马来甜龙竹种胚培养增殖芽芽尖再生体系建立

为建立马来甜龙竹高效稳定的再生体系,本研究以马来甜龙竹种胚培养增殖芽的芽尖为试验材料,研究不同植物激素、有机添加物以及弱光处理对其再生体系建立的影响。结果表明,马来甜龙竹芽尖愈伤组织诱导较适宜培养基为添加0.5~1.0 mg·L^-1 NAA和3 mg·L^-1 2,4-D的MS培养基,致密颗粒状愈伤组织诱导率达61.7%;较适宜的分化培养基为添加1 mg·L^-1 6-BA、1 mg·L^-1 KT和0.25 mg·L^-1 NAA的MS培养基,10 μmol·m^-2·s^-1弱光处理6 d,分化率达46.67%,再生苗伸长生长良好;较适宜的生根培养基为添加3 mg·L^-1 IBA的1/2 MS培养基,生根率为55%,根较粗,其中部分根长有侧根。试管苗移植到混合基质中,成活率为83.33%。本研究初步建立了马来甜龙竹种胚培养增殖芽芽尖再生体系,为马来甜龙竹遗传转化体系的研究和应用奠定了基础。     

浙江省广西越桔组织培养及遗传多样性分析

为了保育浙江省广西越桔,以凤阳山的广西越桔未成熟果实为材料,开展了未成熟种子培养、离体快繁体系建立、种群增强与回归和遗传多样性分析等研究。结果表明,接种至发育培养基(WPM+活性炭2.0 g·L^-1+谷氨酰胺0.4 g·L^-1+酶水解酪蛋白0.5 g·L^-1)后,85.19%未成熟种子发育完全,接种至萌发培养基(WPM+6-BA 1.0 mg·L^-1+GA₃ 1.5 mg·L^-1)后,30.43%发育完全的种子萌发,总萌发率为25.92%。最适增殖培养基为6号增殖培养基(WPM+ZT 0.2 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1),增殖系数达106.67%,在生根培养基(WPM+IBA 1.0 mg·L^-1)上培养45 d后生根率为100%。种群增强与回归过程中植株长势良好,株高及株幅明显增加,部分植株与原生株及其他回归植株相比出现明显表型差异。遗传多样性分析结果显示,原生株与后代群体间的遗传相似系数在0.727 1~0.977 8之间,平均相似系数为0.841 0,极差为0.250 7。本研究成果可为浙江省广西越桔及相近处境珍稀植物的保育和利用提供理论与实践依据。     

川东獐牙菜体外高效再生体系的建立

为了构建川东獐牙菜(Swertia davidii Franch.)高效稳定的再生体系,以川东獐牙菜带叶茎尖、带芽茎段和叶片为材料,在单因素试验的基础上,通过完全组合及L₉(3⁴)正交试验,探究不同激素对其离体培养的影响。结果表明,川东獐牙菜3种外植体中,叶片适宜作为间接器官发生材料,在MS+2.0 mg·L^-1 6-BA+1.5 mg·L^-1 KT培养条件下,培养7 d便可见愈伤组织从切口处产生,培养30 d后即可分化出大量丛芽;不定芽在相同培养基中培养30 d后,增殖系数可达8.75。带芽茎段则适宜直接器官发生途径,其在MS +2.0 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 NAA中培养7 d后,节上腋芽开始萌动,培养30 d后腋芽发生系数可达4.06;试管苗适宜的生根培养基为MS + NAA 0.05 mg·L^-1,培养30 d后即可获得再生植株,生根率为100%;生根苗经过炼苗,移栽30 d后成活率达90%以上。在川东獐牙菜的离体培养中,间接器官发生途径较直接器官发生途径效率更高。本研究通过叶愈伤组织-不定丛芽途径建立了川东獐牙菜高效再生体系,为保护其野生资源和种苗繁育提供了技术支撑,也为其遗传转化奠定了试验基础。     

谷子高效离体再生基因型和培养基的筛选

谷子离体再生和遗传转化困难,极大地限制了其作为模式植物在功能基因组学研究和品种遗传改良中的应用。为筛选高效离体再生的谷子基因型,选取90份国内外的谷子种质资源,利用其成熟胚作为外植体进行离体再生培养。结果表明,不同基因型谷子出愈率、芽分化率和再生率差异较大;不同基因型的谷子出愈率在17.67%~93.67%之间,芽分化率在0%~78.89%之间,再生率在0%~40.00%之间。从中筛选出3份高效离体再生种质资源,分别为Y41、Y176和Y145,其离体再生效率分别为40.00%、37.33%和36.00%。3份种质资源在CIM3培养基上的出愈率最高,且愈伤质量较好,CIM3培养基配方为4.43 g·L^-1MS + 30 g·L^-1蔗糖 + 4 g·L^-1phytagel + 2 mg·L^-12,4-D + 0.5 mg·L^-1KT。本研究结果为谷子离体再生和遗传转化,以及推动谷子作为C₄禾谷类模式植物的进程奠定了一定的理论基础。     

匍匐型地被菊再生及遗传转化体系的建立

为构建有效的地被菊再生和遗传转化体系,本研究以匍匐型地被菊雨花落英叶片为外植体,研究不同苗龄和激素配比对叶盘再生的影响;通过农杆菌介导法将外源基因导入野生型植株中,研究预培养、延迟培养、抗生素浓度等遗传转化条件对转化效率的影响。结果表明,雨花落英叶盘转基因最适再生条件为,以苗龄为30 d的组培苗幼嫩叶片为外植体,设置再生培养基配方为MS+6-BA 1.5 mg·L^-1+NAA 0.8 mg·L^-1,此时再生率高达91.11%,平均芽数为5.90;最优遗传转化组合为预培养2 d,侵染5 min,共培养2 d,延迟培养5 d,之后进行选择培养。羧苄青霉素在延迟培养阶段最适抑菌浓度为400 mg·L^-1;潮霉素叶盘筛选的最适选择压为8~10 mg·L^-1,生根筛选最适浓度为11 mg·L^-1;培养后期加入6-KT可以有效提高抗性芽的再生率;调节6-BA浓度为1.0 mg·L^-1,蔗糖浓度为40 g·L^-1,可以将得到的玻璃化苗转化为正常苗。分子鉴定结果表明,15株抗性苗中有10株阳性苗,阳性苗概率为67%;与野生型植株相比,9个株系的CmERF12基因均受到了明显的抑制表达。本研究建立了地被菊雨花落英再生和遗传转化体系,为进一步进行基因功能研究和遗传改良奠定了一定的理论基础。     

黑果枸杞高效植株再生与遗传转化体系的建立

为建立高效的黑果枸杞组织培养与遗传转化体系,本研究以黑果枸杞叶片、茎节、茎段为外植体,在含有不同浓度组合的NAA和BAP培养基上进行愈伤组织和不定芽诱导比较;选择黑果枸杞叶片为材料,采用农杆菌介导法,将带有绿色荧光蛋白基因(sGFP)的双元表达载体导入黑果枸杞,探讨侵染时间和抗生素浓度对遗传转化效果的影响。结果表明,黑果枸杞的最适植株再生体系为:以叶片为外植体,MS基本培养基中添加0.5 mg·L^-1NAA和0.3 mg·L^-1BAP,愈伤组织诱导率为88.56%,不定芽诱导率为54.54%,将不定芽置于1/2MS培养基中进行生根诱导,生根率为95%;稳定高效的遗传转化体系为:农杆菌侵染液OD₆₀₀为0.25,共培养3 d,卡那霉素(kanamycin)和羧苄西林(carbenicillin)浓度分别为25和250 mg·L^-1。愈伤组织和不定芽诱导时经卡那霉素和荧光标记双重选拔,愈伤组织阳性率为85.47%,出芽生根后经PCR鉴定,阳性转化率为29%;利用实时荧光定量PCR检测转基因植株,导入的外源sGFP基因均有较高的表达水平。本研究为利用基因工程技术对黑果枸杞进行品种改良提供了技术支撑。     

糙皮侧耳产洛伐他汀发酵培养基的优化

为提高糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)液体发酵产洛伐他汀的产量,以高产洛伐他汀的糙皮侧耳菌株P380为研究对象,在单因素试验的基础上采用正交试验优化发酵培养基组成。优化后的培养基为:乳糖24.0 g·L^-1,玉米粉2.5 g·L^-1,氯化铵2.5 g·L^-1,磷酸二氢钾5.0 g·L^-1,硫酸镁2.5 g·L^-1,初始pH值6.0。通过优化培养基,可显著提高糙皮侧耳发酵培养基中洛伐他汀产量,与原始发酵培养基相比,洛伐他汀产量提高3.15倍,生物量提高1.78倍。本研究结果为糙皮侧耳发酵菌质的合理开发利用奠定了基础。     

红比利时杜鹃愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系构建及植株再生

为建立红比利时杜鹃花愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系,以嫩叶为材料,探讨了愈伤组织诱导与增殖的条件,构建并评价了愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系,同时诱导愈伤颗粒出芽、生根,并获得组培小苗。结果表明,在2.41 g·L^-1木本植物基本培养基(WPM)+20 g·L^-1蔗糖+10 g·L^-1麦芽糖+7.0 g·L^-1琼脂+0.050 mg·L^-1植物组培抗菌剂(PPM)为基本培养基的条件下,嫩叶愈伤组织诱导的生长调节剂最优方案为:0.3 mg·L^-1 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+0.3 mg·L^-1 噻重氮苯基脲(TDZ),此时愈化率可达97.78%;愈伤组织继代增殖的生长调节剂方案为:0.61 mg·L^-12,4-二氧苯氧乙酸(2,4-D)+0.65 mg·L^-1 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+1.37 mg·L^-1 TDZ,此时增殖率可达167%。将继代5次后呈疏松状的愈伤颗粒接种于液体继代培养基中,大约4~12 d后愈伤颗粒进入指数生长阶段,增殖率为45%。含有GUS基因的pRI 101-AN与含有GFP基因的pCAMBIA1301-GFP分别在农杆菌GV3101介导下转化处于指数生长期的愈伤悬浮颗粒,OD₆₀₀为0.6的农杆菌侵染液侵染15 min后,愈伤颗粒的GUS染色效率为26.28%,愈伤颗粒的GFP荧光表达效果明显。另外,以2.41 g·L^-1 WPM+7 g·L^-1琼脂+20 g·L^-1 蔗糖为基本培养基,添加2.0 mg·L^-1TDZ + 0.5 mg·L^-1 2,4-D时,可诱导愈伤组织不定芽;以1/2 Read为基本培养基,添加0.5 mg·L^-1 IBA+1 g·L^-1活性炭可诱导出芽的愈伤颗粒生根。本研究结果为进一步开展红比利时杜鹃花稳定遗传转化研究和转基因植株培育奠定了基础。     

欧洲缬草不定根悬浮培养及其有效成分的测定

为高效生产欧洲缬草有效成分,通过分析培养基pH值、碳源、糖浓度、盐浓度、总氮(N)浓度、总磷(P)浓度等因素对其不定根悬浮培养生长的影响,确定欧洲缬草不定根悬浮培养的适宜条件,并测定在该培养条件下不定根的生长状况,同时比较正常不定根、褐化不定根、无菌苗根中缬草三酯、乙酰缬草三酯和缬草烯酸3种有效成分的含量。结果表明,欧洲缬草不定根的最佳培养条件为2倍大量元素浓度、48.46 mmol·L^-1总N浓度、1.5 mmol·L^-1总P浓度的RCM培养基,添加40 g·L^-1蔗糖、0.5 mg·L^-1 萘乙酸(NAA),pH值5.7,温度25±2℃,转速100 r·min^-1暗培养,28 d后收获。最佳培养条件下的欧洲缬草正常不定根中缬草三酯、乙酰缬草三酯、缬草烯酸的含量均最高,分别为7.222、0.355、4.016 mg·g^-1,褐化不定根中成分含量显著降低,无菌苗根中成分含量最低。本研究结果可为欧洲缬草不定根及其有效成分的规模化生产提供参考。     

盐胁迫下表油菜素内酯对沟叶结缕草愈伤组织生长和再生的影响

表油菜素内酯(EBL)在促进植物生长发育及提高植物抗逆性方面发挥着重要作用。本研究以沟叶结缕草[Zoysia matrella (L.) Merr.]胚性愈伤组织为材料,采用不同浓度NaCl进行盐胁迫处理,并在不同盐胁迫下加入不同浓度的EBL,分析EBL对沟叶结缕草愈伤组织生长和再生,以及愈伤组织和再生植株叶片中过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧岐化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,当NaCl浓度≥0.6%时,沟叶结缕草愈伤组织生长受到抑制;当NaCl浓度≥0.4%时,沟叶结缕草愈伤组织再生受到抑制。在盐胁迫下,加入0.05 mg·L^-1EBL对愈伤组织生长的促进效果最显著,加入0.02 mg·L^-1EBL对愈伤组织再生的促进效果最显著。当NaCl浓度为0.6%时,经0.05 mg·L^-1 EBL处理,沟叶结缕草愈伤组织的直径增长率升高51.74%,鲜重增长率升高49.73%;当NaCl浓度为0.4%时,经0.02 mg·L^-1EBL处理,愈伤再生成苗数提高38.14%,根长≥5 mm数提高20.12%。本研究获得了耐盐性更强的沟叶结缕草植株,表明离体条件下添加EBL可有效缓解盐胁迫,促进沟叶结缕草愈伤组织的生长和再生。该研究结果为沟叶结缕草更广泛地应用于盐碱地改良提供了基础依据。     

甘露醇和蔗糖对菊花低温离体保存的影响

离体保存技术在植物种质资源保存方面具有独特优势和重要意义。为改善菊花离体保存技术,本研究以4个不同生长势的菊花品种为试验材料,在7±2℃条件下研究渗透调节物质甘露醇和蔗糖对不同菊花品种离体保存的影响,观察统计不同浓度蔗糖和甘露醇处理下菊花离体保存试管苗不同阶段的存活率和绿叶数,并对保存后试管苗的叶和茎段的组织结构、恢复生长能力和遗传稳定性进行了观察和鉴定。结果表明,保存12个月后,在MS培养基中添加15 g·L^-1甘露醇处理对南农橙乒乓和小洋菊试管苗的离体保存效果最佳,存活率分别达86.67%和93.33%;20 g·L^-1甘露醇处理对蒙娜丽莎黄和橙安娜保存效果最优,存活率分别达到80.00%和93.33%。60 g·L^-1蔗糖处理,南农橙乒乓和小洋菊保存12个月存活率均达到70%以上,但相比甘露醇处理,其绿叶数少、生长状况差;高浓度蔗糖(45～90 g·L^-1)对蒙娜丽莎黄和橙安娜保存效果不佳。保存12个月后,20 g·L^-1甘露醇处理的蒙娜丽莎黄和橙安娜、15 g·L^-1甘露醇处理的小洋菊和南农橙兵兵的叶片和茎段细胞间隙减小,细胞密度增加,试管苗恢复正常培养45 d后不同品种菊花生长良好,株高、叶片数、茎粗、节间长等形态指标及SSR分子标记图谱与对照相比无显著差异,保持了良好的遗传稳定性。本研究为菊花种质资源的低温离体保存提供了理论依据与技术支撑。     

4个鲜食葡萄品种组培快繁体系的建立

为加快鲜食葡萄苗木的繁殖速度,提高苗木品质,以鲜食葡萄品种夏黑、红地球、巨峰和玫瑰香为试验材料,通过对无菌外植体的消毒、继代和驯化等环节技术的探究,建立适用于不同鲜食葡萄品种的组培快繁体系。结果表明,以葡萄茎段作为外植体在低浓度(0.3%～0.5%)次氯酸钠溶液中消毒15 min后,接种在MS+0.2 mg·L^-1IBA+1.0 mg·L^-16-BA+0.5 mg·L^-1KT+4.0 mg·L^-1腺嘌呤+30 g·L^-1蔗糖+8.2 g·L^-1琼脂的培养基上,成活率达到87.5%;以培养基WPM添加0.2 mg·L^(-1 )IBA增殖培养兼生根诱导,组培苗生长健壮,生根效果好。采用水培方法炼苗3周后4个品种组培苗移栽成活率均达到100%。综上,完整的基础组培快繁体系可应用于科学研究及工业化大规模生产。本研究为加快鲜食葡萄的繁殖速度、提高苗木质量提供了理论依据。     

离子液体[C3mim]BF4对小白菜幼苗抗氧化特性的影响

为探讨离子液体1-丙基-3-甲基咪唑四氟硼酸([C₃mim]BF₄)对植物种子萌发、幼苗生长及生理生化的影响,采用水培法检测不同浓度(0、100、200、300、400、500 mg·L^-1)[C₃mim]BF₄条件下小白菜幼苗的生长状况、活性氧水平、抗氧化酶活性及相关抗氧化酶基因表达。结果表明,浓度高于400 mg·L^-1的[C₃mim]BF₄显著抑制种子萌发;500 mg·L^-1 [C₃mim]BF₄显著抑制幼苗生长。[C₃mim]BF₄处理使小白菜叶片活性氧$\mathop{{O}}_{2}^{{\mathop{}_{\ ·}^{-}}}$、H₂O₂)水平及丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)含量升高,且随着[C₃mim]BF₄浓度的增加均呈逐渐升高的趋势。[C₃mim]BF₄使小白菜叶片谷胱甘肽还原酶(GR)活性显著升高;浓度≤300 mg·L^-1的[C₃mim]BF₄对过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)生成有一定的促进作用,而浓度高于400 mg·L^-1 [C₃mim]BF₄处理显著抑制小白菜 APX活性,高于500 mg·L^-1 [C₃mim]BF₄处理显著抑制小白菜 CAT活性;100~500 mg·L^-1[C₃mim]BF₄处理显著抑制小白菜叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性,且各处理组的SOD活性均显著低于对照。400 mg·L^-1 [C₃mim]BF₄处理0~3 h,小白菜Gu/Zn-SOD和APX基因表达量升高,处理13 d时其SOD和APX基因表达量均显著低于对照;处理0~12 h时 CAT基因表达上调,处理24 h处理后CAT表达下调。本研究结果为揭示咪唑类离子液体毒性机理提供了理论依据。