H9N2亚型禽流感流行分析及疫苗毒株的筛选

本研究旨在筛选新型免疫原性好、广谱的优秀 H9亚型禽流感病毒疫苗株。通过 H9N2分子流行病学调查对分离得到的37株禽流感 H9N2亚型病毒进行 HA 基因分子遗传进化及其关键位点分析,利用交叉 HI 效价及鸡胚中和试验分析毒株间毒力及其相关性,制备疫苗用毒株进行免疫攻毒保护试验。结果显示,从37株病毒中选出12株病毒作为代表,分为3个分支,同分支之间交叉 HI 效价及中和效价最高。HI 试验及鸡胚中和试验均显示同分支毒株间的相关系数高。免疫攻毒保护试验显示同分支疫苗株安全性高。表明我国禽流感 H9N2亚型情况复杂,且疫苗保护效果与疫苗株的抗原匹配性密切相关,生产多种分支 H9疫苗株联合更有利于控制 H9型禽流感,     

H9亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护研究

为评价H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护效果,将禽流感病毒HF株灭活疫苗和商品化鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗分别以0.3 mL/只接种21日龄SPF鸡,3周后采血测定HI抗体效价,并用2018年-2019年分离的4株H9亚型禽流感病毒分别进行攻毒。结果显示,免疫后21 d, HF株灭活疫苗免疫组HI抗体效价达到9.1 log2以上,商品化疫苗HI抗体效价几何平均值则为6.3 log2以内。4株H9亚型禽流感病毒流行毒株以10~(7.0)EID_(50)的剂量静脉攻毒后,HF株灭活疫苗免疫组可抵抗流行毒株的攻击,保护率为100%;而商品化疫苗对流行毒株的攻毒保护率仅为40%～60%。说明H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗具有较强的免疫原性,能使免疫鸡抵抗流行毒株的攻击。     

H9N2亚型禽流感疫苗株的筛选

为了筛选免疫原性更好的H9N2亚型禽流感病毒疫苗株。本研究在分析H9N2病毒HA基因遗传进化规律基础上,对预选的毒株进行血凝效价(HA)、鸡胚半数感染量(EID50)测定及交叉血凝抑制试验,筛选出疫苗用毒株进行免疫攻毒保护试验。结果显示,CK/AH/AJ3/15株HA效价达11 log2、EID50值为9.17 log10/0.1 mL,有很好的繁殖能力;对当前流行株的HI反应效价比疫苗株F/98高2-3个滴度;以CK/AH/AJ3/15株制作灭活疫苗,整体保护率达到97.5%,比F/98疫苗株的85%明显提高。表明CK/AH/AJ3/15株可以作为H9N2亚型禽流感新型疫苗株的候选株。     

H9亚型禽流感病毒HF株的分离鉴定和免疫原性评价

2015年,从安徽合肥某养鸡场分离出一株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）,命名为HF株。该毒株鸡胚半数感染量（EID₅₀）为10^9.17/0.1 mL,最小致死量的平均死亡时间（MDT）为87 h。对其HA基因分析发现,其氨基酸裂解位点为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV特征;HA基因的遗传进化分析结果表明,该分离株属于h9.4.2.5谱系,符合当前毒株流行趋势。将HF株与2006-2018年分离自全国各地的10株H9N2亚型AIV分离株同时制备灭活疫苗,免疫SPF鸡,制备阳性血清,通过交叉血凝抑制试验分析病毒抗原性,结果显示HF株与2014年之前毒株抗原相关性介于0.50~0.56之间,与2014年及之后毒株抗原相关性介于0.89~1.00之间,表明该分离株与2014年之后的流行毒株具有良好的抗原相关性。用0.2%甲醛灭活HF株病毒液,其HA效价在灭活前后未发生变化;用灭活抗原制备油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后21 d HI抗体效价几何平均值达到9.0log2以上,可使免疫鸡完全抵抗H9亚型AIV的感染,提供100%的攻毒保护。研究结果表明,HF株具有良好的免疫原性,可作为疫苗候选株用于H9N2亚型禽流感疫苗的研制。     

一株H9亚型禽流感病毒的分离鉴定及生物特性研究

2013年中国吉林某养鸡场发生疑似H9亚型禽流感疫情,采集该发病鸡场病料接种9日龄SPF鸡胚,分离得到一株病毒。经血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、测序分析,鉴定该毒株为H9亚型禽流感病毒(AIV)。对本试验分离株HA基因进行测序及序列分析,结果显示分离株HA基因的裂解位点为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的基因特征;HA肽链具有9个潜在糖基化位点,与近些年H9亚型AIV分离株的潜在糖基化位点相同;具有8个受体结合位点,其中234位受体结合位点由谷氨酰胺(Q)变异成苏氨酸(T);HA基因系统进化树结果显示本试验分离株属于欧亚进化分支,与中国最早分离株A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)亲缘关系较远,与2007年后中国H9亚型AIV主要流行分支的代表株A/Chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)亲缘关系较近。将该毒株制成油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后第21天免疫鸡血清抗体高达10log2,表明本试验分离株具有很好的免疫原性。     

水禽用H5亚型禽流感灭活疫苗对高致病性禽流感病毒流行毒株的免疫保护效果研究

为评价水禽用禽流感灭活疫苗(H5N2亚型,D7株)对2010年以后分离的高致病性禽流感病毒流行毒株的免疫保护效果,将该疫苗免疫3周龄SPF鸭后,21 d采血、分离血清测定HI抗体效价,同时用5株2010年以后分离的高致病性禽流感流行毒进行攻毒保护试验,攻毒后5d采集所有试验鸭喉头和泄殖腔拭子进行病毒分离.结果显示,该疫苗免疫SPF鸭21 d后的HI抗体效价的几何平均滴度达7.4log2,对5株高致病性禽流感病毒的攻击均可产生良好的免疫保护,并有效阻止病毒排泄.该疫苗的推广使用将对我国水禽高致病性禽流感的防控发挥重要作用.     

H9亚型禽流感病毒流行毒株交叉免疫攻毒保护试验

采用1998-2009年在河北、河南及山东分离的3株禽流感H9亚型流行毒株,分别制备灭活疫苗,免疫SPF鸡,免疫后21 d,采血测定HI抗体,然后用从上述3个地区及北京分离的共5株禽流感H9亚型流行毒株进行攻击,观察不同时期及地点分离的H9亚型流行毒株的交叉免疫攻毒保护效果。结果显示,用不同时期及地点的3个分离毒株所制备出的灭活疫苗免疫鸡后,各免疫组试验鸡H9亚型禽流感的HI抗体效价均明显上升,不同毒株灭活疫苗所诱导产生的HI抗体效价存在着不同程度的差异,用同源毒株作为抗原测定免疫组鸡的血清样品,可获得较高的HI抗体效价。攻毒试验结果证明,对不同时期及地点分离的禽流感H9亚型流行毒株间产生了较好的交叉保护力。用1998年分离的WD98株制备出的灭活疫苗对目前的流行毒株仍具有较好的保护效力。     

8株H9亚型禽流感病毒的分离鉴定与抗原交叉保护性分析

为了探讨河南省鹤壁市H9亚型禽流感病毒的流行情况及抗原的差异性,试验采用病毒分离鉴定及交叉攻毒免疫保护试验对8株H9亚型禽流感病毒进行了抗原差异性分析。结果表明:利用SPF鸡胚从疑似感染H9亚型禽流感病毒的病料中分离鉴定出8株病毒,这8株病毒诱导的SPF鸡产生的HI抗体效价基本相同,能抵抗不同毒株的攻击。说明河南省鹤壁市H9亚型禽流感病毒流行毒株间具有较好的交叉保护力。     

悬浮培养和鸡胚尿囊液抗原制备的H9亚型禽流感疫苗免疫效力比较试验

为了探讨悬浮培养和鸡胚尿囊液培养得到的H9亚型禽流感病毒(AIV)抗原制备的疫苗的免疫效力,试验用3株H9亚型AIV株分别接种微载体悬浮培养的MDCK细胞制备3种悬浮培养的细胞疫苗抗原,以3株H9亚型AIV株接种10日龄SPF鸡胚制备3种鸡胚尿囊液抗原,测定6种抗原液HA效价和鸡胚半数感染量(EID50);分别使用6种抗原液制备灭活疫苗,免疫21日龄SPF鸡,并在免疫后第21天采血测定HI抗体水平,采血后进行攻毒并在攻毒后第5天进行病毒分离试验。结果表明:两种方式制备的AIV抗原HA效价为7~9 lb,鸡胚半数感染量为1×106.9~7.9EID50,疫苗免疫后第21天用同源毒株作为工作抗原测定的免疫鸡HI效价差异不大,用异源毒株测定时有一定差异;两种方法得到的抗原制备的疫苗均能获得很好攻毒保护。     

2017—2018年华东地区H9亚型禽流感病毒分离毒株的抗原差异分析

为掌握华东地区H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的流行情况及变异程度,采集临床疑似病料和活禽交易市场家禽的棉拭子样品,通过鸡胚接种、HA和HI试验及RT-PCR等方法分离鉴定H9 AIV,对其中部分毒株进行测序和序列分析,筛选4个代表毒株免疫SPF鸡制备抗血清,利用交叉血凝抑制试验测定抗原差异性。结果如下:共分离鉴定出62株H9亚型禽流感病毒,分离率为2.02%(62/3 074)。对25株H9亚型禽流感病毒株序列分析发现,分离株属于h9.4.2.5谱系,并进一步细分为A和B亚系。 HA 基因裂解位点氨基酸为PSRSSR↓G,符合低致病性禽流感病毒的特征。与Y280代表株 HA 基因的推导氨基酸相比,分离株受体结合位点左侧臂全部变为NGLMGR。在抗原位点92位氨基酸出现R(64%)/K(36%)的变化。交叉血凝抑制试验结果表明分离株间的HI抗体滴度相差2~8 log2,可分为2类抗原型。因此,目前流行的H9亚型AIV发生了抗原变异,至少同时存在两种抗原型。