桃PpMADS1的克隆及对类胡萝卜素合成基因的调控研究

为探究桃MADS转录因子基因的序列特征、表达模式及其对类胡萝卜素合成的调控作用,本研究从桃果实中克隆得到一个MADS-box家族基因,命名为PpMADS1。结果表明,PpMADS1的开放阅读框(ORF)为732 bp,编码243个氨基酸,蛋白具有亲水性,稳定性较差,其二级结构以α-螺旋为主要构成元件,且与三级结构相似。亚细胞定位预测显示PpMADS1蛋白定位于细胞核。氨基酸序列分析及系统进化分析结果表明,PpMADS1属于MADS-box转录因子AG亚族,与乌梅亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,PpMADS1基因在芽和叶中几乎不表达,在花和果实中大量表达,黄肉桃品种金丽果实成熟后期PpMADS1表达量显著高于白肉桃品种湖景果实。双荧光素酶试验结果表明,PpMADS1转录因子对PpPSY和PpCHYB启动子具有转录激活作用。因此推测PpMADS1可能通过调控PpPSY和PpCHYB基因表达促进桃果实类胡萝卜素合成。本研究为桃MADS-box转录因子的进一步功能分析奠定了理论基础。     

桃PpNAC19的克隆及其对PpCCD4启动子活性的调节分析

为探究桃NAC基因对类胡萝卜素积累的调控作用,本研究从桃中克隆得到PpNAC19基因。序列分析表明,PpNAC19(XP_007223324.1)开放阅读框为867 bp,编码288个氨基酸,预测蛋白质分子量为33.2 kDa,平均疏水系数为-0.719,属于亲水性蛋白,含有一个典型的NAM结构域。亚细胞定位预测PpNAC19蛋白定位在细胞核中。氨基酸序列比对与聚类分析表明,PpNAC19与巴旦杏(Prunus dulcis,VVA20514.1)亲缘关系较近。荧光定量PCR结果表明,PpNAC19在桃不同组织中均有表达,且在硬核期果实中表达量最高。在果实成熟过程中,黄肉桃果实中类胡萝卜素含量显著高于白肉桃果实。PpNAC19基因在黄肉桃中表达量较高,类胡萝卜素降解基因PpCCD4在黄肉桃中表达量显著低于白肉桃。双荧光素酶试验结果表明,PpNAC19能够转录抑制PpCCD4启动子活性。本试验为进一步研究PpNAC19基因在桃果实类胡萝卜素代谢过程中的功能提供了理论依据。     

大蒜谷胱甘肽硫转移酶基因AsGST的克隆及其对盐胁迫的响应

为了解大蒜GST基因及其编码的蛋白质的结构特征,分析GST基因在不同组织及盐胁迫条件下的表达特性,采用RT-PCR方法克隆得到大蒜苍山四六瓣GST基因,采用BLAST、DNAMAN、ProtParam、MEGA5、Swiss-Model等生物信息工具分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR方法,分析AsGST基因在大蒜根、鳞茎和叶片中的表达差异及其对盐胁迫的响应情况。结果表明,大蒜AsGST基因全长663 bp,编码220个氨基酸,推测蛋白质分子质量为25.58 kDa,理论等电点为6.55,属于tau类GST家族。植物GST的序列相似性较低,但在结构上相对保守。在蛋白的N端含有谷胱甘肽特异结合位点(G位点),C端含有可变性较大的疏水底物结合位点(H位点),在进化关系上AsGST与茄科作物较近。空间结构分析表明,大蒜GST的三级结构由3个β-折叠和11个α-螺旋构成。实时荧光定量PCR显示,苍山四六瓣中GST基因在根中的表达量最高,其次是叶,在鳞茎中的表达量较低,具有明显的组织特异性。盐胁迫处理4 h后,各组织内AsGST基因的表达量均升至最高,说明该基因可响应盐胁迫逆境信号。本研究结果为进一步研究大蒜GST基因的功能奠定了一定的理论基础。     

药用植物金银花Dof基因家族的筛选及表达分析

Dof(DNA-binding one zinc finger)蛋白是一类植物所特有的转录因子,N-末端具有高度保守的C₂-C₂单锌指结构域,C-末端的转录调控区的氨基酸具有高度多样性,其在植物光合、细胞周期及逆境响应等过程中发挥着重要的作用。本研究基于金银花测序数据,利用生物信息学的方法筛选了候选的LjDof基因,并对其理化性质、亚细胞定位、同源序列比对、保守基序、系统进化发育和表达模式进行了深入分析。结果表明,金银花Dof转录因子家族包含11个基因,编码的氨基酸的个数为157~492,理论等电点为5.45~9.48,均为不稳定亲水性蛋白。亚细胞定位显示,LjDof基因都在细胞核中有定位,个别在其他部位也有定位。同源比对和Motif分析发现,11个LjDof基因都含有完整的C₂-C₂单锌指结构。系统进化发育分析表明,金银花Dof蛋白分为五个亚类。实时荧光定量PCR及表达模式分析表明,LjDof基因在金银花低温胁迫不同时间下有着不同的表达规律。本研究结果为进一步研究金银花Dof基因在逆境胁迫下的功能提供了理论基础。     

葡萄BBX基因家族的鉴定与表达分析

BBX转录因子家族参与植物幼苗的光形态建成、开花、光周期调控及避荫反应等,在高等植物的生长发育过程中起到重要作用。为了解葡萄中BBX基因家族功能,本研究利用生物信息学方法对葡萄BBX基因家族成员的数量、结构、启动子、氨基酸特性、染色体定位及基因进化进行分析。结果表明,葡萄BBX家族有25个成员,以酸性蛋白为主;亚细胞定位表明,有4个分泌途径信号肽,VvBBX2、VvBBX5、VvBBX7、VvBBX20;有2个叶绿体转运肽,VvBBX23、VvBBX24;有1个线粒体靶向肽VvBBX1。染色体定位分析发现,25个VvBBXs基因主要分布在1、3、4、5、7、9、11、12、14、18、19共11条染色体上;系统发育进化分析发现葡萄BBX家族成员分为5个亚家族;葡萄与拟南芥的同源性分析发现,葡萄BBX蛋白家族有很强的保守性;在葡萄BBX基因启动子序列中含有光相应元件、激素类响应元件、低温响应元件等多种顺式作用元件。葡萄BBX基因家族在不同发育时期不同葡萄组织中的表达谱显示,该基因家族具有一定时空表达特异性;不同光照条件下,葡萄BBX基因的相对表达量有显著变化,这表明葡萄BBX基因家族与光形态建成及光合作用有着密切的关系。本研究结果为葡萄BBX基因家族的进一步功能分析提供了重要研究基础。     

高粱SbJAZ1基因克隆与表达分析

JAZ1基因是编码TIFY家族JAZs蛋白的基因之一。为克隆高粱SbJAZ1基因及研究其响应胁迫表达特性,本试验以高粱品种BTx623为研究材料,提取其总RNA,反转录获得cDNA,以cDNA为模板扩增SbJAZ1基因,并对其进行生物信息学、基因表达和原核表达分析。结果显示,SbJAZ1基因全长606 bp,编码201个氨基酸,蛋白质等电点为7.70,分子量大小为21.15 kDa;SbJAZ1与玉米相应同源基因亲缘关系最近,为亲水性蛋白;二级结构中α螺旋占25.37%、延伸链占9.95%、β转角占4.98%,无规则卷曲占59.70%。qRT-PCR分析表明,SbJAZ1在高粱根、茎、芽和叶组织中均有表达,且具有组织表达特异性,在茎中表达量最高;茉莉酸(JA)处理1 h后,SbJAZ1在高粱茎中表达量最高;吲哚乙酸(IAA)和PEG-6000可诱导SbJAZ1的表达。原核表达结果显示,SbJAZ1在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株诱导表达的最佳条件为:温度30℃,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.8 mmol·L^-1。本研究结果为SbJAZ1基因的生物学功能研究提供了基础。     

花生AhMKK4基因的克隆、表达分析和亚细胞定位研究

为挖掘花生抗逆相关基因,本研究以花生品种花育20号为试验材料,根据cDNA文库中已知的促丝裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)基因EST序列设计引物,通过RACE-PCR克隆得到AhMKK4基因。结果表明,AhMKK4基因序列全长1 434 bp,含有3'非编码区151 bp,5'非编码区317 bp,开放阅读框全长966 bp,编码一条含有322个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为36.74 kDa,属于MAPKK基因家族D组成员。亚细胞定位显示AhMKK4基因定位于细胞质和细胞核中。RT-qPCR分析发现,AhMKK4基因在根中表达量高于其他组织,说明该基因具有组织表达特异性;AhMKK4基因受JA和IAA诱导时表达量上调,受SA和ABA诱导时表达量下调,说明该基因可能参与到JA和IAA介导的信号转导途径;AhMKK4在盐胁迫下表达量上调,说明该基因可能参与花生对盐胁迫的适应性调控。本研究结果为花生抗逆育种研究提供了新的基因资源。     

桃果胶裂解酶编码基因PpPL1的鉴定及其在果实成熟软化过程中的表达

为了深入了解桃果胶裂解酶(PL)家族编码基因的功能,本研究利用生物信息学方法对桃基因组中的PL基因进行鉴定,并对这些基因在硬质型桃和溶质型桃果实成熟软化过程中的表达差异进行分析。结果表明,从桃基因组中共鉴定出20个PL基因,所有的PpPL蛋白都含有Pec-Lyase-C结构域,但其中只有4个PpPL(PpPL7、PpPL8、PpPL12、PpPL17)包含Pec-Lyase-N结构域。Pec-Lyase-N的保守性表明其可能是执行果胶裂解功能所必须的功能团。聚类分析表明,桃PL基因可以分为5类:这与模式植物拟南芥和番茄PL基因的聚类模式一致。基因表达分析表明,6个PL基因在桃果实成熟过程中高表达,其中PpPL1基因在有名硬质型桃成熟过程中表达量很低,而在黄金蜜3号溶质型桃成熟阶段高表达。序列比对和聚类分析发现,PpPL1基因与果实软化相关的番茄SLPL高度同源。以溶质型桃湖景蜜露和硬质型桃夏之梦为试材,检测采后软化过程中PpPL1的表达,结果表明PpPL1基因是与桃果实的成熟软化相关的主要基因。本研究结果为进一步探究PL基因家族在桃果实软化中作用的分子机理奠定了基础。     

二穗短柄草GRFs基因家族的鉴定及表达模式分析

GRFs基因家族在植物生长发育及逆境响应中起着重要的调控作用。为了探明二穗短柄草GRFs基因家族的基本特征及其进化关系,本研究利用生物信息学方法在全基因组水平上对二穗短柄草GRFs基因家族成员进行鉴定与分析。结果表明,二穗短柄草GRFs基因家族包括12个家族成员,蛋白质序列长度在238~577个氨基酸之间;序列比对发现二穗短柄草GRFs家族基因包括2个保守的QLQ和WRC结构域及广泛的保守基序;染色体定位发现,12个家族成员在二穗短柄草的5条染色体上呈不均匀分布,bd03号染色体分布最多;系统发育关系比较分析表明,这些GRFs基因家族成员存在4对直系同源基因。RT-qPCR分析表明,全部GRFs基因家族成员在二穗短柄草幼嫩组织中表达量较高,而在根系和衰老组织中表达量较低,外源激素特别是GA₃诱导了二穗短柄草大部分GRFs基因家族成员的上调表达,表明GRFs基因家族广泛地参与了二穗短柄草分生组织功能和器官形成的生命进程。本研究结果为二穗短柄草GRFs家族蛋白功能的研究奠定了理论基础。     

基于转录组金银花AP2基因家族的生物信息学及表达分析

为研究金银花AP2转录因子参与低温的应答机制,本研究基于低温下金银花转录组测序数据,利用在线生物信息学工具对金银花AP2转录因子的理化性质、亚细胞定位、磷酸化位点、蛋白基序以及进化分析进行鉴定和分析;利用实时荧光定量PCR检测3个DREB基因和1个RAV基因在低温胁迫下的表达情况。结果表明,在金银花中共筛选了34个AP2转录因子,不同转录因子之间的理化性质存在差异,表明其在不同的微环境中发挥不同的功能;亚细胞定位结果显示,仅有2个AP2定位于叶绿体,其余均定位于细胞核,符合其作为转录因子调控下游基因的表达特性;所有AP2的磷酸化位点均依次表现为丝氨酸>苏氨酸>酪氨酸;根据AP2中所含有的AP2数量以及序列同源性,可将34个AP2分为四个大类,20个AP2属于ERF亚家族,3个属于DREB亚家族,RAV亚家族仅有1个,其余10个属于AP2亚家族。实时荧光定量PCR检测结果表明,DREB和RAV基因均能响应低温胁迫,且不同低温处理时间的不同组织的表达量存在差异。本研究为阐明金银花AP2转录因子响应低温胁迫的机制奠定了一定的理论基础。     

没食子酸对海鳗肌原纤维蛋白氧化及凝胶特性的影响

为研究没食子酸(GA)对海鳗肌原纤维蛋白(MP)氧化抑制作用和凝胶特性的影响,采用羟自由基氧化体系及不同质量分数GA对海鳗MP进行处理,考察不同浓度GA对海鳗MP氧化抑制作用,采用扫描电镜技术结合凝胶特性分析GA对MP的交联作用。结果表明,氧化使海鳗MP羰基含量、表面疏水性显著上升(P<0.05),总巯基含量、凝胶持水性显著降低(P<0.05)。不同浓度GA对MP氧化均有抑制作用,质量分数分别为0.10%、0.15%的GA抑制效果最佳,且凝胶持水性显著增强(P<0.05)。圆二色谱结果表明,质量分数分别为0.10%、0.15%的GA可使MP的α-螺旋、β-折叠含量有所增加。扫描电镜结果显示,添加质量分数为0.15%的GA后形成的MP凝胶结构更加致密、光滑。综上,质量分数为0.15%的GA能有效抑制海鳗MP氧化,并改善MP凝胶持水性和微观结构。本研究为GA在水产品加工及贮藏过程中的应用提供了理论依据和数据支撑。     

薄壳山核桃CiSULTR2.1基因的克隆与表达分析

为探究薄壳山核桃CiSULTR2.1基因功能及表达特征,以一年生薄壳山核桃实生苗为材料,利用RT-PCR和PCR技术克隆CiSULTR2.1基因全长,利用RT-qPCR技术分析其在不同浓度硒酸盐处理下的表达情况。结果表明,克隆得到1 902 bp的序列,经分析此序列属硫转运蛋白基因CiSULTR2.1全长开放阅读框的cDNA,编码633个氨基酸。CiSULTR2.1蛋白分子质量为68 943.37 Da,为疏水性的非分泌蛋白,无信号肽,结构稳定,二级结构主要由α-螺旋(51.18%)、延伸链(12.64%)和无规则卷曲(31.28%)构成,包含硫转运蛋白典型的Sulfate-transp结构域(PF00916)和STAS结构域(PF01740)。RT-qPCR分析结果表明,CiSULTR2.1在薄壳山核桃幼苗根与叶中均有表达,40、80 μmol·L^-1硒酸盐处理下,12 h出现表达高峰,此后表达量明显下降;而0.5 μmol·L^-1硒酸盐处理下,CiSULTR2.1表达高峰出现时间延后至48 h。硒酸盐浓度过高时,CiSULTR2.1表达量显著下降且低于对照。CiSULTR2.1基因能够快速响应40、80 μmol·L^-1高浓度硒酸盐的诱导,而0.5 μmol·L^-1低浓度硒酸盐需要较长时间才能诱导其高表达。高浓度硒酸盐处理较长时间对植物产生毒性效应,植物对硒酸盐的吸收减少,硒含量降低。本研究结果为薄壳山核桃CiSULTR2.1基因功能及硒吸收机制的研究提供了理论依据。     

γ-氨基丁酸对低温胁迫下桃果实蔗糖代谢的影响

为探讨γ-氨基丁酸(GABA)对低温胁迫下桃果实蔗糖代谢的影响,以湖景蜜露品种水蜜桃为试验试材,采用5 mmol·L^-1外源GABA和100 μmol·L^-1 GABA-T抑制剂(VGB)处理桃果实,比较分析水蜜桃出汁率、GABA含量、可溶性糖含量、蔗糖代谢中间产物以及蔗糖代谢相关酶基因的变化。结果表明,外源GABA处理和GABA复合VGB处理通过提高桃果实贮藏后期内源GABA含量和蔗糖含量,从而有效抑制桃果实在低温贮藏期间冷害的发生。此外,外源GABA处理抑制了贮藏后期蔗糖降解相关酶基因PpSUS5的表达,减缓了桃果实中蔗糖含量的降低速率,从而提高了果实抗冷害的能力。外源GABA复合VGB处理增强了贮藏后期蔗糖合成相关酶基因PpSPS1、PpSPP1和PpSUS3的表达,从而维持桃果实较高的蔗糖含量,抑制果实冷害发生。本研究结果为桃果实采后贮藏保鲜提供了理论依据。     

番茄2个ERF-B1亚族转录因子基因的克隆及其对生物和非生物胁迫响应

为进一步研究番茄ERF转录因子调控植物抗逆的分子机理,本研究以番茄浙杂-301为试验材料,分别克隆获得2个乙烯反应元件结合蛋白基因SlERF83和SlERF109,并对其进行序列及表达分析。结果表明,番茄SlERF83和SlERF109基因分别含有678 bp和669 bp的开放阅读框,编码225和222个氨基酸,各含有1个保守的AP2结构域,属于亲水性蛋白。进化分析表明,这2个ERF转录因子均属于AP2/ERF家族中ERF亚族的B1组。SlERF83和SlERF109三级结构都含有1个α-螺旋和3个β-折叠。酵母单杂交及β-半乳糖苷酶活性测定结果证明SlERF83转录因子可以与GCC-box结合。番茄2个ERF蛋白启动子含有多种逆境相关的顺式作用元件。采用荧光定量PCR检测SlERF83和SlERF109在非生物和生物胁迫下的表达,结果表明,高盐和干旱胁迫下,SlERF83和SlERF109基因的表达均被抑制;水杨酸处理能够诱导SlERF83和SlERF109基因的表达;茉莉酸甲酯处理下SlERF83表达水平提高,SlERF109表达量降低;番茄黄化曲叶病毒侵染下,SlERF83和SlERF109基因的表达均被抑制。SlERF83和SlERF109转录因子可能参与了番茄对生物及非生物胁迫的响应过程。本研究结果为进一步深入开展ERF转录因子调控番茄抗逆分子机制研究提供了一定的理论依据。     

荷斯坦牛DRA基因多态性及序列特征分析

为探讨荷斯坦牛DRA基因的多态性及序列特征,本研究采用基因组DNA混合池扩增并直接测序的方法对荷斯坦牛DRA基因编码区进行多态性分析,同时利用生物信息学方法预测DRA基因的理化特性及其编码蛋白的高级结构。结果表明,荷斯坦牛DRA基因编码区上有4个碱基突变,包含1个错义突变和3个同义突变。DRA基因共编码253个氨基酸,编码产物是一种稳定的不可溶蛋白,具有15个潜在的磷酸化位点,二级结构为混合型,三级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成。本研究结果为荷斯坦牛的疾病相关基因筛选和抗病分子育种提供了一定的理论依据。     

酸性硫酸钙处理对水蜜桃采后匍枝根霉致病力的影响

为研究酸性硫酸钙(ACS)溶液对水蜜桃果实采后致腐匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)的抑菌效果,在离体和体内条件下,探究其对匍枝根霉细胞膜渗透率、细胞壁降解酶、呼吸相关酶活性和桃果发病率的影响。结果表明,不同稀释倍数的ACS溶液对匍枝根霉均有不同程度的抑菌作用,其中ACS-10^-3处理组的抑菌效果最强。在作用120 min时,ACS-10^-3组菌丝细胞膜渗透率达到52.76%,较CK高出39.72%;匍枝根霉在含有50%ACS稀释液的带药培养基中培养9 d时,ACS-10^-3组的PG、PMG、C_X和GLU等细胞壁降解酶活性得到了抑制,较CK分别降低38.41%、41.96%、59.31%和35.52%;且在很大程度上抑制了呼吸能量代谢系统中酶活性的上升,培养第9天时匍枝根霉的SDH、MDH和IDH活性分别为0.02±0.01、0.68±0.12、106.13±3.54 nmol·min^-1·g^-1,均显著低于CK(P<0.05)。同时,ACS稀释液可显著降低损伤接种桃果实的匍枝根霉病斑面积和接种发病率,与CK相比,ACS-10^-3组桃果实的匍枝根霉病斑面积和接种发病率分别降低了99.61%和73.33%。因此,适宜稀释倍数的ACS溶液能够有效抑制水蜜桃采后因匍枝根霉侵染引起的软腐病。     

高羊茅硝态氮转运蛋白基因NRT1.1的克隆及表达模式分析

为探究高羊茅(Festuca arundinacea)硝态氮转运蛋白基因(NRT1.1)的表达模式,本研究以黔草1号高羊茅为试验材料,采用RACE和RT-qPCR技术对高羊茅NRT1.1基因的cDNA全长序列进行扩增,并对其不同胁迫处理下的表达情况进行分析。生物信息学分析发现,高羊茅NRT1.1的理论等电点为4.81,平均亲小性为0.919,含有约32.63% α-螺旋、7.63% β-转角和53.73%不规则卷曲。结果表明,NRT1.1基因的cDNA序列全长为2 328 bp,编码606个氨基酸,预测蛋白质分子量为193.9 kDa,且高羊茅NRT1.1与黑麦草NRT1.1氨基酸序列的相似性最高。RT-qPCR表达分析发现,高羊茅叶片NRT1.1受低氮处理0.5~1 h时表达量达到峰值,显著(P< 0.05)高于对照组;在干旱和热处理下,NRT1.1表达量分别在6 h和12 h时达到峰值,且显著(P< 0.05)高于对照组;在盐处理下,仅在6 h时NRT1.1表达量高于对照组,其余时间均受显著(P< 0.05)抑制。本研究结果为解析高羊茅NRT1.1基因的表达模式提供了分子生物学基础。     

羟基自由基氧化对乌贼蛋白分子间作用力及结构的影响

为研究贮藏过程中蛋白质氧化对蛋白质分子间作用力的影响机理,通过建立羟基自由基(·OH)氧化体系体外模拟乌贼肉在冻藏过程中蛋白质氧化的过程,从而探究蛋白质分子间作用力与结构的变化情况。结果表明,随着·OH氧化体系中H₂O₂浓度的增加,乌贼肌原纤维蛋白分子间作用力平衡被打破,离子键和氢键含量逐渐降低,疏水作用力逐渐增强,二硫键和非二硫共价键含量逐渐增加;肌原纤维蛋白表面疏水性逐渐增加;巯基与活性巯基含量逐渐降低。应用红外光谱(FTIR)分析氧化过程中蛋白质二级结构的变化规律,结果表明,自由基对氨基酸侧链和蛋白肽链进行了攻击,随着H₂O₂浓度的增加,光谱带向不同波数方向有规律地移动,蛋白质二级结构发生变化,α-螺旋和β-折叠含量降低,β-转角和无规则卷曲含量增加。石蜡切片显示,随着H₂O₂浓度的增加,肌纤维蛋白结构趋于疏松、间隙持续增大、肌丝变细且断裂卷曲量增多。本研究为探究乌贼肉蛋白质氧化的机理提供了理论依据,为延长乌贼贮藏期、提高经济效益与食用品质等相关研究奠定了理论基础。