楸子S6PDH基因启动子活性鉴定

利用同源PCR技术从楸子(Malus prunifolia)基因组DNA中扩增得到6-磷酸山梨醇脱氢酶(Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)基因的启动子并命名为Mp-S-P。对启动子序列的顺式作用元件进行预测分析发现,Mp-S-P序列中除了含有植物启动子的基本结构元件外,还有多个与胁迫和激素诱导相关的元件。以β-葡萄糖苷酸酶(beta-glucuronidase,GUS)作为报告基因,构建含有pMp-S-P-GUS的融合表达载体并通过根癌农杆菌瞬时转化烟草叶片,然后分析该启动子对不同外界条件的响应。结果表明:低温、水杨酸和赤霉素处理可以提高该启动子的活性,而避光、脱落酸和茉莉酸甲酯可以降低该启动子的活性。     

紫苏RAS基因启动子的克隆及序列分析

迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase,RAS)是紫苏(Perilla frutescens)迷迭香酸生物合成途径中的关键酶,采用基因组步移方法,克隆得到长度为2 022 bp的紫苏RAS基因5′端的启动子片段,并对启动子序列的转录起始位点和顺式作用元件进行分析。结果表明,紫苏RAS基因启动子调控区域除了含有基本的TATA-box和CAAT-box元件外,还含有多个与植物胁迫和生长相关的顺式作用元件,如脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应的顺式作用元件等,另外还包含多个光响应顺式作用元件。     

闽楠PLR基因家族鉴定及响应激素的表达分析

  目的  解析闽楠Phoebe bournei木脂素合成途径关键酶基因Pinoresinol-lariciresinol reductase (PLR)特征及不同激素处理下的表达模式，探索闽楠PLR基因家族的生物学功能。  方法  利用生物信息学方法鉴定闽楠基因组中的PLR基因家族成员，分析基因结构、保守基序、染色体定位、系统进化、启动子顺式作用元件和激素响应。  结果  从闽楠全基因组内共鉴定出8个闽楠PLR (PbPLR)成员，不均匀地分布于第1、2、5和10号染色体。系统进化分析表明:PbPLR功能可能与底物立体选择性有关。启动子元件分析发现:PbPLRs启动子区域存在脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯等激素响应元件；基因表达分析表明:PbPLRs基因的表达具有组织特异性和激素响应特征，其中PbPLRs基因在根中表达量最高，其次茎，叶中表达量较低；3种激素处理时，PbPLR2表达诱导最强。  结论  从闽楠基因组中鉴定出的8个PbPLRs基因，其基因特征和不同成员可能具有不同催化酶立体选择性，成员表达模式多样化，可能受多种激素诱导，具有组织特异性。图6表2参25     

桂花扩展蛋白基因OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1启动子克隆及活性分析

为研究扩展蛋白基因在桂花花开放过程中的作用机制,利用染色体步移法,从桂花(Osmanthus fragrans)中克隆得到花开放相关基因OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1起始密码子上游1 108、808、945 bp的启动子序列。利用在线数据库Plantcare预测启动子中的顺式作用元件,发现这3个启动子序列中均存在基本元件TATA盒和CAAT盒,还含有脱落酸、生长素、水杨酸等激素诱导元件及响应干旱、高温等多个与植物非生物胁迫相关的元件,如MBS、HSE。分别将这3个启动子与β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase, GUS)报告基因融合进行瞬时表达,结果显示:OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1的启动子均能够驱动GUS基因在转基因烟草叶片中的表达。     

巨桉EgrCIN1响应非生物逆境的分析

  目的  对巨桉Eucalyptus grandis中特有的低温响应基因EgrCIN1 (Eucgr.B02882)序列及其表达特征进行分析,并探索其在植物低温响应中发挥的功能,以丰富桉树抗寒基因资源。  方法  利用生物信息学手段分析EgrCIN1基因、蛋白序列的特征和启动子上的顺式作用元件信息;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析EgrCIN1在巨桉不同组织及4 ℃不同时间、干旱、300 mmol·L?1氯化钠(NaCl)、100 μmol·L?1脱落酸(ABA)和100 μmol·L?1茉莉酸甲酯(MeJA)处理下植株叶片中的表达特征;通过EgrCIN1::GFP载体瞬时转化烟草Nicotiana tabacum进行亚细胞定位;并构建CaMV35S启动子驱动的过表达载体异源转化拟南芥Arabidopsis thaliana,获得3个转基因纯合株系后,对其进行?6 ℃低温、0.5 μmol·L?1ABA等逆境处理,分析EgrCIN1在低温胁迫响应中发挥的功能。  结果  EgrCIN1是巨桉中特有的基因,不含内含子,没有跨膜结构,启动子含有多个与逆境响应相关的顺式作用元件。该基因在茎和叶片中都有表达,而在根中不表达;在叶片中其表达受低温处理强烈诱导;同时,干旱、高盐和ABA等非生物逆境因子也能诱导叶片中EgrCIN1的表达,其编码蛋白被定位在叶绿体中。拟南芥中EgrCIN1过表达转基因株系对低温耐受性提高,对外源ABA敏感程度增强。  结论  EgrCIN1是在叶绿体表达,并可能通过ABA依赖途径参与植物低温胁迫响应,提高植物对低温的抗性。图8表2参27     

番茄Mi-1基因调控元件及同源基因进化分析

为阐明Mi-1基因转录调控元件及同源基因进化特点,从番茄品种京番308中克隆Mi-1基因起始密码子上游序列,选取转录起始位点上游1 432 bp的序列进行启动子顺式调控元件分析,分析结果表明,Mi-1启动子除了含有核心元件外,还含有光响应元件、脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、低温响应元件、防御与胁迫响应元件等。Mi-1同源基因进化分析结果表明,Mi-1同源基因既包括旁系同源基因,也包括直系同源基因。当同源指数为0.70时,番茄、马铃薯、辣椒中含有Mi-1同源基因,与辣椒相比,番茄与马铃薯的亲缘关系更近。结果可为进一步研究Mi-1基因的调控表达和进化规律奠定基础。     

2022 年 2 期目录

  目的  SPL（SQUAMOSA promoter binding protein-like）是植物特有的转录因子,参与植物幼年期向成年期的转变、营养生长向生殖生长的转变、花发育、孢子发生、叶片和根发育、逆境响应等多个过程,在植物的生长发育过程中起着非常重要的作用。探究白桦中BpSPL6基因启动子区的顺式作用元件,以及该启动子在正常和胁迫条件下的表达模式,可为进一步研究BpSPL6基因的功能提供参考,也可为了解白桦的抗逆机制提供依据。  方法  以本实验室组培白桦的总DNA为模板,经PCR克隆了BpSPL6基因上游1 703 bp的启动子序列,用PLACE和Plant CARE在线软件分析启动子区的顺式作用元件。构建BpSPL6基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体并转化拟南芥,探究其组织表达特性和胁迫条件下的表达模式。  结果  PCR成功克隆了BpSPL6基因上游1 703 bp的启动子序列,对启动子区的顺式作用元件预测发现除了含有核心启动元件TATA-box、CAAT-box外,还包括2种特异组织表达元件（根、花粉）,10种激素响应元件（生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸）,4种脱水响应元件等。对转基因拟南芥进行GUS染色结果表明,BpSPL6基因启动子驱动的GUS基因在转基因拟南芥中的表达具有时空特异性。在拟南芥的整个发育过程中,BpSPL6基因启动子驱动GUS基因在真叶叶片中表达,但是表达部位不同。随着叶片的生长,首先在叶片的顶端表达,随后扩展到叶片的叶脉并直至整个叶片,并且表达量逐渐升高。同时BpSPL6基因启动子驱动的 GUS 基因在拟南芥营养生长时期的根部都有表达。并且经氯化钠和甘露醇胁迫后其表达量降低。对比两种胁迫,受到氯化钠胁迫后GUS基因的表达量变化更大,说明对氯化钠胁迫的响应更加强烈。  结论  BpSPL6基因可能参与了植物的叶片、根发育以及对盐和干旱胁迫的响应。      

ThMYB3和ThDof2对ThVHAc1基因表达的调控

ThVHAc1基因能响应干旱、盐、重金属等胁迫诱导,该基因能有效提高转ThVHAc1基因酵母的多种抗逆能力。为进一步研究ThVHAc1基因的抗逆调控机理,本研究利用酵母单杂交技术钓取ThVHAc1可能的上游调控因子,并利用基因枪瞬时共转化技术进行初步验证。酵母单杂交结果显示,ThMYB3基因能识别ThVHAc1基因上游MYB顺式作用元件和含有MYB元件的启动子片段。ThDof2基因能识别ThVHAc1基因上游DOF顺式作用元件和含有DOF元件的启动子片段。但ThMYB3和ThDof2均不能识别突变后的元件及含对应突变元件的启动子片段。将ThMYB3和ThDof2分别构建成效应载体,各元件、突变元件、启动子片段及突变的启动子片段分别构建报告载体进行共表达验证。结果发现:效应载体ThMYB3和含MYB元件及含MYB元件的ThVHAc1启动子片段的报告载体,ThDof2和含DOF元件及含DOF元件的ThVHAc1启动子片段的报告载体瞬时共表达烟草叶片能观察到GUS染色,且GUS活性较高;而与相应突变元件及片段的共转化则观察不到烟草叶片的GUS染色,且GUS活性很低。说明只有非突变的元件和启动子片段才能与效应载体进行互作识别,激活GUS基因的表达,验证了酵母单杂交获得的上游调控基因的识别特异性。表明ThMYB3和ThDof2可能通过与相应启动子元件的结合调控ThVHAc1基因。      

桂花OfCCD1基因启动子克隆与表达特性

类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCDs）参与植物中多种类胡萝卜素的代谢,在桂花Osmanthus fragrans中类胡萝卜素裂解双加氧酶基因1（OfCCD1）对花香物质的合成具有重要作用。根据前期获得的桂花‘堰虹桂’O.fragrans ‘Yanhong Gui’转录组数据库中OfCCD1的序列和前人已发表的OfCCD1序列设计引物,利用染色体步移技术从桂花基因组DNA中扩增获得OfCCD1基因2个拷贝的启动子序列OfCCD1P-L和OfCCD1P-S,其长度分别为2 747 bp和981 bp。2个启动子序列中均含有参与光响应的元件,热激响应元件（HSE）,脱落酸（ABA）响应元件（ABRE）和乙烯响应元件;此外,2个启动子中均含有4个ACGT序列。将2个启动子序列分别替代pBI121上的35 S启动子,将构建的载体通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导转化烟草Nicotiana tabacum叶片进行瞬时表达,发现2个启动子都具有驱动GUS报告基因表达的功能。     

大豆GmFT5a基因启动子受日长调控模式分析

研究构建大豆成花素GmFT5a基因启动子与pGreenII 0800双分子萤光素酶融合植物表达载体,农杆菌注射烟草,通过烟草体内瞬时表达活性试验分析长、短日照条件对GmFT5a启动子表达活性的影响,探讨GmFT5a受日长的表达影响。结果表明,经短日照处理的GmFT5a启动子表达活性高于长日照处理。说明短日照诱导GmFT5a启动子表达,进一步说明该基因为光周期调控因子。利用PLANTCARE在线预测工具分析GmFT5a基因启动子序列可知,GmFT5a启动子序列包含BOX 4、G-box、GT1-motif、Gap-box、chs-CMA1a光响应调控元件。由此说明GmFT5a基因可能通过启动子上光响应元件调控参与调控光周期。     

桂花OfFCA基因的克隆及在花芽分化时期的表达分析

  目的  桂花Osmanthus fragrans是著名的香化植物，其花芽分化受到环境温度影响。研究环境温度对桂花花芽分化的影响对桂花的花期调控具有重要的指导意义。  方法  以桂花品种‘堰虹桂’O.fragrans ‘Yanhonggui’为材料，采用石蜡切片观察其花芽分化进程，运用聚合酶链式反应和实时荧光定量技术对影响温度FCA（FLOWERING LOCUS CA）基因分别进行克隆及表达特异性分析。  结果  克隆得到OfFCA cDNA序列长为1 319 bp，其开放阅读框为864 bp，编码287个氨基酸。序列比对及进化分析发现:OfFCA与木犀科Oleaceae油橄榄Olea europaea和胡麻科Pedaliaceae芝麻Sesamum indicum的FCA相似度较高，同源性可达68%以上。在桂花花芽分化的不同时期，无论叶还是花芽中，19℃环境低温下OfFCA基因的表达水平均显著高于25℃常温生长条件下的表达水平。  结论  桂花OfFCA基因响应环境相对低温的变化，参与桂花的花芽分化，使桂花的花期提前。     

梅花2个PmWRKY2基因克隆及在逆境胁迫下的表达模式

  目的  低温是影响梅花Prunus mume栽培应用的重要环境因素。WRKY基因是一类主要存在于植物中的转录因子，参与响应非生物胁迫等过程。了解梅花WRKY基因对非生物和脱落酸(ABA)胁迫的响应，对梅花定向育种具有重要的意义。  方法  以梅花‘骨红朱砂’Prunus mume ‘Guhong Zhusha’为材料，通过反转录PCR(RT-PCR)克隆获得了2个WRKY2转录因子，命名为PmWRKY2-1和PmWRKY2-2；采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因在低温和干旱下的表达模式。  结果  PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的编码区长度分别为2 223和2 220 bp，分别编码740和739个氨基酸，包含2个WRKY结构域和C₂H₂型锌指结构；PmWRKY2-1与PmWRKY2-2亲缘关系较远，但两者与蔷薇科Rosaceae植物欧洲甜樱桃P. avium、桃P. persica、李P. dulcis的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示:在低温和干旱处理下，PmWRKY2-1与PmWRKY2-2都能被诱导；脱落酸(ABA)处理后，PmWRKY2-1与PmWRKY2-2的表达显著降低。  结论  PmWRKY2-1与PmWRKY2-2可能参与调控梅花低温和干旱响应，并可能受到ABA的调控。图6表1参28     

桂花OfNAC转录因子鉴定及在花开放阶段的表达分析

  目的  研究OfNAC基因对桂花Osmanthus fragrans花开放的调控作用。  方法  从桂花品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhonggui’转录组数据中,筛选获得相关OfNAC基因序列,分析预测其理化性质和结构,运用实时荧光定量PCR技术分析花开放过程的表达特性。  结果  筛选得到22条OfNAC序列。生物信息学分析发现:22条OfNAC转录因子均含有NAM结构域,氨基酸序列含有5个保守的亚结构域(A~E),其保守性由强到弱依次为C、A、D、B、E;二级结构中不同结构的占比由大到小表现为无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-折叠;亚细胞定位及跨膜结构预测表明:OfNAC17、OfNAC17-X2、OfNAC53、OfNAC91、OfNTM1-9是膜结合转录因子,且大多数OfNAC定位在细胞核。在桂花花开放进程中,OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73相对表达量在铃梗期(S₄)到达顶峰,在此之后相对表达降低;OfNAC43在铃梗期(S₄)骤然升高,并且在此时期相对表达最大;OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22从起始期(S₁)呈缓慢上升趋势,在顶壳期 (S₃) 到达最高,随后整体呈现下降趋势;OfNAC29-2在圆珠期(S₂)相对表达量陡然上升,在铃梗期(S₄)相对表达最低。  结论  推测OfNAC100-2、OfNAC43、OfNAC73、OfNAC71、OfNAC29-1、OfNAC21/22、OfNAC29-2等成员极有可能参与调控桂花的花开放。图6表3参33     

青杄PwPEBP基因及其启动子序列的克隆与表达分析

目的通过研究青杄中的PwPEBP基因及其启动子的表达特性及生物学功能,探究PEBP基因在植物生长发育过程中响应逆境胁迫的功能及作用机制。方法本研究从青杄转录组测序中获得PwPEBP的cDNA序列,利用TMHMM、GOR4等在线软件对PwPEBP蛋白进行生物信息学分析,以此为基础通过PCR技术克隆得到PwPEBP开放阅读框（ORF）序列;同时对其在不同组织与不同逆境及激素处理中的表达水平进行了RT-qPCR技术分析;采用染色体步移法克隆PwPEBP的启动子序列,并利用在线软件BDGP和PlantCARE对PwPEBP启动子序列进行基础启动子区域、转录起始位点和顺式作用元件的预测;最后通过农杆菌瞬时转化烟草法验证PwPEBP启动子的功能。结果PwPEBP cDNA长度为1 408 bp,开放阅读框共585 bp,编码194个氨基酸。PwPEBP蛋白分子式为C₉₆₆H_{1 484}N₂₅₀O₂₉₉S₆,无信号肽和跨膜结构域,为亲水蛋白,含有25个磷酸化位点;进化树分析显示,PwPEBP蛋白与北美云杉的PEBP单独聚成一簇,属于新的PEBP蛋白。组织特异性分析显示,PwPEBP在成熟叶中表达量最高,嫩叶中表达量最低;PwPEBP在各激素及逆境诱导下均有表达,但对盐处理无响应。克隆的PwPEBP启动子序列长度为903 bp,其具有响应GA、ABA、SA、MeJA的顺式作用元件。GUS染色及Luc定量实验显示,PwPEBP启动子均能响应GA、ABA、MeJA和SA外源激素及干旱、高温、低温等逆境胁迫。结论青杄中PwPEBP基因广泛响应干旱、低温、高温等非生物胁迫,其中对干旱胁迫最为敏感,同时还参与了ABA、GA、MeJA和SA激素的信号通路。      

毛竹GRF基因家族全基因组鉴定与表达分析

  目的  探究毛竹Phyllostachys edulis GRF基因家族的性质、结构特点以及在不同组织中的表达水平,为进一步研究GRF在毛竹生长发育中的分子作用机制奠定基础。  方法  采用生物信息学方法,对毛竹全基因组和转录组信息进行分析,筛选出13个毛竹GRF基因家族成员,并对GRF基因家族的理化性质、进化、基因结构、保守结构域、启动子、基因家族表达模式及三级结构进行分析。  结果  毛竹GRF基因家族成员按照其在scaffold上分布的位置,分别被命名为PeGRF01~PeGRF13;将含有3个内含子的PeGRF04和PeGRF12归为非ε组,其余为ε组。毛竹各GRF基因家族成员理化性质存在一定的差异,但是其结构域相对保守,均含有14/3/3结构域。毛竹GRF家族启动子区含有大量与光响应、低温响应、激素调控等相关的顺式作用元件。毛竹GRF存在基因复制扩增的现象,与水稻Oryza sativa的共线性关系明显高于拟南芥Arabidopsis thaliana。毛竹GRF在不同组织器官中均有表达,各家族成员的表达量存在差异;在毛竹花和根组织中的表达量略高于叶和鞭,同时家族成员间的表达量也存在一定差异。GRF蛋白质由2个单体构成,每个单体由9个α-螺旋构成,整体结构呈“W”型。  结论  毛竹GRF基因家族具有典型的14/3/3结构域,可能参与根、鞭、叶、花序及笋芽的生长发育过程。图6表1参39     

6个彩叶桂品种对低温胁迫的生理响应及抗寒性评价

  目的   研究6个彩叶桂Osmanthus fragrans品种对低温胁迫的生理响应,并进行抗寒性评价,以利于彩叶桂的推广和应用。   方法   以6个彩叶桂品种离体叶片为材料,进行人工低温胁迫,共设0、?4、?8、?12、?16、?20、?24、?28 ℃共8个温度梯度,测定其相对电导率、丙二醛质量摩尔浓度、可溶性糖质量分数、可溶性蛋白质质量分数、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性等6项生理指标,结合隶属函数法,探讨几种彩叶桂对低温胁迫的响应,进行抗寒性评价。   结果   不同低温胁迫下6个彩叶桂品种的相对电导率的变化均为“S”型曲线,Logisitic回归分析可知:‘傲霜’‘Aoshuang’、‘冬荣’‘Dongrong’半致死温度较低,分别为?12.95、?11.80 ℃;‘银碧双辉’‘Yinbi Shuanghui’最高,为?8.15 ℃。低温胁迫下,彩叶桂叶片丙二醛质量摩尔浓度随温度降低,总体上呈先增加后减少再增加的变化规律,并且各品种的变化幅度有所不同。随温度的降低,各品种可溶性糖、可溶性蛋白质质量分数总体上均为先升后降,但增加幅度和拐点温度并不相同。‘罗彩1号’ ‘Luocai No.1’、‘傲霜’超氧化物歧化酶活性表现出“上升—下降—再上升—再下降”的趋势,其余品种超氧化物歧酶活性变化均呈先升后降的趋势。不同品种过氧化物酶活性的变化趋势不尽相同,‘永福幻彩’ ‘Yongfu Huancai’、‘银碧双辉’大致呈现先上升后下降的趋势,‘罗彩1号’、‘罗彩2号’‘Luocai No.2’、‘傲霜’、‘冬荣’过氧化物酶活性呈“下降—上升—下降”的趋势。抗寒性评价可知:6个品种抗寒能力从强到弱依次为‘傲霜’、‘冬荣’、‘罗彩2号’、‘罗彩1号’、‘永福幻彩’、‘银碧双辉’。   结论   低温胁迫条件下,6个彩叶桂品种叶片生理生化指标均发生了明显的变化,综合来看,‘傲霜’‘冬荣’‘罗彩2号’这3个品种较能适应北方气候。图6表2参35     

毛竹Ph-TElncRNA1的鉴定及对靶基因的调控

  目的  旨在探究毛竹Phyllostachys edulis Ph-TElncRNA1及靶基因的表达模式，初步分析lncRNA的功能。  方法  基于高温、低温、紫外、高盐胁迫处理毛竹实生苗全转录组测序数据，筛选在胁迫下差异表达的lncRNA。通过CNCI、Pfam、CPC2、PLEK等4个软件对lncRNA的编码特性进行分析，用LncRNATar软件鉴定lncRNA的靶基因，通过实时荧光定量PCR分析lncRNA和靶基因在紫外胁迫下和叶片着色过程中的表达模式。  结果  筛选到1个在紫外胁迫下差异表达的lncRNA，此lncRNA来源于LARD转座子序列(large retrotransposons derivatives)，命名为Ph-TElncRNA1 (Phyllostachys edulis transposable element derived lncRNA1)。Ph-TElncRNA1是一个典型的非编码RNA，全长为342 bp，其中，185个碱基来源于外显子，157个碱基来源于内含子。Ph-TElncRNA1的靶基因为psbA，编码photosystem Ⅱprotein D1。实时荧光定量结果表明:Ph-TElncRNA1与psbA的相对表达量呈完全相同的趋势，说明在紫外胁迫下Ph-TElncRNA1与psbA呈正相关。通过Ph-TElncRNA1和psbA在不同着色时期的毛竹叶片的相对表达量分析，发现在叶绿体形成期，Ph-TElncRNA1和psbA表达量达到峰值。  结论  Ph-TElncRNA1和psbA在紫外胁迫下协同表达，Ph-TElncRNA1可以通过调控靶基因psbA参与毛竹叶片发育。图7参33