烟草过氧化物酶基因NtPOD1的克隆及表达模式分析

为烟草过氧化物酶基因的功能及结构研究奠定理论基础,采用同源克隆的方法,从烤烟品种K326中克隆出了过氧化物酶基因Nt POD1的c DNA全长,并进行了生物信息学分析;同时,运用q RT-PCR的方法,分析了该基因的组织器官及逆境胁迫表达模式。结果显示,该基因c DNA全长981 bp,编码326个氨基酸残基,预测分子量为37.19 ku,等电点为8.89。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水性蛋白,结构域中含有4个保守的二硫键和2个保守的钙结合位点,可能定位在细胞外(包括细胞壁),属于植物血红素依赖性过氧化物酶超家族的Ⅲ类分泌氧化酶,与渐窄叶烟草POD42、美花烟草POD42、马铃薯POD42等具有很高的同源性。该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中叶中表达量最高,花中表达量最低。同时,Nt POD1的表达受高盐、干旱、低钾、ABA和H2O2诱导。结果表明,Nt POD1基因属于烟草的过氧化物酶,并可能在烟草非生物逆境胁迫响应中发挥作用。     

烟草ERF基因NtRAP2-7的表达载体构建及表达模式分析

为了研究烟草Nt RAP2-7基因在非生物胁迫响应中的功能,采用同源克隆的方法,在烟草品种K326中克隆到1个ERF转录因子基因Nt RAP2-7。并利用生物信息学软件分析了该基因编码蛋白的理化性质、空间结构与系统进化关系。序列分析结果表明,该基因序列全长1 398 bp,共编码465个氨基酸残基,预测蛋白的分子量为51. 16 ku。该蛋白包含一个由3个β-折叠及1个α-螺旋组成的保守结构,并含有58个磷酸化位点。亚细胞定位预测表明,该蛋白主要定位于细胞核,并包含单分型的核定位信号序列。进化分析表明,Nt RAP2-7蛋白与林烟草RAP2-7蛋白序列同源性最高,为98%。运用q RT-PCR技术进行了该基因的表达模式分析,组织表达分析发现,Nt RAP2-7基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,但在根中的表达量最高。该基因的表达在低钾、高盐、干旱、ABA、H2O2处理下受到诱导和在低温处理下受到抑制,结果表明,烟草Nt RAP2-7基因参与了烟草的非生物胁迫应答反应。并利用双酶切法成功构建了p BI121-Nt RAP2-7过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。     

烟草硼外向转运体NIP5;1的克隆和表达分析

为研究烟草中的硼转运机制,克隆了烟草硼外向转运体基因,并分析其表达特点。采用生物信息学的方法预测烟草硼外向转运体的开放阅读框,并通过PCR的方式克隆后测序验证;其相应蛋白质的结构特点亦用生物信息学手段分析。该基因在烟草不同组织和对不同处理响应的表达差异采用半定量RT-PCR的方法检测。结果显示克隆到烟草硼外向转运体NtNIP5;1的开放阅读框,全长894 bp,编码297个氨基酸,具有MIP家族典型的结构域HLNPSLTIA,GenBank登录号为KF611892。其蛋白质的二级结构以α-螺旋为主,有5个跨膜结构域。RT-PCR结果发现,NtNIP5;1在根和叶中均有表达,但在叶中表达水平较高; 6-BA、SA和ABA均可抑制其表达。     

烟草硼内向转运体NIP5;1的克隆和表达分析

为研究烟草中的硼转运机制,克隆了烟草硼内向转运体基因,并分析其表达特点。采用生物信息学的方法预测烟草硼内向转运体的开放阅读框,并通过PCR的方式克隆后测序验证;其相应蛋白质的结构特点亦用生物信息学手段分析。该基因在烟草不同组织和对不同处理响应的表达差异采用半定量RT-PCR的方法检测。结果显示克隆到烟草硼内向转运体Nt NIP5;1的开放阅读框,全长894 bp,编码297个氨基酸,具有MIP家族典型的结构域HLNPSLTIA,Gen Bank登录号为KF611892。其蛋白质的二级结构以α-螺旋为主,有5个跨膜结构域。RT-PCR结果发现,Nt NIP5;1在根和叶中均有表达,但在叶中表达水平较高;6-BA、SA和ABA均可抑制其表达。     

与核桃早实性连锁的SCAR标记基因的克隆与表达

克隆与新疆早实核桃(Juglans regia L.)早实性紧密连锁的SCAR标记相关基因,分析其在原核和转基因烟草中的表达,可为今后进一步研究其功能和克隆早实相关基因奠定基础。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆核桃早实性连锁标记SCAR相关基因的c DNA全长序列,分别构建该基因的融合原核表达载体ET28a-300与植物表达载体PBI121,并在大肠杆菌DH5α中诱导表达及通过农杆菌介导法转入烟草进行表达分析。结果显示:该基因c DNA为1 167 bp,包含一个最大为486 bp的ORF,编码162个氨基酸;诱导蛋白大小为18 k D,等电点为7.59;与一些预测蛋白具有一定的同源性。其核苷酸编码序列与藜科苜蓿的mth2-21d12(AC150566.16)、葡萄全序列鸟基因枪法获得的基因(AM460831.2)同源性分别为80%和82%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合,并将该基因命名为Jr2-7300。转早实SCAR标记连锁的Jr2-7300基因的烟草植株与对照烟草在长势方面无显著差异。核桃早实SCAR标记连锁的相关基因Jr2-7300与早实性紧密连锁,但尚缺乏直接的证据控制核桃的早实性。     

烟草K~+通道NtSKOR基因的克隆及表达分析

钾通道是植物吸收和转运K~+的主要蛋白质,SKOR属于Shaker通道外整流家族,在植物低钾胁迫反应中起关键作用。为了研究烟草NtSKOR基因在非生物逆境胁迫中的功能和作用,以普通烟草K326为试验材料,同源克隆一个NtSKOR基因c DNA全长,利用实时荧光定量PCR表征基因表达模式,结合生物信息学分析,对蛋白的理化性质、结构域、磷酸化位点和进化关系等进行初步预测。生物信息学分析表明,该基因全长2 484 bp,编码827个氨基酸残基,预测分子量为94. 75 ku,等电点为6.52。该蛋白最大二级结构元件为α-螺旋,最小为β-转角,含有6个跨膜结构域(S1～S6),具有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3种不同激酶磷酸化位点。进化分析表明,NtSKOR与美花烟草和绒毛状烟草SKOR蛋白同源性高,分别是99%和96%,故命名为NtSKOR。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中根中表达量最高,花中表达量最低。逆境胁迫试验表明,该基因能快速响应低钾、高盐、干旱、H_2O_2、ABA和4℃等非生物逆境处理。由此推测,NtSKOR在烟草非生物逆境胁迫起着重要调节作用,为今后进一步深入研究NtSKOR功能提供了理论基础。     

陆地棉钾转运体基因GhHAK5的序列特征及表达分析

KUP/HAK/KT钾转运体基因家族对植物吸收钾离子发挥重要作用, 鉴定和克隆棉花的钾转运体基因, 对于改良棉花的钾吸收特性, 提高棉花的产量和品质具有重要意义。基于已测序的陆地棉基因组序列, 本研究通过同源克隆的方法鉴定到陆地棉钾转运体基因GhHAK5, 并以陆地棉品种百棉1号为材料对其CDS序列进行扩增。结果表明, GhHAK5基因的CDS全长为2451 bp, 编码816个氨基酸, 分子量和等电点分别为91.23 kD和8.15。GhHAK5蛋白具有KUP/HAK/KT家族基因的保守结构域“K-trans”(Pfam02705)和标志性序列GXXXGDXXXSPLY, 并具有11个跨膜区。在进化上, GhHAK5蛋白与拟南芥AtHAK5亲缘关系最近, 其次是与水稻的OsHAK5, 它们同属Cluster I进化簇。亚细胞定位结果显示, GhHAK5是一个定位于质膜的蛋白, 这与其主要作为钾转运子参与K⁺吸收的功能是一致的。GhHAK5基因在根中表达量最高, 在茎、叶、花瓣、纤维和花萼中表达量很低, 且其表达受外界低钾环境诱导。本研究结果为进一步了解GhHAK5基因的功能及培育钾高效棉花品种奠定了基础。     

烟草SKP1基因cDNA的克隆分析及原核表达

应用DDRT-PCR法获得可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟SKP1基因cDNA的3’端序列,通过5’ RACE扩增该基因cDNA的5’ 端,进而扩增此基因cDNA的全长,通过同源性比较分析,与本塞姆氏烟草的SKP1基因同源性达81%,其cDNA全长653 bp(GenBank登录号：AY702087),其中编码区位于73~540 bp,编码一条155个氨基酸的多肽。经预测该多肽的分子量为17 527.78 Da,等电点为4.57,定位于细胞质,功能结构域分析结果显示在4~105位氨基酸有一明显的Skp1结构域,其E值为1.25e-52,因此推断该基因为枯斑三生烟的SKP1基因。将该基因编码区亚克隆到原核表达载体pET23b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达出与预测分子量一致的蛋白。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

甘蔗ScHAK11基因启动子的克隆与初步分析

钾转运体ScHAK11基因是甘蔗钾转运体基因家族的重要成员。本研究以甘蔗为材料,通过染色体步移方法对ScHAK11上游启动子片段(pScHAK11)进行克隆,获得ScHAK11起始密码子ATG上游启动子序列,序列长度为2 018 bp。序列分析表明,该序列包含多个真核生物启动子核心元件TATA-box、CAAT-box以及与逆境胁迫、光响应、激素诱导、分生组织和叶肉栅栏组织表达等顺式作用元件,推测pScHAK11启动子受到多种激素和逆境胁迫诱导表达,并通过分生组织和叶肉栅栏组织等顺式调控元件参与对甘蔗组织发育的调控。将p ScHAK11启动子序列与包含GUS基因的载体pBI121连接进行活性分析,发现pScHAK11启动子片段能驱动GUS基因在烟草茎和根中瞬时表达。荧光定量PCR结果表明,ScHAK11主要在甘蔗叶片和根系表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pScHAK11启动子驱动的GUS基因在烟草中的表达结果不一致,结果表明p Sc HAK11启动子是组织特异型启动子。本研究结果有助于深入了解ScHAK11基因表达调控的分子机制,为研究ScHAK11基因的转录调控机制奠定基础。     

陆地棉线粒体耐盐基因ccmC的克隆与表达分析

为了研究陆地棉线粒体基因细胞色素C合成酶C亚基(cytochrome c biogenesis C,ccm C)的结构和功能,本研究以陆地棉中9409为材料克隆得到线粒体基因ccm C,对其进行生物信息学分析,并利用q RT-PCR方法对该基因在陆地棉不同组织和盐胁迫前后的表达量进行分析。结果表明:陆地棉线粒体基因ccm C的ORF全长为753 bp,编码250个氨基酸;二级结构预测ccm C蛋白属于跨膜蛋白;该蛋白含有15个磷酸化位点,推测激酶磷酸化可能与其功能的行使相关。q RT-PCR结果表明该基因在陆地棉中具有组织表达差异性,在根中的表达丰度最高;盐胁迫后,该基因的表达量先增加后降低,盐胁迫6 h时表达量最高。研究结果可为今后进一步研究棉花线粒体基因ccm C的功能奠定了分子生物学基础。     

烟草祖先种及重要野生种叶绿素酶基因CLH1的生物信息学分析

叶绿素酶(Chlorophyllase)是所有光合生物叶绿素代谢中最重要的酶之一。叶绿素酶催化叶绿素的水解,产生脱植基叶绿素和叶绿醇。以烟草祖先种和重要野生种为研究对象,以拟南芥CHLOROPHYLLASE 1 (CLH1)为探针,通过同源序列搜索,从数据库中获取普通烟草(Nicotiana tabacum)及祖先种、烟草属重要野生种中的CLH1基因及其蛋白序列,并通过生物信息学分析手段对其编码蛋白的理化特性、氨基酸序列特征、蛋白结构与功能、启动子序列及表达调控特征进行了分析,并以林烟草(Nicotiana sylvestris) Nsyl CLH1为代表,预测了该基因启动子的顺式作用元件,以渐狭叶烟草(Nicotiana attenuata) Natt CLH1为例,预测了该基因的编辑位点。结果表明,栽培烟草CLH1蛋白虽在理化特性上存在差异,但氨基酸序列分析表明这些序列高度相似;对林烟草Nsyl CLH1基因的启动子顺式作用元件分析显示,除光响应作用元件、抗病性作用元件、干旱和盐分等作用元件,还有与茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,Me JA)、赤霉素(Gibberellic acid,GA)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)和水杨酸(Salicylic acid,SA)等激素响应相关的元件,表明Nsyl CLH1基因的表达水平受多种因素的影响。最后,基因编辑位点预测显示渐狭叶烟草Natt CLH1可能跨越外显子-外显子连接。为茄科烟草属植物CLH1基因的功能研究、基因编辑及品质育种等提供了理论基础。     

林烟草钾离子通道基因NKT6的克隆与表达定位分析

Shaker家族钾离子通道在植物钾的吸收转运及其他生命过程中发挥重要作用。本研究利用同源克隆的策略从林烟草中获得一个Shaker家族钾离子通道基因,命名为NKT6 (GenBank登录号为KC310448)。该基因cDNA序列全长2 317 bp,编码由681个氨基酸组成的蛋白,该蛋白与Shaker家族其他成员具有较高同源性。NKT6基因组CDS序列共含有11个外显子、10个内含子。系统进化树分析表明,NKT6蛋白是Shaker家族Group II的成员之一。荧光定量PCR分析发现,NKT6的表达量在林烟草的茎和腋芽中最高,在萼片、叶、花中其次,在根中最低。亚细胞定位结果表明,NKT6主要定位于细胞膜和核膜附近的内质网上。干旱与外源ABA胁迫处理下,NKT6的表达量均呈下降趋势。推测NKT6可能在林烟草气孔开放中发挥作用。     

谷子转录因子基因SiNAC45在拟南芥中对低钾及ABA的响应

NAC(nascent polypeptide-associated complex)转录因子在植物生长发育和非生物胁迫响应等过程中发挥重要的调控作用,目前,关于NAC转录因子参与耐低钾胁迫的研究报道很少。本研究在前期工作对低钾胁迫的转录组测序基础上,对筛选出的一个低钾胁迫下表达量上调的NAC类转录因子基因SiNAC45进行了深入研究。结果表明,SiNAC45基因全长1383 bp,编码461个氨基酸,分子量为50.7 k D,等电点为6.92。SiNAC45在20~100个氨基酸之间有一段NAM保守结构域。系统进化树结果显示,SiNAC45位于NAC基因家族的第1亚族。基因表达谱分析显示,SiNAC45主要在谷子根部表达,并且能够被低钾和ABA诱导表达。亚细胞定位结果显示SiNAC45定位于细胞核。基因功能分析结果显示,在不同浓度低钾处理下,和野生型拟南芥相比,SiNAC45转基因拟南芥的根长和植株鲜重显著增加,说明过表达SiNAC45可以提高转基因植物对低钾胁迫的抗性。下游基因表达分析结果显示,在SiNAC45转基因植物中两种重要的钾离子转运体基因AKT1和HAK1的表达显著提高,证明SiNAC45通过调控植物钾离子转运体基因的表达影响植物对低钾胁迫的耐性。种子萌发试验结果显示,SiNAC45转基因拟南芥与野生型拟南芥相比对ABA的敏感性降低,说明SiNAC45可能负调ABA信号。     

高粱Na~+转运蛋白基因SbSKC1的克隆及其在烟草中的抗盐功能鉴定

钠离子转运蛋白基因在植物抵御逆境胁迫中起重要作用,本研究克隆了高粱钠离子转运蛋白基因SbSKC1(XM_002457691.1),其完整开放阅读框包含1497个核苷酸,编码498个氨基酸残基。氨基酸序列比对及进化树分析表明,SbSKC1与玉米(Zea mays)LOC100382359(NP_001162576.1)具有高度相似性。构建pSH-SbSKC1植物表达载体,利用农杆菌介导法将SbSKC1转入烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthin)。转基因植株经PCR验证后进行300 mmol L~(–1)NaCl胁迫处理,转基因植株的存活率高于野生型,其根长显著高于野生型,而且转基因烟草保持了较高的钾钠离子比。盐胁迫后,转基因烟草的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性显著高于野生型,而过氧化氢(H_2O_2)含量比野生型烟草低37.7%。根据以上结果推断,过量表达SbSKC1基因能够提高烟草的抗盐性。     

烟草脱水素基因NtDEH1的克隆及研究

为研究脱水素在植物早期胚胎发育中的作用和机理,采用显微操作技术获得烟草卵细胞并构建其c DNA文库,从中筛选到一个脱水素基因NtDEH1。通过RACE技术获得该基因全长,基因组测序结合生物信息学分析表明该基因拥有一段长度为651 bp的完整开放阅读框和一段535 bp的内含子,编码由217个氨基酸残基组成的蛋白质,其理论等电点为5.27,属于酸性蛋白,且具有一定的亲水性。氨基酸序列比对分析发现在许多物种比如绒毛状烟草、林烟草、甜辣椒、番茄、马铃薯和丹参中都具有与NtDEH1蛋白非常类似的保守的同源序列,均具有SK2型脱水素特征。借助Genome walking技术获取NtDEH1基因约1 706 bp的5'侧翼序列,使用小叶烟草瞬时表达系统检测到其具有较强的启动子活性。该研究为进一步了解脱水素基因NtDEH1在植物生殖发育中的具体功能打下基础。     

大豆钾转运体基因GmKT12的克隆和信息学分析

以钾高效和钾敏感型大豆品系为试验材料,设置低钾胁迫试验,在8个时间段取样提取RNA,利用Real time-PCR检测GmKT12基因的表达量,结果显示GmKT12基因在不同品系地上部和地下部表达水平有显著差异,其原因来自GmKT12基因的氨基酸序列和蛋白质结构的变异。从2个品系中分别克隆目的基因并对基因序列进行同源性及生物信息学分析表明,与GmKT12基因相似性在30%以上的同源基因有56个,GmKT12在进化树中的位置与Glyma18g18822最近;GmKT12编码蛋白为可溶性跨膜蛋白,具有多个磷酸化位点,该基因与信号转导有关,对大豆获取及转运钾离子可能起着关键作用。     

陆地棉钾转运体基因GhHAK5启动子的克隆与功能分析

KUP/HAK/KT钾转运体基因的转录调控是植物响应低钾胁迫的一项重要机制。克隆和分析棉花钾转运体基因的启动子,不仅有助于了解其表达模式及调控机制,对于改良棉花的钾吸收特性也具有重要意义。陆地棉钾转运体基因GhHAK5是一个在根中特异性高表达的基因,其表达受低钾胁迫诱导,目前关于该基因启动子的功能还不清楚。本研究以陆地棉品种百棉1号为材料,通过PCR方法对GhHAK5上游2000bp启动子片段(pGhHAK5)进行克隆,并通过转化拟南芥、GUS组织定位和低钾诱导表达特性分析来研究其功能。结果表明, pGhHAK5除具有TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、逆境胁迫、植物激素和生物钟等的顺式作用元件。pGhHAK5与雷蒙德氏棉pGrHAK5在重要调控元件的数量和位置分布上具有较高的一致性,均具有5个参与根特异性表达调控的元件(ATAAAAT)和1个参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点(TGTCNN)。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和胚轴维管束组织染色较深,根系染色较浅;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉和花萼维管束组织染色较深,茎和荚皮染色较浅,表明pGhHAK5驱动的GUS主要在拟南芥成熟的根和地上部维管束组织中表达。进一步低钾诱导表达特性分析表明, PGhHAK5驱动的GUS在拟南芥幼苗幼嫩根中的表达很弱,且其表达不受低钾胁迫诱导而增强,表明PGhHAK5可能是一个主要在成熟根中具有功能的低钾诱导型启动子。转录组分析和荧光定量PCR结果表明, GhHAK5主要在成熟的根中表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pGhHAK5驱动的GUS在拟南芥根中的表达结果一致。本研究结果有助于深入了解GhHAK5表达调控的分子机制,并为棉花钾吸收效率的提高及钾高效棉花品种的培育提供理论依据。     

菜豆TIFY基因的全基因组鉴定与系统进化分析

TIFY蛋白是植物特异性转录因子,在植物生长、发育和基因调控中具有重要作用。尽管部分菜豆TIFY基因被鉴定与研究,但从基因组水平剖析TIFY基因家族的研究未见报道。结合基因组和转录组学数据,本研究系统剖析了菜豆TIFY基因家族的序列、选择、表达及进化特征。结果显示:18个PvTIFY基因散落分布在9条染色体上,共线性鉴定出6对片段重复基因和1对串联重复基因,同时这些基因被分为6大类群;序列分析表明,菜豆TIFY基因有12种基因结构模式,但有5种保守基序组成模式,这说明保守基序模式更保守;选择压力检测显示,同源基因对均受到负选择作用,显示较高的保守性;表达分析揭示了菜豆TIFY家族基因具有多样化的表达模式,其中同源基因对表达模式发生趋异现象。这些结果为深入研究菜豆TIFY蛋白的生理功能提供了参考。     

中国水仙凝集素基因在大花烟草中的定量表达及抗蚜性分析

为了确定中国水仙凝集素基因NTL1的抗蚜功能及培育具有抗蚜功能的大花烟草,利用qPCR方法,研究了中国水仙凝集素基因(NTL1)在转基因大花烟草4个株系中的相对表达情况;利用自然感蚜、活体接种和离体接种方法研究了不同转基因株系的抗蚜能力。结果表明,NTL1在不同株系中的相对表达量差异显著,从高到低依次为3,4,1,2;抗蚜虫试验结果显示:转基因烟草具有一定抗蚜性,但不同烟草株系的抗蚜能力有所不同;活体转基因烟草单株与离体烟草叶片的平均蚜虫密度抑制率分别为8.22%~76.61%,4.62%~65.65%;转基因大花烟草可加速蚜虫的死亡。对比NTL1在不同转基因大花烟草株系中的相对表达量及抗蚜效果,发现NTL1在不同株系中的相对表达量与植株抗蚜性具有高度一致性。