副猪嗜血杆菌的分离鉴定及自家灭活苗的研制

从病猪体内分离细菌,对分离菌株从形态、染色、培养特性、生化特性等方面进行鉴定;用纸片扩散法筛选敏感药物,实验室合成氢氧化铝胶佐剂,制备自家苗对其进行防制。试验结果表明,该分离菌为副猪嗜血杆菌,病猪确诊为副猪嗜血杆菌病,分离菌对头孢噻肟、丁胺卡那霉素、庆大霉素、头孢菌素高度敏感,用自家苗防制该病安全有效。结果提示,副猪嗜血杆菌病只有通过实验室分离鉴定才可确诊,临床应筛选敏感药物进行治疗,制备自家苗对预防该病有较好效果。     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定和药敏试验研究

从山东某繁育猪场送检的疑似病例中分离到4株革兰氏阴性细小杆菌,通过培养特性试验和生化试验初步诊断为副猪嗜血杆菌,根据副猪嗜血杆菌16S rRNA序列设计引物,进行PCR鉴定,结果表明4株分离菌株为副猪嗜血杆菌.对4株分离菌株进行小白鼠毒力试验和药敏试验,结果表明,4株分离菌能致死小白鼠,对头孢他啶,头孢噻呋、氧氟沙星、多西环素、环丙沙星敏感,对土霉素、链霉素、林可霉素抵抗.     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

副猪嗜血杆菌病又称为革拉瑟氏病,是由副猪嗜血杆菌引起的一种严重的全身性疾病,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征.近年来,全国各地都有关于副猪嗜血杆菌感染甚至是流行的报道,并且发病严重,死亡率高,造成巨大的经济损失.鉴于此,对地方菌株进行分离鉴定,显得十分必要.本试验首先从广东地区疑似患多发浆膜关节炎猪的病料中分离到4株疑似细菌,进行了细菌形态观察、培养特性和生化特鉴定,证实为副猪嗜血杆菌.药敏试验结果显示,分离菌株对头孢拉定、环丙沙星、恩诺沙星和菌必治等药物敏感.     

广西副猪嗜血杆菌病病原菌的分离鉴定与药敏试验

副猪嗜血杆菌病又称纤维素性浆膜炎和关节炎,其病原为副猪嗜血杆菌(H.parasuis,HPS),是一种革兰氏阴性短小杆菌,属于巴斯德菌科嗜血杆菌属[1].随着养猪业的发展,规模化养殖和饲养的高度密集化,以及呼吸道综合征等因素,使得该病流行日趋严重.近年来,我国由副猪嗜血杆菌引起猪多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜.笔者对广西规模化猪场的疑似副猪嗜血杆菌感染的病料进行了分离鉴定及药敏试验.现将结果报告如下.     

副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

从福建省龙岩市l例临床症状、病理剖检变化疑似副猪嗜血杆菌病的患病猪的关节液中分离到1株革兰氏染色阴性可疑菌株,经卫星现象、生化鉴定等实验室诊断,进一步以副猪嗜血杆菌的16S rRNA基因设计特异性引物进行PCR鉴定,确定该分离菌为副猪嗜血杆菌。药敏试验结果表明,分离株对环丙沙星、卡那霉素、强力霉素、氨苄西林、阿米卡星、庆大霉素药物敏感;对泰妙菌素、诺氟沙星有抵抗力。     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及中药药敏试验

从数例疑似副猪嗜血杆菌病猪的肺脏和心包积液中分离到3株革兰氏阴性细小杆菌,经涂片镜检、生化试验和PCR鉴定,确定分离的3株菌为副猪嗜血杆菌.中药药敏试验结果表明,副猪嗜血杆菌对金银花及其组成的复方敏感,且复方作用效果优于单方.     

副猪嗜血杆菌新疆株的分离及PCR鉴定

从新疆北疆6个规模化猪场的37例发病猪病料中分离到两株疑似副猪嗜血杆菌(HPs)。经形态染色镜检、培养特性、生化和部分生物学特性试验,初步鉴定为HPs。根据副猪嗜血杆菌特异性引物进行PCR扩增,结果均扩增出822 bp预期特异性条带,确定分离株为副猪嗜血杆菌。这是目前为止新疆地区首次分离到HPs。     

两株不同地区副猪嗜血杆菌的分离及分子生物学鉴定

本试验从浙江和河南部分地区的送检的疑似患多发浆膜炎与关节炎猪的病料中分离到2株疑似副猪嗜血杆菌,进行了细菌形态观察、培养特性和生化特性鉴定,根据已报道的副猪嗜血杆菌16SrRNA序列特异性引物进行PCR扩增,得到预期的822bp的基因片断,最终证实为副猪嗜血杆菌。     

副猪嗜血杆菌部分16S rRNA基因的克隆及序列分析

副猪嗜血杆菌(Haenophilus parasuis,Hps)为副猪嗜血杆菌病的病原体。目前,副猪嗜血杆菌地方分离株基因背景研究国内报道不多,试验针对临床分离的2株Hps进行16S rRNA基因片段的扩增、克隆、测序及同源性比较,以期在分子水平对副猪嗜血杆菌进行鉴定。1材料与方法1.1菌种和质粒副     

副猪嗜血杆菌云南本地株的分离及鉴定

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的主要危害猪的一种急性、热性传染病。本试验对疑似副猪嗜血杆菌感染病例病料进行细菌分离培养,对分离菌株进行生化试验鉴定,结果可见菌落有卫星现象,革兰氏阴性的细小杆菌,分离菌株能发酵葡萄糖、乳糖,产酸不产气,不发酵蔗糖、木糖、甘露醇,不产生靛基质,不分解尿素,不分解精氨酸,过氧化氢酶阳性,氧化酶阴性。证明分离菌株为副猪嗜血杆菌。     

副猪嗜血杆菌血清7型菌株毒力及耐药性分析

【目的】了解河南地区副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)血清7型流行菌株的毒力及耐药情况。【方法】以Hps血清7型参考菌株为对照,对6株Hps血清7型临床分离菌株进行16S rRNA基因扩增、序列分析、毒力基因检测、致病性试验和药敏试验研究。【结果】16S rRNA基因测序及相似性比对结果显示,菌株1436与参考菌株0007相似性为100%,菌株1565、1624与参考菌株0007相似性均为98.6%。系统发育树分析表明,菌株1436与参考菌株0007亲缘关系最近;菌株1624与参考菌株0007亲缘关系最远。6株临床菌株与参考菌株表现为2种毒力基因型,菌株均携带有vta1、vta2、vta3、wza、nanH、cdtA、cdtB、cdtC和espP2毒力基因,其中5株临床菌株还携带ompP2毒力基因。豚鼠致病性试验结果显示,临床菌株毒力较参考菌株表现出不同程度的增强,参考菌株不能感染豚鼠发病,未表现任何临床症状;临床菌株可感染豚鼠发病,表现出一定的临床症状,发病率为20%~40%,死亡率为0。参考菌株和临床菌株均对头孢他啶和头孢噻呋敏感,对强力霉素、氟苯尼考中介,对新霉素、卡那霉素、阿米卡星、红霉素、替米考星等耐药,且均表现出多重耐药现象。【结论】Hps血清7型临床菌株有一定的致病性,但毒力较弱,对头孢类药物敏感,有明显的多重耐药现象,临床上应注意对该血清型的防控。本研究为Hps血清7型流行病学、致病机制研究奠定了基础,为Hps血清7型的临床防控提供了参考依据。     

副猪嗜血杆菌aroA基因的克隆与序列分析及2种三重PCR检测方法的建立

本试验对分离的5株副猪嗜血杆菌进行了"卫星" 生长试验、生化鉴定和PCR检测。通过对aroA基因序列进行分析,发现这5株菌同标准菌株相比,其核苷酸序列相似性为96.3%~99.8%,氨基酸序列相似性为98.2%~99.5%。此外,还建立了分别针对副猪嗜血杆菌(Hps)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)及猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒的三重PCR检测方法;敏感性试验表明,三重PCR最低能检出Hps、PPV、PRV、PCV2的DNA分别为12、16、7.6和6.3 pg。     

Molecular Identification and Genetic Evolution Analysis of Haemophilus parasuis 16S rRNA Gene in Local Pig Origin

To study the molecular genetic evolution characteristics of Haemophilus parasuis(Hps), PCR was used to determine the 16S rRNA gene of the strain XY0501 isolated from local pigs in Henan province, and genetic evolution analysis was conducted. The results showed that the amplication of 16S rRNA of the isolate XY0501 was 822 bp, the nucleotide sequence similarity among the reference strains was 97.1% to 99.3%, and 99.3% with the strain serotype 5. The phylogenetic tree based on 16S rRNA revealed that the Hps isolate XY0501 from local pigs belonged to the same branch with reference strain serotype 5. The results identified that the Hps infection could cause severe clinical symptoms in pigs, but infection source need to be further investigation,in addition, 16S rRNA of Hps of different serotypes was conserved and no species difference.     

1株副猪嗜血杆菌血清4型的分离鉴定及耐药性分析

【目的】 阐明引起河南漯河某规模化猪场仔猪呼吸道症状的主要细菌性病原体及其生物学特性。【方法】 无菌采集发病仔猪的口鼻拭子及病死猪的胸腔积液及肺脏、肝脏、脾脏等组织器官,进行病原的PCR检测,并通过细菌分离培养、形态学观察、卫星试验、16S rDNA基因PCR扩增、系统进化树构建、多重PCR鉴定分离菌的血清型、致病性试验和药敏试验等对分离菌株进行生物学特性分析。【结果】 在含有V因子的BHI固体平板上生长出圆形、表面光滑湿润、无色透明的微小菌落,在不含V因子的培养基上不生长;分离菌株经革兰染色,镜下可见革兰阴性菌,多呈单个存在的球杆、长杆状;在金黄色葡萄球菌的培养物周围形成典型的"卫星菌落";16S rDNA基因序列分析表明,分离菌株与副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）处于同一分支,相似性>97%,亚型鉴定结果判定分离菌为Hps血清4型;将分离的Hps腹腔注射感染小鼠,可导致感染小鼠多个器官不同程度出血,以肺脏最为明显;高剂量感染可导致小鼠死亡。药敏试验发现,该菌株对四环素、环丙沙星、复方新诺明具有较强抗性,合理用药后,取得了良好的治疗效果。【结论】 试验成功分离出1株血清4型Hps,可致感染小鼠多个器官不同程度出血,对四环素、环丙沙星、复方新诺明耐药,研究结果为副猪嗜血杆菌病的临床诊断和治疗提供了理论依据。     

副猪嗜血杆菌sapA基因克隆与生物信息学分析

试验旨在克隆副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）sapA基因,并对其进行生物信息学分析,以期为sapA基因缺失疫苗的开发与应用提供理论依据。以71株临床菌株为研究对象,经PCR扩增鉴定其中的阳性菌株;将扩增得到的sapA基因片段与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经PCR和双酶切鉴定为阳性克隆后进行测序;用生物信息学软件进行核苷酸与氨基酸序列比对、系统进化树分析、蛋白二级和三级结构预测、疏水性预测、柔性区域位预测、B细胞抗原表位预测和Jameson-Wolf抗原指数预测。试验结果显示,在71株临床菌株中,有29株成功扩增出sapA基因,29株Hps的sapA基因核苷酸序列与已公布的SH0165菌株相似性为96.5%~98.8%,除H88菌株外,氨基酸序列与SH0165菌株相似性为98.9%~100%。sapA蛋白二级结构主要有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲,有13个亲水区、38个柔性区和23个B细胞潜在抗原表位。以上结果表明,Hps的sapA基因是一个保守基因,各菌株间核苷酸序列、氨基酸序列都有很高的相似性,sapA蛋白具有较强的抗原性。     

家养野猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

对江西省某家养野猪场临诊疑似副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,Hps）感染的病例进行细菌分离鉴定,PCR扩增分离菌株的16SrRNA并进行测序分析,并对分离菌进行细菌形态、生化鉴定和PCR鉴定及序列比对分析。结果显示,获得1株家养野猪源Hps分离株（命名为HPJXYZ01）,该分离株与国内外参考菌株序列之闻的同源性为93．1％～99．2％,与本实验室江西省家猪源分离株的同源性为84％～92．1％。结果表明,江西省家养野猪中存在Hps感染,分离株与国内外家猪源Hps间的16SrRNA序列差异不大,Hps16SrRNA核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。     

Cloning and Bioinformatics Analysis of espP Gene of Haemophilus parasuis

In order to evaluate whether Haemophilus parasuis espP gene could use as a vaccine candidate antigen or not,the espP gene was amplified by PCR using the specific primers that designed according to corresponding sequence getting form GenBank (accession No.:HAPS_1381) and then sent to sequence.After translating the DNA sequence into amino acid sequence,the signal peptide,hydrophilic region,linear B cell epitopes and 3D structure of Hps espP protein were predicted using multiple bioinformatics analysis.The results showed that the full length of Hps espP gene was 2 343 bp,encoding 781 aa.The first 23 aa were predicted as signal peptide.There were 12 hydrophilic regions and 12 B cell epitopes in the Hps espP protein.The 3D structure of C-terminal of the protein was consisted of a monomeric β-barrel containing 12 β-strands and a central pore.The study laid the foundation for further development of molecular vaccines based on espP protein against Hps infection.     

副猪嗜血杆菌丝氨酸蛋白酶基因的克隆及生物信息学分析

为研究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)丝氨酸蛋白酶(espP)作为疫苗候选抗原的可能性,根据GenBank中Hps espP基因(登录号:HAPS_1381)设计引物,以Hps血清11型(H456)菌株的DNA为模板,PCR扩增目的基因并测序。将该基因核苷酸序列翻译成氨基酸序列后,对Hps espP蛋白的信号肽、亲水性区域和B细胞抗原表位进行预测,并预测了该蛋白C端的3D结构。结果显示,Hps espP基因序列全长2 343 bp,共可编码781个氨基酸,其中氨基酸序列的1—23位预测为信号肽。Hps espP蛋白含有12个亲水性区域,并预测含有12个B淋巴细胞抗原表位。构建Hps espP蛋白3D结构显示,该蛋白C端是由12个β折叠层围成的桶状结构。本试验为进一步研制新型副猪嗜血杆菌Hps espP蛋白多肽疫苗奠定基础。     

Diagnosis and Pathogen Analysis of Mixed Infection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,Porcine Circovirus Type 2 and Haemophilus parasuis

To identify the causative agent of porcine respiratory disease complex (PRDC) occurred at a pig farm in Kaifeng city,Henan province,we identified the potential causative bacteria of the morbid nursing piglets by bacterial test and drug sensitivity test of the clinical samples (lung,liver and spleen),and detected the common potential pathogens causing PRDC diseases by PCR and RT-PCR assays,including porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),porcine circovirus type 2 (PCV2),swine influenza virus (SIV),pseudorabies virus (PRV),classical swine fever virus (CSFV) and Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp),and then sequcing and phylogenetic analysis of the structural gene of positive causative pathogens were carried out.The results showed that a Haemophilus parasuis (Hps) strain were isolated and identified by the observation of bacterial morphology and satellite phenomenon,and the sequence analysis of 16S rRNA gene.The drug sensitivity test showed that the Hps strain was sensitive to ampicillin,amoxicillin-clavulanic acid,ceftiofur and tetracycline.Meanwhile,PCR and RT-PCR assays indicated that all the samples were positive for PRRSV and PCV2,and named the involved strain as PRRSV/HN-2019 and PCV2/HN11-2019,respectively.Sequencing and phylogenetic analysis of the ORF5 gene of the newly identified PRRSV revealed that the PRRSV/HN-2019 strain was closely related to the NADC30-like strains and grouped into NADC30-like genotype clade.And cap gene of the newly identified PCV2 strain the PCV2/HN11-2019 strain was closely related to the PCV-2d strains and grouped into PCV-2d genotype clade.In conclusion,this study demonstrated that the morbid piglets were co-infected with PRRSV,PCV2 and Hps,which provided a basis for the development of effective control strategies in the pig farm.     

副猪嗜血杆菌寡肽结合蛋白（OPPA）的序列分析及分子结构模拟

通过研究副猪嗜血杆菌（Haemophiius parasuis,Hps）寡肽结合蛋白（Oligopeptide Binding Protein A,OppA）的生物学特性,为副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的研制奠定基础。本试验设计了1对特异性引物,应用PCR方法来扩增副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白的全基因序列,并进行克隆和测序。并且采用生物信息学方法,对Hps的oppA基因核苷酸及其对应氨基酸序列进行比对,选取其中的血清学5型分离株,对其OppA蛋白的分子结构、理化性质及结构功能域、蛋白质二级结构等重要参数进行了预测和分析,并对0ppA蛋白的三级结构进行了同源建模。PCR扩增出1638bp的目的片段;测序结果显示出不同血清型Hps之间oppA基因核苷酸序列相似性有一定的差异,而所对应的氨基酸序列却差异更小;OPPA蛋白的理论等电点为6．45,偏弱酸性;OppA蛋白的二级结构以α螺旋、不规则卷曲和8片层为主要构件;Hps的0ppA蛋白的氨基酸序列与鼠疫耶尔森氏菌2223蛋白的同源性为57．20％,以2223蛋白结构为模板成功构建了Hps的OppA蛋白三维结构分子模型,该OppA蛋白三维结构中与2223蛋白相似,也有3个结构域,在疏水口袋中有1条5肽结构。Hps的OppA蛋白的成功模建为OppA蛋白功能的深入研究提供了参考依据。