转双抗虫基因741杨对杨扇舟蛾幼虫的致死规律研究

[目的]揭示转双抗虫基因741扬对杨扇舟蛾幼虫的致死效应规律。[方法]用转基因741杨不同系号在室内饲养杨扇舟蛾幼虫,研究取食转基因741杨不同发育天数、不同龄期以及不同世代的杨扇舟蛾幼虫死亡率。[结果]转基因741杨对不同发育天数、不同龄期的杨扇舟蛾幼虫均有一定的致死效应,但随着幼虫的生长发育,致死效应降低。发育天数少、低龄幼虫的死亡率高,发育天数多、高龄幼虫的死亡率低。转基因741杨对取食2代的杨扇舟蛾幼虫也具有一定的致死效应,且高于取食1代的杨扇舟蛾幼虫。[结论]在一定的时间内,随着幼虫的发育,取食时间的延长,杨扇舟蛾幼虫对转基因741杨抗虫性的抵抗力增强且逐渐适应,但随着取食代数的增加,致死效应则加强;转基因741杨对杨扇舟蛾幼虫的抗性具有持续性：     

转双抗虫基因741杨对杨扇舟蛾幼虫生长发育的抑制规律?

用转基因741杨叶片饲养杨扇舟蛾幼虫,观察记录幼虫的死亡、蜕皮情况以及各龄幼虫的体重,研究转基因741杨对靶标害虫生长发育的抑制规律。研究结果表明：取食转基因741杨后杨扇舟蛾幼虫的生长发育不良,表现为发育进度减慢、发育历期延长、体重增长速率降低。且对不同龄期开始饲养的幼虫和取食不同世代的幼虫抑制作用不同,从低龄开始饲养的幼虫生长发育受到的抑制作用强于从高龄开始饲养的幼虫。对取食2代的幼虫抑制作用强于取食1代的幼虫,转基因741杨对杨扇舟蛾幼虫生长发育的抑制作用具有持续性。     

转基因741林中杨扇舟蛾实验种群生命表研究

通过在转基因741杨林中,对靶标害虫杨扇舟蛾Clostera anachoreta Fabricius种群生命表的比较研究,证明了转基因741杨林中杨扇舟蛾的世代存活率与对照相比显著降低,种群趋势指数降低了13.43～19.26倍,表明转基因杨可以减少靶标害虫的自然种群数量.经存活曲线分析得知杨扇舟蛾种群的个体死亡主要发生在幼龄幼虫期,特别是对1～2龄幼虫的致死能力更为明显.经过对转基因741杨林中杨扇舟蛾各死亡因子的致死力比较分析可知:由毒蛋白直接引起的食物和环境共同作用、病菌致死以及间接引起的化蛹死亡率升高的最为明显.     

转基因741杨抗虫持续性研究

在室内用转基因741杨叶片连续饲养舞毒蛾和杨扇舟蛾幼虫,以探讨转基因741杨对不同世代昆虫的影响及昆虫种群的持续效应.转基因741杨对连续两代取食其叶片的幼虫,抗虫性高于只第一代取食其叶片的幼虫;只第一代幼虫取食转基因741杨叶片而下一代取食CK的幼虫,其死亡率高于两代均取食CK的幼虫.另外,连续两代取食转基因741杨叶片的幼虫蜕皮指数、排粪量、化蛹率及羽化率都低于仅一代取食转基因741杨的幼虫,且二者均低于取食对照的幼虫.结果表明转基因741杨的抗虫性具有持续性,可以影响到下一代幼虫的生长发育,使下一代幼虫的死亡率升高,生长发育减慢,降低下一代幼虫虫口密度,进而影响到未来种群的发生与发展,达到很好的抗虫效果.     

转基因741杨抗虫性的变化规律研究

用离体的转双抗虫基因741杨不同叶位的叶片在室内群体饲养杨扇舟蛾幼虫,定期观察其死亡和蜕皮情况.其结果表明转双抗虫基因741杨对杨扇舟蛾幼虫有良好的抗性,并呈现一定的规律,老叶和嫩叶的抗虫性要高于介于二者之间叶片的抗虫性;对不同龄期幼虫的毒杀作用不同,对存活幼虫的生长发育有抑制作用.表现为取食嫩叶和老叶幼虫的死亡率高于取食中间叶片幼虫的死亡率;低龄幼虫的死亡率最高,随着虫龄的增加幼虫的死亡率降低;幼虫的龄期相对延长.     

转双Bt基因巨霸杨外源基因表达及抗虫性检测

为提高转基因杨树中Bt基因的表达效率并扩大抗虫谱,以同时转入Cry1Ac和Cry3A基因的转双Bt基因巨霸杨(Populus deltocdes‘55/56’×P.deltocdes‘2KEN8’)株系1年生苗为材料,对外源基因的表达和抗虫性进行检测。经PCR检测,证明目的基因已被整合到巨霸杨基因组中。利用荧光定量PCR和ELISA技术检测了4个转基因株系叶片中Bt基因的转录丰度和毒蛋白表达量。结果表明:不同株系间Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因的转录丰度;2种Bt毒蛋白表达量在各株系间存在显著差异,Cry3A毒蛋白质量分数均显著高于Cry1Ac毒蛋白质量分数。各株系对鳞翅目害虫美国白蛾(Hyphantria cunea)幼虫抗虫效果不明显,且无显著差异;对鞘翅目害虫柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)表现出极高抗虫效果,且均显著高于转单基因Cry3A 741杨高抗株系CC84,不同株系间存在显著差异。     

转双抗虫基因三倍体毛白杨抗虫性分析

对经过6年田间栽植的转双抗虫基因(Bt cry1Ac和API)三倍体毛白杨部分系号再次进行分子生物学检测,初步证明外源基因在杨树基因组中稳定存在。同时以成树转基因系号叶片对杨扇舟蛾(Lymantria disparL.)和舞毒蛾(Lymantria disparL.)幼虫进行室内饲虫试验,并对幼虫致死率及树木生长情况进行了相关分析。结果表明:所检测的19个转基因系号,对两种昆虫均表现出抗虫性,分别有63.15%和31.58%的系号对舞毒蛾和杨扇舟蛾幼虫表现出高抗性(校正致死率超过80%),且不同系号对两种昆虫抗性大小是一致的,两者存在显著相关性;不同转基因系号对两种昆虫致死率与幼树相比均已明显下降;转基因明显抑制存活幼虫生长发育,且以不同系号所饲养幼虫的发育存在显著差异;转基因系号对幼虫致死率与其生长情况之间相关性不显著,表明外源基因转入时对生长没有产生影响。     

不同叶位杨树叶片对杨扇舟蛾发育和繁殖的影响

[目的]明确杨扇舟蛾对杨树不同叶位叶片的取食选择性及其发育和繁殖适合度的影响.[方法]以1年生杨树枝条的第1、3、5、7叶位叶片室内饲养杨扇舟蛾初孵幼虫至化蛹,观测其对杨扇舟蛾幼虫发育和繁殖适合度的影响.[结果]不同叶位叶片对杨扇舟蛾幼虫历期(27℃下14 d)、蛹历期(6 d)和产卵前期(17 d)无明显影响,但对存活率曲线、蛹质量和单雌产卵量具有显著影响,第3叶位叶片饲养的杨扇舟蛾具有较高的存活率、较小的蛹重和较低的繁殖力.[结论]试验结果为阐释杨扇舟蛾发生的机理和有效控制杨扇舟蛾提供了理论依据.     

杨树接种外生菌根真菌卷缘桩菇对杨扇舟蛾生长发育的影响

研究了银灰杨接种外生菌根真菌(Paxillus involutus)对食叶害虫杨扇舟蛾(Clostera anachoreta)生长发育的影响。结果表明,幼虫期取食菌根化杨树叶片,显著降低了低龄期幼虫(2龄和3龄)的头壳和体重并显著延长了幼虫的发育历期,但对高龄期幼虫以及蛹期和成虫期的各项发育指标均无显著影响。因此,菌根化杨树苗抑制了杨扇舟蛾幼虫的发育,幼虫发育历期的延长增加其被天敌昆虫捕食的风险。     

转双抗虫基因741杨对靶标害虫主要解毒酶和乙酰胆碱酯酶的影响

用不同系号转基因741杨叶片饲养杨扇舟蛾、舞毒蛾和美国白蛾4～6龄幼虫,测定其中肠重要的两种解毒酶和乙酰胆碱酯酶比活力,研究转基因741杨对靶标害虫生理代谢的影响。结果表明,转基因741杨显著抑制了羧酸酯酶、谷胱苷肽-S-转移酶和乙酰胆碱酯酶的比活力,其中PB11和PB29的抑制作用达到了极显著水平,与转基因741杨抗虫性的生测结果一致。转基因741杨对靶标害虫解毒酶和乙酰胆碱酯酶比活力的抑制作用是其抗虫性的生理机制之一。     

瓜实蝇生物学特性研究

通过对瓜实蝇B actrocera(Z eug od acus)cucurbitae在10、14、18、22、26、30、34和38℃下卵、幼虫和蛹的发育历期及成虫羽化、取食、交尾和产卵等生物学特性的研究表明,瓜实蝇的卵、幼虫和蛹的发育历期随温度的升高而缩短,其最适发育温度在26~30℃范围内。14℃下卵期3.5~4.0 d,平均(3.68±0.14)d,30℃下仅需1 d;幼虫于14℃下历期最长为(9.0~16.0)d,平均(11.73±1.21)d,30℃下最短为4.0~6.0 d,平均(4.83±0.24)d;蛹14℃下最长为24.0~33.0 d,平均(26.95±0.41)d,最短30℃下为6.0~7.0 d,平均(6.39±0.02)d。成虫白天活动,黄昏时交尾,羽化多集中于凌晨。卵产于瓜皮内,以幼虫蛀食瓜肉为害,老熟幼虫脱离瓜果进入土中化蛹。     

二色胡枝子黄酮体外抗氧化活性

通过二色胡枝子黄酮(Lespedeza bicolor flavonoids ,LBF)清除羟自由基、超氧阴离子的效果及抑制猪油、菜油和亚油酸的自氧化来研究其体外抗氧化作用.结果表明:二色胡枝子黄酮对清除自由基有显著作用,且清除率随黄酮浓度的增加而增大;能够明显地抑制猪油、菜油、亚油酸的自氧化,抑制作用随浓度的增大而增强.作为天然的抗氧化剂,二色胡枝子黄酮具有一定开发利用价值.     

桂花OfPSY、OfPDS和OfHYB基因启动子克隆及表达特性分析

  目的  探究高温和外源脱落酸对桂花Osmanthus fragrans类胡萝卜素生物合成的3个相关基因,包括八氢番茄红素合成酶基因(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)、β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB)的调控作用,为阐释桂花类胡萝卜素代谢调控的机制提供研究基础。  方法  根据桂花基因组数据库的序列,从桂花品种‘堰虹桂’‘Yanhong Gui’中克隆OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的启动子序列,并进行生物信息学分析,再构建PCAMBIA3301-LUC载体在烟草Nicotiana benthamiana中瞬时表达,结合高温(37 ℃)和200 mg·L?1脱落酸处理,分析启动子活性。  结果  获得OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的部分启动子,其长度分别为1 908、1 521及1 830 bp。作用元件分析表明:3个启动子中均存在TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件、光响应元件、脱落酸响应元件以及MYB和MYC结合位点。此外,在OfPSY启动子中,存在赤霉素响应元件;在OfPDS启动子中,存在茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、厌氧诱导型元件参与防御和胁迫的元件;在OfHYB启动子中,存在生长素、乙烯、茉莉酸甲酯等激素响应元件、低温响应元件和厌氧诱导型元件。烟草瞬时转化试验表明:相对高温能激活OfPSY、OfPDS和OfHYB的启动子活性,脱落酸能激活OfPDS和OfHYB的启动子活性。  结论  高温和脱落酸可能通过调控桂花类胡萝卜素合成基因启动子活性,影响桂花类胡萝卜素的积累。图4表5参28     

锈色粒肩天牛幼虫的COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因片段序列分析

  目的  基于分子生物学手段，探讨可快速准确鉴别锈色粒肩天牛Apriona swainsoni幼虫与其他天牛幼虫的目标基因，为该保健昆虫的食药用安全提供保障。  方法  利用线粒体COⅠ、COⅡ、Cytb基因和28S细胞核基因的通用引物分别克隆获得4种基因片段，并进行同源序列检索、多重比对、序列信息分析及进化树构建。  结果  基因克隆最终获得锈色粒肩天牛4种基因序列的片段大小分别为817、545、434和1 088 bp。特殊位点分布结果显示:28S的保守位点占比最高，其后依次为Cytb、COⅠ和COⅡ，变异率则正好相反。COⅠ、COⅡ和Cytb基因片段的碱基组成和替换信息特点均表现为A+T含量>G+C含量，颠换高于转换，28S基因片段则表现为A+T含量  结论  COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因均可作为鉴定该虫的分子生物学参考依据。     

转酿酒酵母HOG1基因拟南芥植株的获得与检测

HOG1(high osmolarity glycerol,HOG1)是酵母中参与耐高渗透压调控的重要基因。根据已发表的酿酒酵母序列,设计特异引物,扩增到完整的HOG1基因;构建植物表达载体pBI121-HOG1,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转化植株种子。对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选,并通过PCR和RT-PCR对抗性苗进行检测。结果表明,构建的载体成功转化拟南芥,并获得了13份转HOG1基因苗。     

欧洲千里光CYCLOIDEA(CYC)类SvRAY1基因的克隆及功能分析

  目的  揭示菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris CYC2类RAY1基因过表达使舌状花发生不同程度变宽现象的机制,进一步探究其产生原因。  方法  克隆欧洲千里光SvRAY1基因,利用生物信息学、实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)、超表达载体构建、扫描电镜观察、转基因植株形态学观察与统计等方法与技术,进一步进行SvRAY1基因功能分析。  结果  qRT-PCR反应显示:SvRAY1基因主要在欧洲千里光舌状花及筒状花中表达,且生殖发育第S3和S4阶段舌状花中表达量最高;形态学观察表明转基因欧洲千里光SvRAY1超表达植株的舌状花比野生型长度较短、显著变宽。扫描电镜观察舌状花腹侧表皮细胞大小与形状,宽度显著变宽的株系中显示远轴端细胞排列紧密且细胞分裂旺盛,中轴端细胞形状由边缘弯曲变为平滑,细胞长度变短且分裂旺盛。  结论  欧洲千里光舌状花发育过程中,SvRAY1基因可能促进细胞横向分裂,进而舌状花细胞形态和排列发生不同程度的变化引起舌状花变宽。图6表2参28     

草酸青霉和棘孢木霉对青枯劳尔氏菌的生防效果

  目的  探究自主筛选获得的2株生防菌棘孢木霉Trichoderma asperellum QZ2与草酸青霉Penicillium oxalicum QZ8对青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum(简称青枯菌)的生防效果。  方法  以青枯菌作为靶标菌,通过平板培养法、生长曲线法测定2株生防菌及其发酵液对青枯菌生长的抑制作用;通过土培试验、基于稀释涂布法测定生防菌在土壤中对青枯菌的抑制效果。  结果  平板对峙培养试验发现:棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌有显著的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别达80.9%和45.9%;棘孢木霉QZ2与草酸青霉QZ8生防菌高温灭菌发酵液对平板培养青枯菌,同样呈显著的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别达33.3%和34.8%。无菌滤膜处理的未高温灭菌2株生防菌发酵液的青枯菌液培养结果表明:其D(600)显著小于未添加生防菌发酵液的对照D(600)(P＜0.05),且棘孢青霉QZ8抑制效果好于草酸木霉QZ2。土壤培养结果显示:2株生防菌处理的土壤中青枯菌的活菌数量显著低于未添加生防菌的对照(P＜0.05)。  结论  棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌均有显著的抑制效果,可作为番茄Lycopersicon esculentum青枯病的潜在生防菌。图5表2参32     

MutL调控水稻黄单胞菌的致病力

为了了解水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)中 的MutL/MutS系统是否参与DNA修复以及是否调控病原菌的致病力,构建了mutL突变体,比较了野生型与mutL突变体的突变率差异,野生型、mutL突变体及其互补菌株侵染水稻的能力。结果显示,mutL突变导致Xoo在H₂O₂胁迫下的突变率显著升高,mutL突变导致Xoo致病力下降,表明DNA错配修复蛋白MutL参与Xoo的DNA修复并正调控Xoo致病力。     

花生油酸脱氢酶基因AhFAD2A和AhFAD2B的时空表达特征

花生Arachis hypogaea油酸脱氢酶AhFAD2是调控花生种子中油酸与亚油酸比值（oleic acid/linoleic acid,O/L）的关键酶,已确定存在2个编码AhFAD2的基因:AhFAD2A和AhFAD2B,但两者在花生中的时空表达特征尚不清楚。选取2个有代表性O/L的花生品种‘山花15’‘Shanhua 15’（O/L为1）和高油酸花生突变体（O/L大于20）为材料,根据AhFAD2A和AhFAD2B基因3'-UTR核苷酸序列的差异,设计了新型、简便的区分两者的特异性引物,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术,对2个花生品种的7个不同组织（根,茎,叶,花,开花后20,40,60 d种子）中AhFAD2A和AhFAD2B的表达特征进行了分析。结果表明:AhFAD2A和AhFAD2B在‘山花15’和高油酸花生突变体7个组织中都有表达;其中,在2个花生品种3个不同发育时期的种子中,AhFAD2A和AhFAD2B在开花后40 d的种子中表达量最高,推测在开花至花后40 d这一阶段种子中FAD2的表达量可能对花生最终O/L起主要的调控作用。另外,‘山花15’种子中AhFAD2B的表达量显著高于AhFAD2A,而在高油酸花生突变体种子中则相反,推测花生中AhFAD2B在催化油酸去饱和生成亚油酸的过程中比AhFAD2A可能起更重要的调控作用。     

农杆菌子房注射法对金钗石斛的活体转化研究

对金钗石斛 Dendrobium nobile 进行人工自花授粉,在授粉之后10、20、30、40、45、50和60 d分别将工程化根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens EHA105(pCAMBIA1301)直接注射入子房内部.150 d后,金钗石斛蒴果成熟,摘取果实,进行种子β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色、无菌播种、潮霉素筛选以及PCR检测试验.结果表明：子房注射对果实发育具有较大影响,在授粉后10~30 d进行子房注射后,果实脱落;在授粉后45 d进行子房注射,成熟果实注射部位的种子GUS染色率最高,可达18%;无菌播种之后,经潮霉素筛选,获得11株幼苗,每株植株均表现出GUS染色反应;随机挑选4株幼苗进行PCR检测,发现均能扩增出预期条带,说明外源基因已经整合到植株基因组内.农杆菌子房注射法在兰科植物转基因的成功应用,可以为兰科植物育种提供一种简单高效的方法.