GenBank中的登录号为JQ970520。该基因的cDNA序列全长为1 674 bp, 其开放阅读框长1 470 bp, 编码489个氨基酸多肽, 预测其分子量和等电点分别为54.55 kD和6.37, 与苹果(AB034993)、枇杷(GQ370520)、苦瓜(AF248734)、牡丹(DQ337250)、烟草(AY426755)和胡杨(AB033502) ACS基因核苷酸序列的相似性分别为74%、74%、72%、71%、70%和70%, 氨基酸序列的相似性分别为75%、74%、71%、71%、70%和74%。半定量RT-PCR分析表明, BnACS1基因在根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达, 其中在根和雄花中表达较高, 在茎中表达最低。荧光定量PCR分析表明, BnACS1受ABA和干旱的诱导表达上调, 不受高盐诱导表达。     

百合花青素苷合成酶基因片段的克隆及表达分析

为了克隆百合花青素苷合成酶基因(anthocyanidin synthase, ANS),通过已报道的其他物种的ANS基因保守序列设计简并引物,采用同源克隆的方法成功克隆得到了百合ANS基因片段,该片段长701 bp,编码233个氨基酸残基。根据蛋白比对结果,百合ANS基因编码的氨基酸序列与郁金香、荷兰鸢尾、甜樱桃的一致性分别为86%、81%、77%。采用半定量RT-PCR法分析表明,该基因在百合花瓣中的表达水平最高,叶和茎次之,鳞茎中不表达。本研究从百合中分离得到了ANS基因片段,为后续获得基因全长打下了基础。     

甘薯二羟基黄酮醇还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据其它作物的二羟基黄酮醇还原酶（DFR）基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR方法从甘薯块根中分离出花青素合成相关基因DFR基因,并定名为ibDFR。该基因全长1232bp,编码398aa。核甘酸序列分析表明,与牵牛相似系数达85%,与烟草的相似系数达到67%,与马铃薯的相似系数达75%。将ibDFR连接到pET30a（＋）载体中,检测ibDFR在大肠杆菌中的表达。实验结果表明ibDFR蛋白质分子量大小与推算一致,能在大肠杆菌中转录表达。     

青海高寒草地牧草拮抗内生细菌的筛选、鉴定及促生功能测定

以尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium)为指示菌从青海高寒草地牧草内生细菌中筛选拮抗菌株,结合形态学特征和16Sr DNA基因序列同源性分析鉴定,并进行促生功能测定。结果表明,供试的81株内生细菌中36株有拮抗作用,占供试菌株的44.0%,其中从根部分离的13株的抑菌率均在50.0%以上,菌株2018GH11对6属8种病原真菌的抑菌率均在50.0%以上,特别对孜然根腐病菌的抑菌率达67.6%,抑菌谱宽;根据形态学特征和16Sr DNA基因序列分析将其鉴定为暹罗芽孢杆菌Bacillus siamese;2018GH11具有固氮能力,无溶磷和产IAA能力;发酵菌剂2018GH11用量为0.50%时,黄瓜株高、茎粗、叶片数、鲜重及干重分别比对照增加了15.33%、39.40%、22.22%、215.99%和126.70%。该结果表明高寒草地牧草内生细菌2018GH11具有良好的防病促生作用,开发潜力巨大。     

聚合酶链式反应扩增甘蔗钙调蛋白基因及其序列分析

从甘蔗茎顶端分生组织提取点ＲＮＡ,反转录合成ｃＤＮＡ第一条链,以此为模板,参考大麦钙调蛋白基因序列设计并合成５端和３端引物,ＰＣＲ扩增甘蔗钙调蛋白基因,与克隆载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）重组,转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１得到得组克隆。ＤＮＡ序列分析结果表明：甘蔗钙调蛋白基因同４５０个核甘酸组成,编码１４８个氨基酸;在核甘酸序列上与迄今知道的几种植物的钙调蛋白基因有很高的同源性,同源率在８０％以上,编码     

香蕉枯萎病病原菌海藻糖合成酶基因tps1

为了解tps1基因在尖镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间及与其他镰刀菌之间的差异,分析推测tps1基因与两生理小种之间的寄主选择性差异的关系,通过比对现有镰刀菌属的海藻糖合成酶基因序列,参照尖孢镰刀菌番茄专化型的tps1基因序列设计并合成引物,采用PCR和RT-PCR方法扩增了两个生理小种的tps1基因并测序进行比较分析,同时对香蕉与粉蕉苗诱导两个生理小种后的tps1基因表达量变化进行分析。结果表明,两个生理小种tps1基因全长均为1660 bp,开放阅读框均为1605 bp,编码535个氨基酸,基因序列间仅存在两个碱基位点的差异,编码蛋白间无差异;两生理小种的tps1基因序列与镰刀菌属其他种间存在较大的差异,经寄主诱导后的两个生理小种的tps1基因表达量呈现不同的变化。从tps1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列在两生理小种之间的差异性分析结果推测,两个生理小种寄主选择性差异与tps1基因并无明显对应关系,这为进一步研究tps1基因与病菌在无寄主下的长期生存的关系奠定了基础。     

鹅A-FABP基因内含子Ⅰ序列的分析研究

为了探讨鹅脂肪型脂肪酸结合蛋白(Adipocyte Fatty Acid-Binding Protein,A-FABP)基因内含子Ⅰ的序列长度、多态性及与其他物种的同源性。根据鹅A-FABP mRNA(AF472610)和鸡A-FABP基因组序列(AY675941)设计1对引物,扩增鹅A-FABP基因内含子Ⅰ序列;利用PCR-SSCP技术和序列比对,开展鹅A-FABP基因内含子Ⅰ的多态性研究。结果表明：鹅A-FABP基因内含子Ⅰ序列长为1473 bp,与其他12个物种序列比较,发现其与鸭的同源性达到94.42%,与鸡的同源性为81.82%。经SNPs检测发现,P2和P3扩增产物存在变异位点。遗传多态性分析表明,A、B两个等位基因的基因频率分别为0.597和0.403,多态信息含量(PIC)是0.365,基因型分布未偏离Hardy-Weinberg平衡状态(χ2＝0.020,P>0.05);D、E两个等位基因的基因频率分别为0.483和0.517,PIC是0.375,基因型分布偏离Hardy-Weinberg平衡状态(χ2＝6.782,0.01     

甘蔗葡聚糖酶ScBG1基因的电子克隆及序列分析

为了揭示甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的结构特点和功能特性,从而为该基因的研究和应用提供基础。本研究以水稻β-1,3-葡聚糖酶基因(U72255.1)为搜寻探针,运用电子克隆技术,获得一条甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为ScBG1,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该基因的cDNA序列全长为1842 bp,包含一个1488 bp完整的开放读码框,编码495个氨基酸残基,属于糖基水解酶第十七家族,为疏水性蛋白,含有信号肽。将ScBG1与其他植物种的β-1,3-葡聚糖酶基因进行序列比对,发现该基因具有保守和典型的葡聚糖酶结构域,碱基序列的保守性为45%~73%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础,也为甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的分子功能研究提供参考。