团头鲂对嗜水气单胞菌的免疫应答

从患有细菌性出血病的团头鲂内脏分离到嗜水气单胞菌,采用0.2%福尔马林25℃灭活24 h和0.5%福尔马林4℃灭活24 h两种不同方法制备疫苗作为抗原,于胸鳍基部注射免疫团头鲂.通过测定受免团头鲂血清中抗体凝集效价、血液中NBT阳性细胞数量、吞噬细胞活性以评估免疫效果.结果表明.两种方法制备的灭活菌苗均可刺激鱼体产生较强的免疫应答,而采用0.2%福尔马林灭活的免疫效果优于0.5%福尔马林灭活,但二者无显著差异.活菌攻毒的结果表明团头鲂对嗜水气单胞菌产生了较强的免疫能力.     

中华鳖嗜水气单胞菌灭活方法的研究

不同的温度、福尔马林浓度、灭活的时间以及灭活菌液的浓度均可影响中华鳖嗜水气单胞菌的灭活。本研究得到了菌液浓度为６０×１０８ｃｆｕ／ｍｌ时的９种灭活方法。通过琼脂双扩散试验对灭活菌液抗原性比较,认为２８℃、０．２％的福尔马林灭活２ｄ为鳖嗜水气单胞菌较理想的灭活方法。     

嗜水气单胞菌、爱德华氏菌灭活菌苗免疫保护及药物治疗试验

嗜水气单胞菌、爱德华氏菌培养物经甲醛灭活后,制成灭活油乳剂苗、灭活菌苗、饵料吸附型疫苗,免疫罗非鱼2周后,分别以嗜水气单胞菌、爱德华氏菌活菌液攻毒,结果显示,注射型疫苗均优于口服型,其中嗜水气单胞菌以腹腔注射0．1mL嗜水气单胞菌灭活菌苗＋0．3mL生理盐水的效果最佳,免疫保护率为85．0％;而爱德华氏菌以腹腔注射0．4mL灭活油乳剂苗效果最佳,免疫保护率为90．0％。两者的药物治疗试验结果显示,以氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、氟哌酸治疗罗非鱼嗜水气单胞菌病、爱德华氏菌病均有一定效果,对减少发病率及死亡率、控制病情具有较好作用,其中以氟苯尼考的疗效最佳,其用量为20mg／kgH2O。     

尼罗罗非鱼对嗜水气单胞菌的免疫反应

将嗜水气单胞菌用福尔马林灭活后,接种尼罗罗非鱼,测定其血清凝集抗体效价及攻毒后的免疫保护力。结果表明,灭活菌苗对尼罗罗非鱼有较强的免疫原性,免疫鱼具有很强的免疫保护力。小个体鱼的浸浴接种效果强于大个体。     

团头鲂细菌性败血症免疫研究

将温和气单胞菌(Aeromonas sobria)复壮，在28℃条件下加福尔马林灭活48h，制备成灭活苗。用该疫苗免疫团头鲂，取免疫后第10d，20d，30d的血清做凝集抗体试验，最高凝集抗体效价达1：32～128，对照组为1：4～8；免疫鱼的抗感染保护力达70％。     

斑点叉尾鮰暴发性败血症的免疫预防研究

通过试验确定了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)全菌苗的福尔马林安全灭活浓度、最佳灭活温度及时间,并选取最佳灭活方式,制备了全菌苗F-1、F-2和F-3。采用所得全菌苗免疫斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus),测定了其对斑点叉尾鮰的免疫原性。经注射接种28d后,受免斑点叉尾鮰血清中凝集抗体效价都有显著增加。受免斑点叉尾鮰血液白细胞吞噬活性的测定结果表明,3个免疫组的吞噬百分比和吞噬指数都显著地高于对照组。这表明,采用福尔马林灭活的全菌苗F-1、F-2和F-3,均能在28d内刺激斑点叉尾鮰产生较强的免疫应答。     

酵母β-葡聚糖对受免异育银鲫免疫应答的增强作用

在饲料中添加定量的酵母 β -葡聚糖 ,投喂经注射接种福尔马林灭活的嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila)菌苗的异育银鲫 (Carassiusauratusgibelio) 2 8d后 ,通过测定供试鱼的增重量、血清中凝集抗体效价、溶菌酶活性、谷丙转氨酶活性 (SGPT)、血清总蛋白含量、白细胞吞噬活性以及活菌攻毒后的免疫保护率 (RPS) ,探讨了酵母 β -葡聚糖对受免异育银鲫免疫应答的增强作用。结果表明 ,投喂添加 2 0 0 .0mg/ (kg·d)酵母 β -葡聚糖的饲料 ,不仅可以提高受免异育银鲫对灭活嗜水气单胞菌的免疫应答水平 ,增强抵抗嗜水气单胞菌人工感染的能力 ,而且还具有一定的促进生长和改善肝功能的作用。     

团头鲂细菌性败血症免疫研究

将温和气单胞菌(Aeromonas sobria)复壮,在28℃条件下加福尔马林灭活48 h,制备成灭活苗.用该疫苗免疫团头鲂,取免疫后第10 d,20 d,30 d的血清做凝集抗体试验,最高凝集抗体效价达1∶32～128,对照组为1∶4～8;免疫鱼的抗感染保护力达70%.     

嗜水气单胞菌疫苗用菌液培养条件及灭活方法的研究

研究嗜水气单胞菌的大量培养和灭活方法,为制备嗜水气单胞菌疫苗提供切实可行的方法.选取毒力较强菌株,按照培养温度、振荡与否、培养基的pH值、加入的营养源等不同条件培养菌液,分别检测其溶血价及OD值;再以不同温度、时间、甲醛浓度制成疫苗,检验其残菌数、溶血价及抗原性.结果表明,以pH为7.5、(φ)=1%胰蛋白胨肉汤在28℃、180 r/min振荡培养的菌液最佳;以(φ)=0.2%甲醛在28℃恒温培养箱灭活12 h的疫苗抗原性最强,无菌检验和安全性检验合格.     

体外药动模型中恩诺沙星对嗜水气单胞菌的药动及药效研究

为降低嗜水气单胞菌耐药菌株的产生速度,延长恩诺沙星在水产动物上的应用年限,通过建立体外模型的方法,研究恩诺沙星对嗜水气单胞菌的药动-药效(PK-PD)参数。在消除半衰期为100h的模型内,2MIC(最小抑菌浓度)的恩诺沙星对嗜水气单胞菌能够抑制6h,6h后细菌出现再生长;4、8和16MIC对嗜水气单胞菌能够起到持续的抑制作用。在消除半衰期为168h的模型内,2MIC的恩诺沙星对嗜水气单胞菌能够抑制6h,6h后细菌出现再生长;4、8和16MIC对嗜水气单胞菌能够起到持续的抑制作用。结果表明,当AUC0→24/MIC>75.24±13.24,Cmax/MIC>4.10±0.12时,恩诺沙星对嗜水气单胞菌能够起到持续的抑制作用。     

嗜水气单胞菌外毒素免疫血清的制备及其对中华鳖红底板病的防治效果

将致病性嗜水气单胞菌扩大培养后提纯外毒素,用灭活外毒素免疫大白兔,制备免疫血清,再用兔免疫血清防治鳖红底板病。结果表明：对攻毒后１ｄ的中华鳖用免疫血清进行治疗,其成活率为３７．５％,对免疫后攻毒的中华鳖的保护率大于７５％。     

嗜水气单胞菌外毒素免疫血清的制备及其对中华鳖红底板病的防治 …

将致病性嗜水气单胞菌扩大培养后提纯外毒素，用灭活外毒素免疫大白兔，制备免疫血清，再用兔免疫血清防治鳖红底板病。结果表明：对攻毒后１ｄ的中华鳖用免疫血清进行治疗，其成活率为３７．５％，对免疫后攻毒的中华鳖的保护率大于７５％。     

不同盐度下5种中草药对2种水产动物致病菌的抑菌效果比较

采用牛津杯法比较不同盐度(0、1%、2%、3%、4%)下五倍子、石榴皮、诃子、黄芩、乌梅5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果,测定了最小抑菌浓度。结果表明,5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌都有不同程度的抑菌效果,其中黄芩和五倍子抑菌作用较强,乌梅抑菌作用较差,而诃子和石榴皮的抑菌作用一般,但石榴皮对嗜水气单胞菌的抑菌作用较为明显。不同盐度下,5种中草药对这2种致病菌的最小抑菌浓度(MIC)有差异。高盐度时,5种中草药对迟缓爱德华氏菌的MIC较低,均≤25 mg/m L,抑菌效果较好;而低盐度时,各个中草药MIC均在25 mg/m L及以上,抑菌效果较差。在盐度为0时,5种中草药对嗜水气单胞菌的MIC最低,抑菌效果最好。     

鲤细菌性败血症的免疫研究

选取分离于鲤细菌性败血症病例的嗜水气单胞菌强毒力菌株进行复壮,于菌悬液中加入0.2%甲醛于28℃灭活12h制成灭活疫苗,对鲤进行免疫接种后,通过检测抗体,以确定鱼体对疫苗的应答强度。分别取注射免疫后第21,28,35,42天的血清做凝集试验,并于首免6周后做人工感染保护试验。结果抗体最高效价达到212,而对照组为0。受免组攻毒免疫保护率达90%,表明鱼体对嗜水气单胞菌灭活疫苗可以产生免疫应答,对鲤有一定的免疫保护作用。     

鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的原核表达、免疫保护及抗血浆杀菌作用研究

研究鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的免疫学功能,为相关疫苗开发奠定理论基础。采用生物信息学方法分析P5的理化性质;分子克隆构建P5表达菌株并确定其最佳诱导表达条件,包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化P5蛋白,并免疫小鼠制备P5抗血清;Western blotting检测抗血清特异性与效价,免疫酶联法模拟P5抗血清对嗜水气单胞菌的体外识别;P5抗血清被动免疫红鲫,攻毒以评价P5蛋白的免疫保护功能;Western blotting分析P5蛋白抵抗鱼血浆的杀菌作用。结果表明:P5蛋白在气单胞菌属间同源性较好,进化保守。成功克隆表达、纯化P5蛋白,其最佳表达条件为:诱导时菌液浓度OD_(600)=1.0,IPTG浓度0.5 mmol/L,32℃诱导8 h。Western blotting验证P5抗血清特异性较好,效价达到1∶1 600,ELISA显示P5抗血清与嗜水气单胞菌存在识别作用,表明P5蛋白具有较好的免疫原性与抗原性。被动免疫显示P5抗血清对红鲫的免疫保护率为显著性的56%,具有良好的免疫保护作用。Western blotting发现P5蛋白可通过表达下调有效抵抗鱼血浆的杀菌作用,表明其可能与细菌抗血浆杀菌有关。综上,嗜水气单胞菌外膜蛋白P5是一种保护性抗原,有望作为防治嗜水气单胞菌感染的疫苗候选成分。     

鱼用嗜水气单胞菌口服疫苗的免疫保护效应

目的：制备含嗜水气单胞菌被膜或全菌的PLG疫苗微粒。以草鱼为实验动物，研究疫苗微粒的免疫保护效应。方法：采用复乳挥发法制备PLG疫苗微粒，草鱼口服免疫在4周内进行3次（每次10mg微粒），用ELISA法测定血清和肠粘液的抗体变化，保护效应用细菌攻击实验检测。结果：获得被膜和全菌的PLG疫苗微粒，蛋白含量分别为2．31％，6．12％，2种疫苗微粒均可诱导血清及肠粘液抗体应答。腹腔接种20LD50嗜水气单胞菌后，被膜、全菌疫苗微粒组的存活率分别为46．7％和36.7％，相对存活率分别为42．9％和32．1％，接受空微粒的草鱼仅有6．7％的存活率。结论：被膜、全菌疫苗微粒对草鱼均有显著免疫保护效应。可作为预防嗜水气单胞菌感染的疫苗。     

中华鳖穿孔病的免疫预防研究

选择中华鳖毒力最强的嗜水气单胞菌Ｃ－３菌株和产碱假单胞菌Ｃ－２菌株,制成福尔马林灭活二联菌苗及Ｓｐａｎ白油佐剂菌苗,对中华鳖进行了注射免疫试验。通过检测血清中的凝集抗体产价,血液和脾脏中吞噬细胞的吞噬活性和测定强毒攻击的免疫保护率,证实了２种免疫原对中华鳖均具有较强的的免疫原性,免疫保护率达９０５以上。     

体外药动模型中诺氟沙星对嗜水气单胞菌的药动及药效研究

通过建立体外药动模型的方法,研究诺氟沙星对嗜水气单胞菌Aerom onas hydrophila的药动-药效（简称PK-PD）参数。结果表明：在消除半衰期为3.4 h的模型内,2M IC（最小抑菌浓度）、4M IC和8M IC的诺氟沙星对嗜水气单胞菌能够抑制4 h,4 h后细菌出现再生长,而16M IC的诺氟沙星对嗜水气单胞菌能够起到持续的抑制作用;在消除半衰期为77 h的模型内,2M IC的诺氟沙星对嗜水气单胞菌能够抑制4 h,4 h后细菌出现再生长,而4M IC、8M IC和16M IC对嗜水气单胞菌能够起到持续的抑制作用。消除半衰期为3.4 h的模型内,当AUC0→24 h/M IC（药时曲线下面积与最小抑菌浓度的比值）〉42.43±9.21,Cm ax/M IC（峰浓度与最小抑菌浓度的比值）〉15.78±0.22时,诺氟沙星对嗜水气单胞菌能够起到持续的抑制作用;消除半衰期为77 h的模型内,当AUC0→24 h/M IC〉41.87±10.16,Cm ax/M IC〉4.79±0.11时,诺氟沙星对嗜水气单胞菌能够起到持续的抑制作用。     

MGB探针实时定量PCR检测致病性嗜水气单胞菌

以嗜水气单胞菌气溶素（aerolysin）基因为待检靶基因,设计一对引物和一条MGB（Minor Groove Binder）探针,Aero基因探针5’端用FAM基团标记,3’端用TaqMan—MGB标记。建立并优化了检测嗜水气单胞菌荧光定量PCR方法,可检测的最低细菌数为1．25×10^0CFU/μl;试验中嗜水气单胞菌检测结果均为阳性,而非嗜水气单胞菌检测结果均为阴性;重复性试验中,批间差异小于5％,批内差异小于3％。试验结果显示,荧光定量PCR方法可对致病性嗜水气单胞菌株进行快速鉴定。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。     

中华鳖爆发性传染病研究——Ⅳ.不同生化类型嗜水气单胞菌aer基因的PCR比较

用PCR技术对 5 2株不同来源和不同毒力的鳖源嗜水气单胞菌的aer基因进行了比较和分析。结果表明 ,b、d、e和 g四种生化型的嗜水气单胞菌含有特异的 2 0 9bp片段 ,而c和f两种生化型和其他鳖源致病菌却呈阴性反应 ,显示并非所有的嗜水气单孢菌都有aer基因 (产生气溶素 )。