玻璃化冷冻对猪MⅡ期卵母细胞及其DNA的影响

研究旨在筛选最适合猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻的冷冻液,并探究玻璃化冷冻对猪MⅡ期卵母细胞DNA的影响。选取目前应用最多的7种冷冻液（分别为1、2、3、4、5、6、7组）,将MⅡ期卵母细胞随机分为8组,其中对照组直接进行孤雌激活,其余7组分别进行7种冷冻液处理后不经液氮冷冻直接于解冻液中解冻,解冻后进行孤雌激活,通过卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数的统计结果筛选出最适冷冻液;应用筛选的3种冷冻液,进行猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻,解冻后恢复2 h,统计卵母细胞形态正常率,孤雌激活44~48 h统计卵裂率;应用透射电子显微镜观察正常MⅡ期卵母细胞与玻璃化冷冻-复苏后的MⅡ期卵母细胞超微结构的变化;将猪MⅡ期卵母细胞随机分成对照组、冷冻液处理组和冷冻组,应用彗星电泳技术检测玻璃化冷冻对卵母细胞DNA的损伤。结果发现,与对照组相比,除5组卵裂率、1组囊胚率显著降低（P<0.05）外,其余各组卵裂率、囊胚率均差异不显著（P>0.05）;各组间囊胚细胞数均低于对照组,但差异均不显著（P>0.05）,3、6、7组卵裂率和囊胚率较高;玻璃化冷冻-解冻后,7组卵母细胞的形态正常率、卵裂率均显著低于3、6组（P<0.05）,6组卵裂率高于3组;MⅡ期卵母细胞移入预处理液中后可见明显的皱缩,移入冷冻液中迅速脱水,解冻后可见卵母细胞透明带断裂,胞质皱缩、分布不均;透射电子显微镜下,冷冻后猪MⅡ期卵母细胞透明带及细胞膜损伤,微绒毛严重损伤甚至消失,皮质颗粒排列在质膜下且数量减少,脂滴形态破坏、形成空泡,内质网与脂滴的联系损坏,线粒体肿胀、嵴不明显;彗星电泳发现,与对照组相比,冷冻液处理组头部DNA、尾部DNA和Olive尾矩值均差异不显著（P>0.05）,有彗星拖尾现象;冷冻组头部DNA损伤、尾部DNA损伤与Olive尾矩值均显著高于冷冻液处理组和对照组（P<0.05）,有明显彗星拖尾现象。结果表明,以二甲基亚砜（DMSO）和乙二醇（EG）为主要成分的冷冻液适于猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻;玻璃化冷冻对猪MⅡ期卵母细胞超微结构及其DNA存在一定损伤作用,其损伤机制有待进一步研究。     

猪卵母细胞在GV期与MⅡ期的冷冻保存效果比较研究

为比较猪卵母细胞在GV期与MⅡ期的冷冻保存效果,试验在这两个成熟阶段对其进行玻璃化冷冻,GV期卵母细胞解冻后培养至成熟,MⅡ期卵母细胞解冻后恢复2 h,然后采用免疫荧光标记、Western blotting和链霉蛋白酶溶解方法分别检测它们的皮质颗粒分布、CD9蛋白表达水平和透明带消化时间上的差异。结果表明,GV期卵母细胞在解冻后2 h的存活率显著低于MⅡ期卵母细胞（P<0.05）,但极体排出率与对照卵母细胞无明显差异（P>0.05）;在冷冻MⅡ期卵母细胞中,皮质颗粒的皮质区分布比例和CD9的蛋白表达水平显著下降（P<0.05）,但冷冻GV期卵母细胞经体外成熟后则无明显变化（P>0.05）;冷冻GV期与MⅡ期卵母细胞均不会影响透明带的消化时间（P>0.05）。由此可见,猪卵母细胞在GV期的冷冻存活率虽然较MⅡ期低,但其体外成熟后极体排出率、皮质颗粒分布和CD9蛋白表达水平均未受到冷冻的影响。     

甘氨酸对水貂GV期卵母细胞冷冻保存效率的影响

试验旨在探究玻璃化冷冻及培养过程中添加甘氨酸（glycine，Gly）对水貂GV期卵母细胞冷冻解冻后存活率、核发育、线粒体和皮质颗粒分布的影响。试验分为3组：对照组（没有进行冷冻处理）、冷冻组和Gly添加处理组（1 mmol/L Gly）。对玻璃化冷冻解冻后的水貂GV期卵母细胞分别进行平衡恢复3 h和体外成熟培养，采用免疫荧光标记法检测各组GV期卵母细胞线粒体分布的差异及MⅡ期皮质颗粒分布的变化。结果显示，Gly添加处理组卵母细胞在解冻后3 h的存活率与冷冻组相比差异不显著（P>0.05），但显著低于对照组（P<0.05）；Gly添加处理组卵母细胞的减数分裂恢复率显著高于冷冻组（P<0.05），但与对照组相比差异不显著（P>0.05）。免疫荧光结果显示，Gly添加处理组的GV期卵母细胞线粒体正常分布率显著高于冷冻组（P<0.05），但Gly添加处理组和冷冻组的GV期卵母细胞线粒体正常分布率均显著低于对照组（P<0.05）。皮质颗粒分布结果显示，水貂GV期卵母细胞在冷冻后体外成熟培养至MⅡ期时，Gly添加处理组皮质颗粒的正常皮质区分布比例显著高于冷冻组（P<0.05），但Gly添加处理组与冷冻组的正常皮质区分布比例均显著低于对照组（P<0.05）。结果表明，添加Gly可以提高冻融后水貂卵母细胞的减数分裂恢复率，降低冷冻对其线粒体及皮质颗粒的损失。     

甘氨酸对水貂GV期卵母细胞冷冻保存效率的影响

试验旨在探究玻璃化冷冻及培养过程中添加甘氨酸(glycine,Gly)对水貂GV期卵母细胞冷冻解冻后存活率、核发育、线粒体和皮质颗粒分布的影响。试验分为3组:对照组(没有进行冷冻处理)、冷冻组和Gly添加处理组(1 mmol/L Gly)。对玻璃化冷冻解冻后的水貂GV期卵母细胞分别进行平衡恢复3 h和体外成熟培养,采用免疫荧光标记法检测各组GV期卵母细胞线粒体分布的差异及MⅡ期皮质颗粒分布的变化。结果显示,Gly添加处理组卵母细胞在解冻后3 h的存活率与冷冻组相比差异不显著(P0.05),但显著低于对照组(P0.05);Gly添加处理组卵母细胞的减数分裂恢复率显著高于冷冻组(P0.05),但与对照组相比差异不显著(P0.05)。免疫荧光结果显示,Gly添加处理组的GV期卵母细胞线粒体正常分布率显著高于冷冻组(P0.05),但Gly添加处理组和冷冻组的GV期卵母细胞线粒体正常分布率均显著低于对照组(P0.05)。皮质颗粒分布结果显示,水貂GV期卵母细胞在冷冻后体外成熟培养至MⅡ期时,Gly添加处理组皮质颗粒的正常皮质区分布比例显著高于冷冻组(P0.05),但Gly添加处理组与冷冻组的正常皮质区分布比例均显著低于对照组(P0.05)。结果表明,添加Gly可以提高冻融后水貂卵母细胞的减数分裂恢复率,降低冷冻对其线粒体及皮质颗粒的损失。     

抗冷冻蛋白Ⅲ对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞线粒体的影响

【目的】探索抗冷冻蛋白Ⅲ(antifreeze proteinⅢ,AFPⅢ)对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞线粒体的保护作用。【方法】以5～8周龄昆明雌性小鼠为试验材料,将收集的小鼠MⅡ期卵母细胞随机分为空白对照组、冷冻对照组(经过玻璃化冷冻-解冻过程)和AFPⅢ添加组(在冷冻平衡液及冷冻液中均添加500 ng/mL AFPⅢ),利用线粒体绿色荧光探针(Mito-Tracker green, MTG)检测线粒体分布及含量,JC-1荧光染色检测线粒体膜电位,溶酶体红色荧光探针(Lyso-Tracker red, LTR)检测线粒体与溶酶体共定位,二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)检测活性氧(ROS)水平,ATP Assay Kit检测线粒体ATP含量。【结果】与空白对照组相比,玻璃化冷冻后小鼠卵母细胞的线粒体含量显著降低,部分线粒体呈现异常的散点状分布,且线粒体-溶酶体共定位情况明显增多,线粒体膜电位显著降低(P<0.05);同冷冻对照组相比,AFPⅢ添加组的小鼠卵母细胞线粒体含量显著升高,异常分布的线粒体和线粒体-溶酶体共定位情况减少,线粒体膜电位显著升高(P<0.05)。与空白对...     

钌红对玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体Ca2+的调控研究

玻璃化冷冻会严重损伤哺乳动物卵母细胞的线粒体功能,进而极大地限制了其解冻后的发育能力。为此,本试验设置3个钌红（RR）处理组,即牛卵母细胞用含0.5、1、2 μmol／L RR的玻璃化冷冻液进行冷冻,解冻后放入含0.5、1、2 μmol／L RR的体外成熟液中继续培养0.5 h,同时,新鲜卵母细胞一部分不进行冷冻,一部分用不含RR的冷冻液进行玻璃化冷冻,分别作为新鲜对照组和玻璃化冷冻对照组,然后共检测5组牛卵母细胞线粒体Ca²⁺水平、ATP含量及孤雌激活后胚胎的发育能力,进而研究RR对玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体Ca²⁺水平的调控作用。结果显示：①玻璃化冷冻显著提高了牛卵母细胞中线粒体Ca²⁺水平（P＜0.05）,而2 μmol／L RR处理组线粒体Ca²⁺水平显著低于冷冻对照组（P＜0.05）,但与新鲜组相比无显著差异（P＞0.05）;②玻璃化冷冻显著降低了牛卵母细胞中ATP含量（P＜0.05）,2 μmol／L RR处理组卵母细胞中ATP含量显著高于冷冻对照组及0.5、1 μmol/L RR处理组（P＜0.05）;③玻璃化冷冻对照组卵裂率、囊胚率显著低于新鲜对照组（P＜0.05）,1 μmol／L处理组卵裂率、囊胚率与新鲜对照组相比无显著差异（P＞0.05）。综上所述,RR处理能显著抑制解冻后牛卵母细胞线粒体Ca²⁺流入,保护线粒体功能,提高其发育能力。本试验结果为正向调控玻璃化冷冻卵母细胞线粒体Ca²⁺水平,进而提高其发育能力,促进玻璃化冷冻卵母细胞的广泛应用提供了参考依据。     

云岭山羊卵母细胞玻璃化冷冻的研究

试验以屠宰场云岭黑山羊卵巢卵母细胞为材料,研究其玻璃化冷冻的效果。试验中选用20% EG+20% DMSO为冷冻液、冷冻环为载体,以20 s、40 s玻璃化时间冷冻GV和MⅡ期的卵母细胞。结果表明,GV期卵母细胞的形态正常率、成熟率和卵裂率都很低,且解冻成熟培养后冷冻组的成熟率和卵裂率极显著低于对照组(P<0.01)。而MⅡ期卵母细胞冷冻效果较好,毒性试验组和冷冻组形态正常率分别为91.1%和83.3%,明显高于GV期;孤雌激活后毒性组卵裂率与对照组无显著性差异(P>0.05),冷冻组的卵裂率显著低于对照组(P<0.05)。用20 s、40 s玻璃化时间冷冻的卵母细胞解冻后GV和MⅡ期各组均无显著差异。根据试验结果得出在冷冻保存中最好冷冻MⅡ期的卵母细胞,以便提高后期的卵裂率和囊胚率;卵母细胞玻璃化时间在40 s内均不影响卵母细胞的活力和发育潜力。     

冷冻保护剂和细胞松弛素B对猪MⅡ期卵母细胞冷冻效率的影响

为了评价冷冻保护剂和离心处理对猪MⅡ期卵母细胞冷冻效率的影响,本试验研究了2种不同冷冻保护剂(乙二醇、二甲基亚砜和蔗糖混合物,EDS;乙二醇、丙二醇和蔗糖混合物,EPS)对猪MⅡ期卵母细胞冷冻效率的影响,以及细胞松弛素B和离心极化处理对猪MⅡ期卵母细胞冷冻效率的影响。结果表明:用EPS和EDS作为猪MⅡ期卵母细胞冷冻保护剂,冻融后其成活率差异并不显著。用不同浓度CB处理猪MⅡ期卵母细胞,7.5μg/mL的处理组冻融后成活率显著高于对照组(P<0.05)。猪MⅡ期卵母细胞经7.5μg/mL CB和离心极化双重处理,冻融后成活率显著高于CB单处理组和对照组,且3组间差异显著(P<0.05)。表明CB和离心极化处理都能改善MⅡ期猪卵母细胞冷冻效率,但它们作用机制还有待于进一步研究。     

超低温冷冻对牛卵母细胞组蛋白乙酰化和膜蛋白CD9表达的影响

本试验旨在探讨玻璃化冷冻对牛体外成熟卵母细胞(MⅡ期)组蛋白乙酰化和膜蛋白CD9表达的影响。牛MⅡ期卵母细胞采用OPS法冷冻,即卵母细胞于10%EG+10%DMSO溶液中预处理30s,然后再移入玻璃化溶液EDFSF30中处理25s,以OPS为承载器投入液氮中。毒性组卵母细胞未投入液氮,其他过程与冷冻组相同,新鲜牛MⅡ期卵母细胞为对照组。卵母细胞解冻后,利用免疫荧光染色法检测存活细胞DNA组蛋白乙酰化;qRT-PCR和Western blot检测CD9mRNA蛋白的表达。结果表明:冷冻组卵母细胞形态正常率(93.8%)和存活率(92.7%)显著低于毒性组(100.0%,97.2%)和对照组(100.0%,98.5%)(P<0.05),而毒性组与对照组之间无显著差异。超低温冷冻后,卵母细胞DNA组蛋白乙酰化水平显著上升(P<0.05),CD9mRNA与蛋白表达显著降低(P<0.05)。以上显示,玻璃化冷冻不但降低了牛体外成熟卵母细胞的存活率,而且改变了DNA组蛋白乙酰化和膜蛋白CD9表达水平。     

钌红对玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体Ca~(2+)的调控研究

玻璃化冷冻会严重损伤哺乳动物卵母细胞的线粒体功能,进而极大地限制了其解冻后的发育能力。为此,本试验设置3个钌红(RR)处理组,即牛卵母细胞用含0.5、1、2μmol/L RR的玻璃化冷冻液进行冷冻,解冻后放入含0.5、1、2μmol/L RR的体外成熟液中继续培养0.5h,同时,新鲜卵母细胞一部分不进行冷冻,一部分用不含RR的冷冻液进行玻璃化冷冻,分别作为新鲜对照组和玻璃化冷冻对照组,然后共检测5组牛卵母细胞线粒体Ca~(2+)水平、ATP含量及孤雌激活后胚胎的发育能力,进而研究RR对玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体Ca~(2+)水平的调控作用。结果显示:(1)玻璃化冷冻显著提高了牛卵母细胞中线粒体Ca~(2+)水平(P0.05),而2μmol/L RR处理组线粒体Ca~(2+)水平显著低于冷冻对照组(P0.05),但与新鲜组相比无显著差异(P0.05);(2)玻璃化冷冻显著降低了牛卵母细胞中ATP含量(P0.05),2μmol/L RR处理组卵母细胞中ATP含量显著高于冷冻对照组及0.5、1μmol/L RR处理组(P0.05);(3)玻璃化冷冻对照组卵裂率、囊胚率显著低于新鲜对照组(P0.05),1μmol/L处理组卵裂率、囊胚率与新鲜对照组相比无显著差异(P0.05)。综上所述,RR处理能显著抑制解冻后牛卵母细胞线粒体Ca~(2+)流入,保护线粒体功能,提高其发育能力。本试验结果为正向调控玻璃化冷冻卵母细胞线粒体Ca~(2+)水平,进而提高其发育能力,促进玻璃化冷冻卵母细胞的广泛应用提供了参考依据。     

2-氨基乙基联苯基硼酸酯对玻璃化冷冻牛成熟卵母细胞发育能力的影响

【目的】研究内质网IP3受体（IP3R）抑制剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2-APB）对玻璃化冷冻-解冻牛MⅡ期卵母细胞发育能力的影响。【方法】将体外成熟24 h的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）用0.1%透明质酸酶消化去除卵丘颗粒细胞，获得的卵母细胞分为对照组和2-APB组，采用OPS法进行玻璃化冷冻，对照组直接进行玻璃化冷冻，2-APB组在玻璃化冷冻前先用10 μmol/L 2-APB预处理10 min。2 d后解冻卵母细胞，统计解冻后（0 h）及恢复培养2 h时卵母细胞的存活率，用FITC-PNA荧光探针检测恢复培养2 h时卵母细胞皮质颗粒（CG）的分布，用2'，7'-DCHFDA和Cell Tracker Blue CMF2HC分别检测胞内活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）含量。将成熟培养24 h未冷冻卵母细胞（Fresh组），与解冻后恢复2 h的对照组和2-APB组卵母细胞同时进行孤雌激活，于培养的第2、7天分别统计孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率。【结果】与对照组相比，2-APB组冷冻-解冻卵母细胞0和2 h的存活率均显著增加（P＜0.05）；2-APB组皮质颗粒皮质区分布比例显著提高（P＜0.05），损伤型分布比例显著降低（P＜0.05）；2-APB组卵母细胞内GSH含量显著增加（P＜0.05），ROS含量显著降低（P＜0.05）；2-APB组卵母细胞孤雌激活胚胎的卵裂率、囊胚率均显著增加（P＜0.05），且与Fresh组无显著差异（P＞0.05）。【结论】2-APB预处理可通过增加卵母细胞内GSH含量，降低卵母细胞皮质颗粒损伤型分布比例和胞内ROS含量，提高玻璃化冷冻保存牛MⅡ期卵母细胞质量及早期胚胎发育能力。     

纽胞松弛素B(CB)对水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的影响

研究主要探讨冷冻前细胞松弛素B(CB)预处理水牛M Ⅱ期卵母细胞对其冷冻效果的影响.以水牛M Ⅱ期的卵母细胞为材料,通过玻璃毛细管(GMP)和玻璃化冷冻液EDS33(16.5%EG 16.5%DMSO Sucrose)对水牛M Ⅱ期的卵母细胞进行两步法玻璃化冷冻保存,即卵母细胞首先放入预平衡液(7.5%EG 7.5%DMSO Sucrose)中平衡3 min,然后再移入玻璃化冷冻液中30 s后装管直接投入液氮.冷冻前卵母细胞随机分为2组,一组用7.5μg/mL CB预处理30 min,另一组未用CB预处理作对照组,然后都冷冻保存.解冻是在蔗糖浓度逐渐降低的解冻液中进行的.解冻后存活的卵母细胞进行孤雌激活,以分裂率和囊胚发育率作为评定卵母细胞冷冻效果的指标.结果发现,GMP组和GMP CB组卵母细胞解冻后的存活率(88.89%、94.20%)和培养后发育到囊胚的比率(8.82%、14.55%)差异均不显著(P＞0.05),但GMP组和GMP CB组存活卵母细胞激活后的分裂率差异显著(32.69%、55.56%,P＜0.05),所以细胞松弛素B预处理可以提高GMP冷冻卵母细胞的发育能力.     

细胞松弛素B对绵羊GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响

本试验通过玻璃化冷冻前细胞松弛素B(CB)预处理来分析CB对绵羊GV期卵母细胞玻璃化冷冻/解冻后发育潜力的影响。分别从细胞毒性检测、冷冻检测和CB不同浓度（6.0、7.5和9.0 μg/ml）处理3个方面进行试验。试验结果表明毒性检验中CB处理组和未处理组卵母细胞的成熟率都显著低于对照组(P<0.05)，但相互之间差异不显著；玻璃化冷冻后，卵母细胞成熟率显著低于未冷冻组(P<0.05)，玻璃化冷冻CB处理组和未处理组卵母细胞体外成熟培养后成熟率之间差异不显著(P>0.05)；不同CB浓度处理后9.0 μg/ml组卵母细胞的成熟率显著高于对照组（P<0.05）。     

添加HA纳米颗粒对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的影响

为了探究羟基磷灰石(HA)纳米颗粒对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响，试验以牛卵巢中GV期卵母细胞作为试验材料，将不同粒径的HA纳米颗粒添加到玻璃化冷冻液中，进行超声分散检测。首先，以卵母细胞存活率和成熟率为指标，将0、0.01%、0.05%、0.1%HA纳米颗粒分别添加到玻璃化冷冻液Ⅰ(VSⅠ)和玻璃化冷冻液Ⅱ(VSⅡ)中，不经冷冻直接进行毒性测试；然后，以形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率为指标测定卵母细胞玻璃化冷冻后的发育能力；最后检测含有0.05%HA纳米颗粒的VSⅡ对冷冻后卵母细胞活性氧水平和线粒体膜电位水平的影响。结果表明：不同浓度HA纳米颗粒对牛GV期卵母细胞均无明显毒性；VSⅡ+0.05%HA纳米颗粒组卵母细胞冷冻后的形态正常率、成熟率、卵裂率、囊胚率显著高于VSⅠ+0.05%HA纳米颗粒组(P<0.05);VSⅡ+0.05%HA纳米颗粒组卵母细胞的活性氧水平显著低于VSⅡ组(P<0.05);VSⅡ+0.05%HA纳米颗粒组卵母细胞的线粒体膜电位水平显著高于VSⅡ组(P<0.05)。说明在VSⅡ中加入0.05%HA纳米颗粒能显著降低牛GV期卵母细胞...     

海藻糖对牛未成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响

[目的] 研究胞外冷冻保护剂海藻糖对玻璃化冷冻-解冻后牛未成熟卵母细胞形态、活性线粒体分布和核成熟的影响。[方法] 将未成熟卵母细胞随机分为新鲜组、不同浓度海藻糖（0.25、0.5和1 mol/L）组和0.5 mol/L蔗糖组共5组。新鲜组作为玻璃化冷冻的对照组,海藻糖和蔗糖组均采用两步法进行玻璃化冷冻和解冻处理。在冷冻的第1步不添加海藻糖和蔗糖,在冷冻的第2步和解冻的第1步分别添加对应浓度的海藻糖和蔗糖,在解冻的第2步海藻糖和蔗糖浓度均减半。解冻后,统计卵母细胞形态正常率;用JC-1染色检测卵母细胞的活性线粒体分布区域和荧光强度;体外成熟培养24 h后,统计卵母细胞的核成熟率。[结果] 玻璃化冷冻组卵母细胞的形态正常率和核成熟率均显著低于新鲜组卵母细胞（P<0.05）,0.5 mol/L海藻糖组卵母细胞形态正常率和核成熟率均显著高于0.5 mol/L蔗糖组及0.25和1 mol/L海藻糖组（P<0.05）;0.5 mol/L海藻糖组卵母细胞的活性线粒体均匀分布在细胞膜内侧区域,在绿光和蓝光下分别呈现强的红色荧光和黄绿色荧光,且荧光强度高于其他玻璃化冷冻组卵母细胞,但仍低于新鲜组卵母细胞;0.25 mol/L海藻糖组卵母细胞的活性线粒体分布区域少于、荧光强度低于0.5 mol/L海藻糖组,蓝光下其荧光为绿色并呈现不连续的散点分布,0.5 mol/L蔗糖组和1 mol/L海藻糖组卵母细胞活性线粒体分布区域极少,蓝光下其荧光为暗绿色。[结论] 0.5 mol/L海藻糖是进行牛未成熟卵母细胞玻璃化冷冻的最佳浓度。     

小鼠卵母细胞冷冻技术研究

采用PBS作为冷冻基础液,分别用甘油和二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护液,在程序化冷冻保存和玻璃化冷冻保存条件下,研究小鼠生发泡期(GV期)卵母细胞的抗冻能力。结果表明,2种冷冻方法对小鼠GV期卵母细胞解冻后形态正常率和存活率无显著影响(P>0.05)。冷冻保护剂种类对小鼠GV期卵母细胞解冻后形态正常率无显著影响(P>0.05);但对存活率有显著影响,玻璃化冷冻采用二甲基亚砜作为冷冻保护液效果极显著优于甘油(P<0.01)。以冷冻效果较好的二甲基亚砜作为冷冻保护液,采用玻璃化冷冻不同发育阶段(GV期和MⅡ期)的小鼠卵母细胞,解冻后形态正常率无显著差异(P>0.05),但存活率GV期要显著优于MⅡ期卵母细胞(P<0.05)。     

玻璃化冻存对驴卵母细胞超微结构的影响

试验旨在探究玻璃化冷冻对驴卵母细胞发育的影响，寻求驴卵母细胞冷冻的最佳条件。通过对不同发育时期的驴卵母细胞进行玻璃化冷冻，冷冻复苏后分别进行成熟培养和孤雌激活，并对GV期未冷冻组（对照组）、GV期冷冻组、IVM-M Ⅱ冷冻组卵母细胞微丝和线粒体超微结构进行免疫荧光标记，统计冷冻复苏后卵母细胞形态正常率、成熟率、孤雌激活卵裂率、超微结构正常率。结果表明，GV期冷冻组卵母细胞的形态正常率与GV期未冷冻组（对照组）间无显著差异（P>0.05），成熟率和卵裂率均显著低于对照组（P<0.05）；IVM-M Ⅱ冷冻组的卵裂率显著低于对照组（P<0.05），且卵裂后细胞发育受到阻滞。冷冻组微丝在皮质区分布明显减少的卵母细胞数目增多，冷冻组卵母细胞的线粒体数量明显低于对照组，由此可以说明冷冻对卵母细胞超微结构有损伤，从而导致复苏后成熟率下降，影响卵母细胞的受精和体外发育，且GV期冷冻组较IVM-M Ⅱ冷冻组在微丝与线粒体结构上有较小损伤，发育状态较好。     

甲基-β-环糊精载胆固醇对GV期猪卵母细胞冻融后体外成熟及其受精能力的影响

本实验旨在探究甲基-β-环糊精载胆固醇(CLC)对GV期猪卵母细胞冻融后体外成熟培养后成熟率、凋亡蛋白表达、透明带硬化时间及精-卵结合能力的影响。采用0(对照)、0.5、5、10 mg/mL CLC进行处理,共4组,采用Western blot方法分析GV期猪卵母细胞冻融体外成熟培养后凋亡蛋白的表达量。通过Hoechst染色方法检测不同组别的精卵结合能力。结果表明:5 mg/mL CLC处理组GV期冻融的猪卵母细胞体外成熟率高于对照组和0.5 mg/mL CLC处理组(P<0.05),但与10 mg/mL CLC处理组相比差异不显著;与对照组和0.5 mg/mL处理组相比,5 mg/mL CLC处理组显著降低了GV期冻融的猪卵母细胞体外成熟培养后Cleaved Caspase-3蛋白表达量(P<0.05),但与10 mg/mL CLC处理组差异不显著;与对照组和0.5、10 mg/mL CLC处理组相比,5 mg/mL CLC处理组减少了GV期冻融的猪卵母细胞体外成熟培养后透明带硬化时间(P<0.05);与对照组和0.5、10 mg/mL处理组相比,5 mg/mL CLC处理组提高了GV期冻融的猪卵母细胞体外成熟培养后精-卵结合能力(P<0.05)。综上表明,在玻璃化冷冻液中添加5 mg/mL CLC可显著减少GV期猪卵母细胞在冷冻保存过程中受到的低温损伤。     

细胞松驰素B（CB）对水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的影响

研究主要探讨冷冻前细胞松弛素B（CB）预处理水牛MⅡ期卵母细胞对其冷冻效果的影响。以水牛MⅡ期的卵母细胞为材料，通过玻璃毛细管（GMP）和玻璃化冷冻液EDS33（16．5％EG＋16．5％DMSO＋Sucrose）对水牛MⅡ期的卵母细胞进行两步法玻璃化冷冻保存，即卵母细胞首先放入预平衡液（7．5％EG＋7．5％DMSO＋Sucrose）中平衡3min，然后再移入玻璃化冷冻液中30s后装管直接投入液氮。冷冻前卵母细胞随机分为2组，一组用7．5μg／mLCB预处理30min，另一组未用CB预处理作对照组。然后都冷冻保存。解冻是在蔗糖浓度逐渐降低的解冻液中进行的。解冻后存活的卵母细胞进行孤雌激活，以分裂率和囊胚发育率作为评定卵母细胞冷冻效果的指标。结果发现，GMP组和GMP＋CB组卵母细胞解冻后的存活率（88．89％、94．20％）和培养后发育到囊胚的比率（8．82％、14．55％）差异均不显著（P〉0．05），但GMP组和GMP＋CB组存活卵母细胞激活后的分裂率差异显著（32．69％、55．56％，P〈0．05），所以细胞松弛素B预处理可以提高GMP冷冻卵母细胞的发育能力。．     

抑制UCHL1对猪卵母细胞体外成熟、透明带泛素化及多精入卵的影响

试验旨在研究抑制泛素羧基末端水解酶-1（UCHL1）对猪卵母细胞体外成熟、透明带泛素化及多精入卵的影响。利用DAPI染色、Hoechst染色及SDS-PAGE等方法检测猪卵母细胞体外成熟率、透明带泛素化水平及多精入卵等情况。结果表明,添加不同浓度UCHL1抑制剂（10、20、25、30 μmol/L,二甲基亚砜（DMSO）及对照组）体外培养猪卵母细胞46 h后,对照组成熟率为86.22%,而30 μmol/L UCHL1抑制剂组的成熟率为15.30%,且各处理组间成熟率差异显著（P<0.05）;经Western blotting检测,各处理组的透明带在约61、80、106 ku处均发生不同程度的泛素标记,通过灰度值分析差异显著（P<0.05）;进行体外受精试验后,发现对照组透明带精子黏附数最多,精子入卵数较少,添加30 μmol/L UCHL1抑制剂组的透明带精子黏附数最少,几乎没有精子入卵。结果显示,UCHL1抑制剂对猪卵母细胞的体外成熟有一定影响,随着UCHL1抑制剂浓度的增加,透明带发生泛素化的程度逐渐降低,且UCHL1可调节透明带精子黏附及多精入卵。