小麦microRNA167e的特征及表达模式分析

MicroRNAs(miRNAs)是一类在植物发育调控和逆境胁迫响应过程中发挥重要功能的小RNA,为了探讨miR167e在小麦中的生物学功能,以小麦品种中国春、豫麦18和矮抗58为材料,利用RT-PCR技术克隆了小麦miR167家族基因新成员 MIR167e,并采用qRT-PCR技术分析了其时空表达特性及其对渗透胁迫的响应模式。结果将小麦 MIR167e基因定位在第5同源群染色体的短臂上,将该基因A、B和D基因组的三个部分同源基因分别命名为 TaMIR167e-5AS、 TaMIR167e-5BS和 TaMIR167e-5DS。序列分析显示,该miRNA前体区域在所检测品种间高度保守,3个部分同源基因间仅存在SNP差异,在成熟tae-miR167e对应区域完全一致。时空表达特性分析显示,tae-miR167e在籽粒发育过程中表达呈上调趋势,在不同组织间的表达差异较大,其中在3叶期,叶片和根系中表达量较高,种子中次之,穗下节中表达量最低;在干旱胁迫条件下,该miRNA受胁迫诱导而上调表达,与中国春相比,矮抗58根系中该miRNA的诱导表达启动更快,在叶片中的表达水平更高;在盐胁迫条件下,该miRNA在根系中呈下调表达趋势,而在叶片中上调表达。推测tae-miR167e在小麦发育调控和渗透胁迫响应过程中发挥重要功能。     

小麦灌浆相关基因TaGIF1的克隆及表达分析

GIF1( grain incomplete filling 1)编码了一种质外体途径中催化蔗糖不可逆水解的细胞壁蔗糖转化酶,主要在组织生长旺盛并且需要供能的库中表达,是影响灌浆的关键基因。根据水稻 OsGIF1基因序列,同源克隆了普通小麦第2部分同源群染色体上的 TaGIF1基因,它包含7个外显子和6个内含子,与水稻OsGIF1基因结构相似。小麦 TaGIF1-2A基因含有237 bp的5′UTR、1 986 bp的ORF、262 bp的3′UTR,编码661个氨基酸。通过分析15份大小粒小麦品种的gDNA序列,在 TaGIF1-2A基因中共发现21个SNP位点,9个位于编码区,12个位于非编码区。SNP分组发现,15份大小粒小麦品种中 TaGIF1-2A基因共存在8种单倍型。氨基酸序列比对显示,共存在2个氨基酸变异位点,其余SNP位点未引起氨基酸的改变。大小粒品种中无特异SNP变异,表明该基因编码区序列高度保守。就 TaGIF1-2A启动子区而言,大粒材料元件数量和种类均多于小粒材料,而且这些元件均与籽粒发育相关,说明 TaGIF1-2A基因启动子的活跃程度与最终籽粒灌浆饱满度的形成可能存在密切联系。qRT-PCR分析表明, TaGIF1-2A在籽粒和颖壳中都有表达,在不同小麦材料中表达模式相同,说明与籽粒大小无关;而在2～6 DAA的籽粒中,表达量剧烈上调,而后急剧下调,由此推测 TaGIF1-2A可能影响籽粒灌浆,在灌浆前期与籽粒发育密切相关。亚细胞定位结果表明,TaGIF1-2A主要作用在细胞壁上。     

小麦Ta-miR154的特征及渗透胁迫响应

植物逆境胁迫响应过程中microRNA（miRNA）发挥着重要调控功能,为探讨小麦Ta-miR154的特征及其对渗透胁迫的响应,以矮抗58和中国春为材料,克隆了 Ta-MIRNA 基因并对其序列特征及时空表达模式进行分析。结果显示,小麦 Ta-MIR154 的3个部分同源基因位于第7同源群染色体组上,分别命名为 Ta-MIR154-7A 、 Ta-MIR154-7B 和 Ta-MIR154-7D ;3个部分同源基因间序列差异较大,但在miRNA前体区域高度保守,其中 Ta-MIR154-7A 由于一个核苷酸的变异导致不能生成 Ta-MIR154 。组织表达分析显示, Ta-MIR154 在成熟籽粒中的表达量最高,其次为节间和根系;籽粒形成过程中, Ta-MIR154 从授粉后20 d开始快速上调表达,授粉后30 d表达量最高。干旱胁迫条件下,两品种的叶片中 Ta-MIR154 在受胁迫诱导后均上调表达,且矮抗58的表达水平高于中国春;而根中 Ta-MIR154 的响应模式不同,在中国春中呈先上调后下调的表达趋势,而在矮抗58中呈先下调后上调的表达趋势。盐胁迫条件下,两品种的叶片中 Ta-MIR154 在受胁迫诱导后呈先上调后下调的表达趋势,且中国春的上调幅度大且持续时间长,而在根系中矮抗58的上调表达幅度要大于中国春。推测 Ta-MIR154 在小麦渗透胁迫响应过程中发挥一定的调控功能。     

节节麦pbf基因的克隆、序列分析及原核表达

醇溶蛋白盒结合因子(prolamin-box binding factor,PBF)通过调控籽粒蛋白的表达效率进而影响面粉的加工品质。为给深入研究小麦籽粒PBF对籽粒蛋白质表达调控的分子基础提供参考依据,进而为小麦面粉加工品质的改良提供候选基因资源,利用特异引物组合pbfF1/pbf R1分别从两份节节麦(AS90、AS2386)中克隆出pbf基因后进行序列分析,并进一步构建pbf基因的原核表达体系。结果表明,从两份节节麦中克隆得到了2个不同类型的pbf基因(GenBank登录号分别为KJ544771和KJ544772),其中来源于AS2386的KJ544772与来源于普通六倍体小麦的1个pbf基因序列完全相同。推导的氨基酸序列分析表明,KJ544771和KJ544772所编码的蛋白质均为弱碱性的亲水蛋白,具有典型的DOF蛋白结构域。与其他远缘物种来源的PBF比对结果表明,该类蛋白在NLS核心、DOF结构域及Ser铰链区相对保守,而在C-端调控区变异较大,说明PBF蛋白具有种属特异性。同时,系统演化树显示,来源于节节麦AS2386的pbf基因与迄今已知的全部普通小麦的pbf基因具有高度的相似性,因此推测该种类型的节节麦很可能参与了最初的普通六倍体小麦的形成。此外,本研究成功构建了pbf基因的原核表达体系,可为后续功能验证的开展奠定基础。     

转小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥植株的主要抗旱性研究

核氧还蛋白（nucleoredoxin,NRX）可通过还原目标蛋白的二硫键来调控其生物活性,在植物的生长发育和抗逆境胁迫中发挥着重要作用。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）、h型硫氧还蛋白（h-type thioredoxin,TRXh）和蛋白磷酸酶2A催化亚基（protein phosphatase 2A catalytic subunit,PP2Ac）是小麦核氧还蛋白TaNRX1的互作蛋白。为了明确TaNRX1互作蛋白的抗旱性功能,本研究在拟南芥中过表达了小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因,对野生型和转基因拟南芥的表型和抗旱相关生理指标进行了鉴定。结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的根长、存活率、脯氨酸含量均大于野生型,离体叶片失水率、丙二醛（MAD）含量均小于野生型。二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）对H₂O₂组织定位染色结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的H₂O₂含量均低于野生型。上述结果说明,TaNRX1的互作蛋白基因 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D增强了拟南芥对于干旱胁迫的抵抗能力。本研究可为小麦抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

小麦糖转运蛋白基因TaSWEET6的克隆与表达分析

植物SWEET基因家族是一类糖转运蛋白,参与生殖发育、衰老、逆境响应等多个生理过程。为研究小麦SWEET基因对逆境胁迫的响应及其在花药发育过程中的功能,采用同源克隆的方法从普通六倍体小麦中克隆出TaSWEET6基因(GenBank登录号为KU936097)后对其进行染色体定位、同源蛋白序列比对和系统进化树分析,同时分析TaSWEET6基因于普通六倍体小麦在正常生长情况下及非生物胁迫条件下不同组织器官中和光温敏雄性不育小麦BS366在不同发育时期的花药中的表达模式。序列分析结果表明,TaSWEET6基因包含1个732bp的完整开放阅读框,编码243个氨基酸。跨膜结构分析得知,TaSWEET6蛋白包含2个Mtn3_slv跨膜结构域和1个起连接作用的跨膜-螺旋。系统进化树分析表明,TaSWEET6蛋白与大麦处于同一分支,其亲缘关系最近。中国春缺四体定位表明,TaSWEET6基因位于7D染色体上。表达分析表明,TaSWEET6基因在小麦根、茎、叶、种子、小花(除去雄蕊)、各时期雄蕊中均有表达,小孢子时期雄蕊表达量最高;在低温、干旱、NaCl和ABA胁迫处理下,TaSWEET6基因表达均有上调;光温敏雄性不育系BS366在不育环境(低温短日照)下,TaSWEET6基因在雄蕊发育关键时期(二分体时期)高度表达。说明小麦TaSWET6基因可能参与了多种逆境应答反应,并在小麦雄蕊发育过程中发挥着重要作用。     

TaMBD2基因cDNA全长克隆及其在小麦叶片和种子中的表达

为探讨甲基结合蛋白(MBD)在小麦生长发育过程中的生物学功能,通过RACE技术克隆了小麦TaMBD2基因的cDNA全长,并分析了该基因在小麦叶片、种子发育及萌发过程中的表达特性。RACE克隆及序列分析表明,TaMBD2基因cDNA全长为1 511 bp,其中5 UTR 164 bp,3 UTR 405 bp,ORF 942 bp。对该基因编码氨基酸序列的分析发现,TaMBD2编码蛋白中包含有1个典型的甲基结合域和1个CW型锌指结构域;通过RT-PCR分析发现,TaMBD2基因在叶片中的表达随着小麦的生长发育而逐渐增强;在种子发育过程中,该基因在花后20和30 d时的表达量最高;在种子萌发过程的胚和胚乳中,该基因的表达水平变化不大。     

小麦冷休克蛋白基因TaCSP的克隆及表达分析

为深入研究小麦冷休克蛋白(cold shock proteins,CSPs)基因,根据大肠杆菌(E.coli)CSPs蛋白保守氨基酸序列,借助生物信息学技术检索小麦EST序列,采用同源序列法拼接了小麦3个冷休克蛋白基因,并以小麦叶片总RNA为模板,采用RT-PCR对其进行扩增;同时,采用荧光定量PCR对3个基因的组织表达特性以及ABA、低温、高温、干旱和盐胁迫条件下的表达模式进行了研究。结果表明,小麦3个冷休克蛋白基因TaCSP1、TaCSP2和TaCSP3全长分别为290、374和377bp,各编码69、69、80个氨基酸残基。序列分析表明,TaCSP1、TaCSP2和TaCSP3之间氨基酸相似性为72.9%~84.3%,与大肠杆菌来源CSPs的相似性为40.0%~79.7%。荧光定量PCR表达谱分析显示,TaCSPs在抽穗期小麦的根、茎、叶和幼穗中均能表达。胁迫分析表明,3个冷休克蛋白基因在小麦幼根中的表达,在低温和ABA处理下,表现为早期诱导、后期抑制,在高温、干旱和盐胁迫下,则表现为早期抑制、后期有所恢复。克隆获得的小麦3个冷休克蛋白基因在根组织中强烈表达,并受ABA和冷胁迫诱导,推测其在小麦抵御逆境胁迫过程中发挥重要作用。     

小麦TaMBD3基因的克隆和表达

DNA甲基化(m5C)在基因表达调控过程中发挥重要作用,而甲基结合域蛋白(MBD)是能特异识别甲基化位点的反式作用因子.为了探讨小麦中MBD基因的结构与功能,以拟南芥MBD基因的EST为基础,通过电子克隆结合RT-PCR方法分离克隆了包含ORF的小麦甲基结合域蛋白基因TaMBD3.序列分析显示,TaMBD3具有典型的甲基结合域,其中包含了能与甲基化DNA相结合的保守氨基酸残基.组织表达特性分析表明,TaMBD3在幼穗和茎中的表达量高于其它组织器官.采用电子定位的方法,将TaMBD3基因初步定位在6AS1-0.35-0.65和C-6BL3-0.36两个区域.     

小麦16.9 kD热激蛋白cDNA克隆及其表达分析

为进一步了解小分子量热激蛋白在小麦耐热能力中的作用,根据玉米16.9 kD小分子热激蛋白的氨基酸序列,采用同源序列法进行序列拼接和引物设计,用RT-PCR扩增获得了1个源自小麦叶片的热激蛋白基因cDNA片段,即TaHSP16.9-1(GenBank登录号为EU649679).TaHSP16.9-1全长770 bp,5′非翻译区81 bp,3′非翻译区233 bp,开放阅读框编码151个氨基酸.序列分析结果表明,此蛋白与已知单子叶植物来源的同类基因高度同源,相似性介于78.3%～96.7%之间.定量RT-PCR表达谱分析显示,TaHSP16.9-1在小麦抽穗期的茎和旗叶以及幼苗期叶片中均能表达,其在小麦幼苗叶片中的表达受高温胁迫的诱导.     

小麦 DA1基因家族成员的鉴定及其表达谱分析

泛素受体DA1在控制种子和器官大小上发挥着重要作用。本研究以中国春小麦为材料,采用生物信息学的方法对小麦 DA1基因家族成员进行了全基因组鉴定和分析,共鉴定到12个小麦 DA1同源基因（ TaDA1s）,分别位于2B、2D、4A、4B、4D、5A、5B和5D染色体上,亚细胞定位预测结果表明其位于细胞核中。系统进化分析发现, TaDA1s可分为 TaDA1、 TaDAR1和 TaDAR2三类。除TaDA1-2D1编码的蛋白只含有DA1-like结构域外,其他成员编码的蛋白均含有DA1-like、UIM和LIM结构域。启动子序列分析发现, TaDA1s的启动子区含有较多的响应激素、逆境以及与生长发育相关的顺式作用元件。通过公共的转录组数据和qRT-PCR试验验证, 发现 TaDA1s在不同组织中都有表达,在籽粒发育过程中,不同的小麦 DA1基因呈现不同的表达模式,暗示存在基因功能分化现象;脱落酸（ABA）能够抑制 TaDA1s的表达;在低温和盐胁迫条件下, TaDA1s基因表达有明显的差异。酵母双杂交和荧光素酶互补试验发现,TaDA1-2B、TaDAR1-5A和TaGW2存在转录自激活现象,且TaDAR1-5A与TaGW2有微弱的互作效应。本研究结果为进一步探究 DA1基因家族在小麦中的生物学功能奠定了基础。     

31份小麦材料中抗旱基因的KASP检测

为明确小麦材料中抗旱相关基因的组成,利用已报道的29个标记（11个新转化的KASP标记以及已报道的18个KASP 标记）,对16份抗旱小麦品种和15份高产小麦品种进行KASP检测。结果表明,多数基因位点在抗旱小麦品种和高产小麦品种间的优异等位基因数目无明显差别;TaPYL1-1B、Wcor14-2B、TaSRL1-4A、TaSnRK2.3-1A、QTDW.caas-6BL位点的优异等位基因在旱地品种中占比较高,而TaWRKY51-2B和TaSnRK2.4-3A位点的优异等位基因仅存在于抗旱品种中,前者的供体材料为晋麦47、晋麦92和晋麦101,后者的供体材料为济麦379。     

59份江苏小麦品种（系）的抗赤霉病评价与农艺性状分析

赤霉病是小麦的重要病害,严重影响小麦产量和品质。为发掘赤霉病的抗性种质资源和抗性基因,本研究分别以苏麦3号、扬麦158、扬麦15和安农8455为高抗、中抗、中感和高感赤霉病对照品种,于2016-2017和2017-2018连续2年对来自江苏的59份小麦品种（系）采用单花滴注接种法进行田间赤霉病抗性鉴定,同时利用与 Fhb1 、 Fhb2 、 Fhb4 、 Fhb5 和 QFhs.crc-2DL 连锁的分子标记对供试材料进行检测,并对赤霉病表现为稳定中抗及以上水平品种（系）的千粒重、株高、穗粒数等农艺性状进行调查。结果表明,59份供试小麦品种（系）中,19份在两个年度均表现为中抗。分子标记检测发现,9份小麦品种（系）仅携带 Fhb1 ,平均病小穗率为22.21%;10份小麦品种（系）仅携带 QFhs.crc-2DL ,平均病小穗率为27.82%;携带 Fhb2 、 Fhb4 和 Fhb5 基因的品种（系）较少。镇麦12号、宁麦1529、宁麦27、镇麦13322、宁麦17110、镇麦13、宁麦17108和宁麦17396的赤霉病抗性和综合农艺性状均较好,可以作为小麦抗赤霉病遗传改良的种质资源。     

白粉菌诱导下小麦TaNHO1基因的克隆、表达分析及亚细胞定位

非寄主抗性基因 NHO1(non-host resistance 1)编码的甘油激酶(glycerol kinase,GK),是甘油代谢中的限速酶之一,参与植物对多种病害的抵御过程。为进一步探究其响应小麦白粉菌侵染的表达模式,利用RT-PCR方法克隆获得了转录自抗病种质N9134的三个部分同源染色体的小麦 NHO1基因(分别命名为 TaNHO1-2A、 TaNHO1-2B和 TaNHO1-2D),分析三个 TaNHO1同源基因的序列、启动子组成元件和表达模式,并明确了其亚细胞定位。序列分析结果表明,小麦 TaNHO1-2A/2B/2D基因CDS区序列全长分别为1 605、1 599和1 605 bp,分别编码534、532和534个氨基酸残基;3个同源基因均含有与 AtNHO1(AT1G80460.1)基因以及 OsNHO1(Os04G0647800)基因高度相似的FGGY_N端和FGGY_C端结构域。经对启动子区结构分析,该基因启动子区含有大量与植物激素及逆境响应相关的顺式作用元件,意味着 TaNHO1可受到多种植物激素诱导并参与小麦抗病过程。qRT-PCR结果表明,在N9134抗病近等基因系响应白粉菌(Blumeria graminis f. sp.tritici,Bgt)侵染过程中,三个同源基因在不同时间点表达模式不同,其中 TaNHO1-2A、 TaNHO1-2B基因在侵染早期均上调表达,而 TaNHO1-2D则表现出多次波动的表达模式;在N9134感病近等基因系遗传背景下,同源基因的表达水平在病菌侵染后48 h均表现出下调,说明该基因能够响应白粉菌侵染。经亚细胞定位分析,该基因主要作用于细胞质、细胞膜以及核膜。     

小麦穗粒数及千粒重主效QTL共定位区QC-7AL的精细定位及遗传效应分析

为了研究小麦7AL染色体上与穗粒数及千粒重相关的基因位点及其遗传效应,对小麦穗粒数及千粒重主效QTL共定位区QC-7AL进行了精细定位及遗传效应分析。结果表明,QC-7AL主要位于小麦7AL染色体的IWA7406～IWA5913标记区间,长度为3.1cM,对应的物理距离约为5.63 Mb,其中包含了473个SNP标记和81个基因。QC-7AL对穗粒数和千粒重具有明显相反的遗传效应,其遗传效应分别为9.3%～14.3%和8.7%～13.7%。QC-7AL与QC-4BS位点对小麦穗粒数具有明显的互作效应,且QC-7AL位点对穗粒数的遗传效应略大于QC-4BS位点。     

黄淮麦区部分小麦和国外引进小麦GS2等位基因的检测及其与农艺性状的关联分析

为明确黄淮麦区TaGS2等位基因的分布状况及其与主要农艺性状的关系,对黄淮麦区2008年之前育成的种质材料、新育成的品种(系)及国外引进材料,用TaGS2-A1、TaGS2-B1和TaGS2-D1等功能标记鉴定对应的基因,并结合相关农艺性状发掘优势单倍型。结果表明,黄淮麦区2008年之前育成的种质材料和新育成品种(系)中TaGS2等位基因分布频率存在一定的差异;TaGS2-A1b、TaGS2-B1b和TaGS2-D1a是优势TaGS2等位基因,TaGS2-A1b在小麦抽穗期、株高和小穗数的改良上是优势单倍型,但在新育成的品种(系)中有下降的趋势,TaGS2-D1a能够显著增加小穗数、穗粒数和穗粒重,在各类材料中的比例都较高;TaGS2-B1b是提高千粒重的优势单倍型。因此,在黄淮麦区小麦穗部性状改良中TaGS2-B1b和TaGS2-D1a的作用显著,尤其是TaGS2-D1a,同时黄淮麦区种植小麦遗传多样性在减少,一些优势单倍型未受到重视,应对地方品种和一些国外引进材料加以利用。     

灌浆期高温与干旱对小麦籽粒淀粉合成相关酶基因表达的影响

灌浆期高温与干旱是影响小麦籽粒淀粉合成与积累的重要因素。为探讨灌浆期高温、干旱及其复合胁迫对小麦籽粒淀粉合成及积累的影响机理,以郑麦366为试验材料,采用大田盆栽和人工气候室模拟高温相结合的方法,研究了灌浆期高温、干旱及其复合胁迫对小麦籽粒淀粉合成相关酶基因表达特性及淀粉含量的影响。结果表明,灌浆期高温导致小麦籽粒淀粉合成相关酶基因表达高峰期提前,并不同程度抑制淀粉合成相关酶基因的表达;干旱胁迫不同程度提高了 AGPL1、 AGP1-a、 AGP1-b、GBSSI、SSI、SSIIc、SSIIIb、BEI、BEIIb、 ISA2、PHOH基因的表达量,降低其余被测基因表达量;高温和干旱复合胁迫与单因素胁迫对被测指标的影响不尽相同,表明两者对某些指标存在互作效应。高温与干旱均导致成熟期籽粒直链、支链和总淀粉含量下降。淀粉合成相关酶基因表达特性与淀粉积累密切相关。综上所述,高温与干旱改变了淀粉合成相关酶基因的表达,使淀粉积累受抑,导致小麦籽粒淀粉含量和产量下降。     

宁夏小麦品种（系）脂肪氧化酶基因的检测与分布

为给宁夏优质小麦育种和推广提供依据,本研究以180份宁夏小麦品种（系）为材料,利用分子标记检测脂肪氧化酶（LOX）基因在QLpx.caas-1AL和TaLOX-B1位点的组成情况,分析其分布特点。结果表明,不同等位变异及其组合类型的分布比例不同。在QLpx.caas-1AL位点,除了原有的3种等位变异Xwmc312-227、Xwmc312-235和Xwmc312-247外,还发现了2种新的等位变异。经测序分析,两种新变异条带大小分别为199 bp和223 bp,暂命名为Xwmc312-199和Xwmc312-223。该位点5种等位变异的分布比例分别为46.11%、32.78%、18.89%、1.11%和1.11%。在TaLOX-B1位点存在2种等位变异,即TaLOX-B1a和TaLOX-B1b,分别占15.56%和84.44%。宁夏小麦LOX基因位点存在8种等位变异组合类型,其中Xwmc312-227/TaLOX-B1b组合类型比例（40.56%）最高,Xwmc312-235/TaLOX-B1b次之（27.78%）,Xwmc312-199/TaLOX-B1b和Xwmc312-223/TaLOX-B1b最低（均为1.11%）。同时,在不同地区和相同地区不同来源品种（系）间,LOX基因的分布也存在差异。总体来看,宁夏小麦低活性LOX基因等位变异类型（Xwmc312-227/TaLOX-B1b）所占的比例明显高于高活性类型（Xwmc312-235/TaLOX-Ba1）。