意大利蜜蜂工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫的可变剪接基因分析

基于前期已获得的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂中肠转录组数据,在全转录组水平上对意大利蜜蜂的可变剪接基因(alternatively spliced gene, ASG)进行鉴定和分析,旨在揭示ASG在宿主响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫中的作用.在正常意大利蜜蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7CK、Am10CK)和东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意大利蜜蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7T、Am10T)样品中检测到可变剪接事件数分别为73 383、85 618、79 813和74 693次,对应的基因数分别为9 586、10 063、9 829和9 622个,平均每个ASG上发生的可变剪接事件数分别为7.66、8.50、8.12和7.76次.各样品的可变剪接事件中外显子跨越的数量最多,分别为4 411、5 247、4 993和4 629个.Venn分析结果显示,Am7CK、Am10CK、Am7T和Am10T中的共有ASG数为9 056个,特有ASG数分别为100、153、275和95个.GO分类结果显示,这些共有ASG分布在50个功能条目,特有ASG分别分布于26、30、33和24个功能条目.KEGG代谢通路富集分析结果显示,上述共有ASG富集在325个代谢通路,包括内质网蛋白加工、核糖体和RNA转运等;特有ASG分别富集在31、104、126和22个代谢通路.研究结果提供了意大利蜜蜂响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫过程中的ASG数量和种类信息,揭示宿主ASG在胁迫响应中参与了新陈代谢和细胞免疫,为关键ASG的筛选和功能研究建立了数据基础.     

意大利蜜蜂幼虫响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫的高表达基因分析

为探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫的高表达基因(HEG)的作用,利用RNA-seq技术对正常的意蜂4、5和6日龄幼虫(Am4CK、Am5CK和Am6CK)及N.ceranae胁迫的意蜂4、5和6日龄幼虫(Am4T、Am5T和Am6T)进行测序。共得到268 765 544条原始读段,经过滤得到的有效读段数为266 318 442条,各样品的Q30均在92.42%及以上。根据FPKM值≥15的标准从上述6个样品中分别筛选出2 460、2 692、2 908、2 367、2 549和2 270个HEG。Venn分析结果显示,去除与对照组共有的HEG,Am4T、Am5T和Am6T的共有HEG数为3个,特有HEG数分别为373、210和79个。GO分类结果显示,Am4T、Am5T和Am6T的特有HEG分别能够注释26、27和16个GO条目,注释基因数最多的分别是代谢进程、结合和结合。KEGG分析结果显示这些特有HEG可分别富集在145、138和68条代谢通路,富集基因数最多的分别是过氧化物酶体、碳代谢和内质网蛋白加工。进一步分析结果表明N.ceranae胁迫可导致宿主的部分物质代谢、能量代谢和免疫代谢通路水平提高。从6个样品的共有HEG中随机选取10个进行RT-PCR验证,均能成功扩增出目的条带,说明本研究中的HEG真实存在。研究结果揭示了意蜂幼虫响应N.ceranae胁迫的HEG表达谱及作用,为深入解析宿主的胁迫应答机制提供了重要信息。     

微小RNA介导意大利蜜蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的跨界调控

【目的】东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）感染意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）导致蜜蜂微孢子虫病。本研究结合前期已获得的miRNA和mRNA组学数据,通过生物信息学方法对意蜂工蜂中肠的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）靶向结合的东方蜜蜂微孢子虫的mRNA和差异表达mRNA（DEmRNA）进行预测、数据库注释和调控网络分析,以期在组学水平解析miRNA介导意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的跨界调控机制。【方法】通过比较东方蜜蜂微孢子虫侵染7 d和10 d的意蜂工蜂中肠（AmT1、AmT2）和未受侵染的工蜂中肠（AmCK1、AmCK2）的miRNA组学数据筛选出宿主的显著性DEmiRNA,通过比较侵染意蜂工蜂中肠的东方蜜蜂微孢子虫（NcT1、NcT2）和东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子（NcCK）的mRNA数据筛选出病原的DEmRNA。利用TargetFinder软件预测宿主显著性DEmiRNA靶向结合的病原mRNA和DEmRNA。利用相关生物信息学工具对上述靶DEmRNA进行GO和KEGG数据库注释。结合前期研究结果筛选出孢壁蛋白、极管蛋白、蓖麻毒素B凝集素、ABC转运蛋白、ATP/ADP移位酶和糖酵解/糖异生途径等毒力因子和能量代谢通路相关的病原DEmRNA及与其存在靶向结合关系的宿主显著性DEmiRNA,并构建和分析二者的调控网络。【结果】AmCK1 vs AmT1比较组中宿主的48条显著上调miRNA和36条显著下调miRNA分别靶向病原的1 345和1 046条mRNA;进一步分析发现,宿主的47条显著上调miRNA和34条显著下调miRNA可分别靶向NcCK vs NcT1比较组中病原的584条显著下调mRNA和265条显著上调mRNA,它们可分别注释到19和22个功能条目以及66和64条通路。AmCK2 vs AmT2比较组中宿主的56条显著上调miRNA和51条显著下调miRNA分别靶向病原的1 260和1 317条mRNA;进一步分析发现,宿主的52条显著上调miRNA和49条显著下调miRNA可分别靶向NcCK vs NcT2比较组中病原的587条显著下调mRNA和336条显著上调mRNA,它们可分别注释到20和23个功能条目以及64和65条通路。AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组的8条共同显著上调miRNA和1条共同显著下调miRNA分别靶向NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中的144条共同显著下调和10条共同显著上调mRNA,可分别注释到18和13个功能条目以及38和7条通路。此外,AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组中宿主的显著上调miRNA可靶向结合NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中与RNAi途径,孢壁蛋白和蓖麻毒素B凝集素等毒力因子,糖酵解/糖异生途径以及MAPK信号通路相关的病原下调表达mRNA。【结论】在东方蜜蜂微孢子虫的侵染过程中,意蜂工蜂中肠的DEmiRNA与病原的DEmRNA之间存在复杂的靶向结合关系以及潜在的跨界调控关系;宿主的DEmiRNA可能通过抑制或降解病原的RNAi途径、毒力因子、糖酵解/糖异生通路、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白及MAPK信号通路相关靶DEmRNA影响病原的侵染和增殖。     

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌早期胁迫的转录组学

【目的】白垩病是困扰养蜂生产的顽疾。目前,尚无利用二代测序技术研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对健康(Ac CK)及球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫的中蜂4日龄幼虫肠道(Ac T)进行深度测序,在转录组水平研究中蜂幼虫在球囊菌胁迫早期的胁迫应答。【方法】通过Illumina Hi Seq 2500平台对Ac CK和Ac T进行双端(PE125)测序,首先对测序数据进行质控和评估,利用edge R软件进行差异表达基因(DEG)分析,进而对DEGs进行GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析,最后,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Ac CK和Ac T的转录组测序共得到188 457 338条原始读段(raw reads),经过滤得到182 088 448条有效读段(clean reads),两端Q20与Q30均在97.96%和94.97%以上,说明测序数据质量良好;主成分分析(PCA)结果显示第一与第二主成分可分别解释基因表达总体差异的75.8%和10.7%;DEG分析结果显示上调基因与下调基因的数量分别为344和239个;GO富集分析结果显示DEGs共富集在36个GO分类(term)上,其中基因富集数最多的细胞(106 unigenes)、细胞组件(106 unigenes)和代谢进程(104 unigenes);KEGG代谢通路富集分析结果显示上调与下调基因分别富集在72个和45个代谢通路上,其中上调基因富集数最多的是核糖体(72 unigenes)、碳代谢(16 unigenes)和糖酵解(14 unigenes),而下调基因富集数最多的是碳代谢(9 unigenes)、二羧酸代谢(8 unigenes)和氨基酸生物合成(7 unigenes),进一步分析表明中蜂幼虫肠道的部分细胞免疫对球囊菌的胁迫产生应答,而体液免疫不产生应答,宿主的代谢相关基因受到球囊菌的显著抑制。【结论】揭示了中蜂幼虫在球囊菌入侵早期的胁迫应答,为深入解析中蜂幼虫的胁迫应答机制提供了重要信息,也为在分子水平研究关键应答基因打下了基础。     

微小RNA介导东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的分子机制

【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）纯化孢子与侵染意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂的东方蜜蜂微孢子虫的差异表达miRNA（DEmiRNA）及其靶mRNA进行系统分析,筛选、分析和探讨病原毒力因子和侵染因子相关的DEmiRNA及调控网络,在miRNA组学层面揭示东方蜜蜂微孢子虫对意蜂的侵染机制。【方法】利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对东方蜜蜂微孢子虫感染7 d和10 d的意蜂工蜂中肠和东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子（NcCK）进行深度测序,通过连续比对rRNA数据库、西方蜜蜂（Apis mellifera）基因组和东方蜜蜂微孢子虫基因组筛滤出处于侵染过程的东方蜜蜂微孢子虫（NcT1和NcT2）数据和东方蜜蜂微孢子虫孢子的测序数据。根据P≤0.05,|log₂ fold change|≥1的标准,通过比较分析筛选出各比较组中的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）。通过相关生物信息学软件对DEmiRNA进行表达谱分析,靶mRNA预测及功能和代谢通路注释,以及调控网络的构建与分析。通过Stem-loop RT-qPCR验证DEmiRNA的差异表达趋势及测序数据的可靠性。【结果】NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组分别包含164、122和60个DEmiRNA。Venn分析结果显示,3个比较组共有的上调和下调miRNA分别为5和6个。上述DEmiRNA分别预测出1 885、1 733和1 524个靶mRNA。这些靶mRNA分别注释到27、25和26个功能条目,其中注释数量最多的是新陈代谢进程、催化活性、细胞进程、结合和细胞。上述靶mRNA可分别注释到84、84和84条代谢通路,其中注释数量最多的是代谢途径、核糖体和次级代谢产物生物合成。此外,对于NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2中的DEmiRNA,分别有35、26和12个靶向结合MAPK信号通路相关靶mRNA,分别有49、40和17个DEmiRNA靶向结合糖酵解/糖异生通路相关靶mRNA。进一步分析发现,东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA参与调控蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等病原毒力因子的基因表达,以及己糖激酶、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白和转录因子ste12等侵染因子的基因表达。【结论】通过对东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子与侵染意蜂工蜂的东方蜜蜂微孢子虫进行深入细致的miRNA组学分析和探讨,解析了病原侵染过程的miRNA差异表达谱,揭示了东方蜜蜂微孢子虫可能通过调节相应miRNA的表达水平对蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等毒力因子及己糖激酶、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白和转录因子ste12等侵染因子基因表达进行调控,从而适应宿主细胞内的环境并促进自身的增殖与侵染。     

感染意大利蜜蜂工蜂的东方蜜蜂微孢子虫及其纯化孢子的高表达基因分析

为探究东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)在侵染意大利蜜蜂(Aips mellifera ligustica)过程的基因表达谱及高表基因(highly expressed gene,HEG)的功能,本研究利用RNA-seq技术对N.ceranae感染的意蜂工蜂7和10 d工蜂中肠(NcT1和NcT2)及其纯化孢子(NcCK)进行高通量测序。根据FPKM值≧15的标准筛选出各组的HEG并进行Venn分析,进而通过GO分类和KEGG代谢通路富集分析对各组的共有HEG进行功能注释。测序得到的原始读段经严格质控后分别得到5 816 465、28 501 225和210 824 312条高质量的有效读段,分别从NcT1、NcT2和NcCK中筛选出1 263、1 233和1 511个HEG,其中有1 079个基因在各组均高量表达,分别有15和7个基因仅在NcT1和NcT2中高量表达。GO分类结果显示,共有HEG涉及9个生物学进程相关条目,10个细胞组分相关条目,以及5个分子功能相关条目。KEGG代谢通路富集分析结果表明,共有HEG富集在218条代谢通路,富集基因数最多的是核糖体、Epstein-Barr病毒感染、细胞周期、内质网蛋白加工和真菌核糖体生物合成。深入分析结果显示分别有5和5个共有HEG富集在MAPK和cAMP信号通路,表明此2条信号通路及富集的HEG可能在N.ceranae的环境应激和侵染过程中发挥重要作用。研究结果提供了N.ceranae感染意蜂工蜂过程中的基因表达谱,揭示了HEG的作用,为深入解析N.ceranae的侵染机制打下了初步基础。     

胁迫中华蜜蜂幼虫肠道的球囊菌及其体外培养的高表达基因分析

利用RNA-seq技术对胁迫中华蜜蜂(简称中蜂)6日龄幼虫肠道的球囊菌及其体外培养进行深度测序,根据基因的FPKM值筛选得到高表达基因(HEGs),进而对HEGs进行GO及KEGG代谢通路(pathway)富集分析.Illumina测序数据经质控和过滤得到100814558条有效读段(clean reads),平均Q30均在93.81%以上.GO富集分析结果显示处理组(Aac T)的HEGs富集于39个GO term,基因富集数最多的是细胞(1872 unigene)、细胞组件(1872 unigene)和细胞进程(1748 unigenes);对照组(Aa CK)的HEGs富集于37个GO term,基因富集数最多的是细胞(785 unigenes),其次是细胞组件(785 unigenes)和代谢进程(776 unigenes).KEGG pathway富集分析显示,Aac T的HEGs富集在119个代谢通路上,基因富集数最多的是核糖体(176 unigenes)、碳代谢(147 unigenes)及氨基酸的生物合成(134 unigenes);Aa CK的HEGs富集在110个代谢通路上,基因富集数最多的是核糖体(179 unigenes)、氨基酸的生物合成(70 unigenes)以及碳代谢(62 unigenes).深入分析发现,对于富集在MAPK信号通路上的高表达基因数量,胁迫中蜂幼虫肠道的球囊菌远多于体外培养的球囊菌,说明病原的该通路在胁迫后期被显著激活.     

微小RNA及其介导的竞争性内源RNA调控网络在意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中的潜在作用

【目的】微小RNA（microRNA,miRNA）能够通过靶向结合导致mRNA的抑制或降解,从而对基因表达进行负调控。MiRNA在昆虫的生长、发育、免疫和细胞生命活动调控方面扮演关键角色。本研究旨在对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂中肠的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其调控网络进行深入分析,并结合前期在mRNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)组学层面的相关研究结果,系统解析中肠发育过程的miRNA差异表达谱及竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络介导的中肠发育机理。【方法】利用small RNA-seq技术对正常的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠（Am7和Am10）进行测序。将质控后的测序数据比对西方蜜蜂基因组,再将比对上的序列标签（tags）比对到miRBase数据库以鉴定已知miRNA。利用每百万标签序列（tags per million,TPM）算法对miRNA表达量进行计算和归一化处理。根据|log₂fold change|≥1且P≤0.05的标准筛选得到显著性DEmiRNA;利用相关软件进行靶mRNA的预测及GO和KEGG数据库注释。根据靶向结合关系及前期研究结果,利用Cytoscape软件对AMPK、PI3K-Akt、Wnt、cAMP、Hippo、mTOR、Toll/Imd、TGF-beta和MAPK 9条信号通路相关的DElncRNA/DEcircRNA-DEmiRNA-DEmRNA网络进行可视化;构建以miR-342-y为核心的ceRNA调控网络,进一步对网络中的靶mRNA进行代谢通路注释。利用茎环实时荧光定量PCR（Stem-loop RT-qPCR）验证测序数据及miRNA差异表达的可靠性。【结果】Am7 vs Am10比较组中共有112个显著性DEmiRNA,包括38个显著上调miRNA和74个显著下调miRNA,分别靶向结合7 434和9 559个mRNA,它们可注释到生物学进程相关的21和23个功能条目,细胞组分相关的16和17个功能条目,以及分子功能相关的10和11个功能条目;此外还能注释到果糖和甘露糖代谢、嘌呤代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等物质代谢相关的83和86条通路;内吞作用、泛素蛋白水解、黑色素生成等细胞免疫相关的10和10条通路;MAPK、Jak-STAT、NF-κB等体液免疫相关的5和5条通路;以及Hippo、FoxO、Notch等涉及生长发育的13和11条信号通路。进一步构建上述9条信号通路相关的ceRNA调控网络,分析发现意蜂中肠发育过程中DEmiRNA与DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA之间存在复杂的调控关系;DEmiRNA位于网络中心,而DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA位于网络的外周。miR-342-y在意蜂工蜂中肠和幼虫肠道发育过程中均为显著性下调表达,可靶向结合3个DEcircRNA、4个DElncRNA和327个mRNA。Stem-loop RT-qPCR结果显示4个DEmiRNA的差异表达趋势与测序结果一致,说明本研究中测序数据及miRNA差异表达趋势真实可靠。【结论】DEmiRNA可能通过参与调控物质和能量代谢通路、Hippo和Wnt等信号通路以及细胞和体液免疫通路相关基因的表达影响意蜂中肠的生长和发育;miR-182-x、miR-291-y、miR-342-y、ame-miR-6001-3p等关键DEmiRNA介导的ceRNA调控网络可能在意蜂中肠发育过程发挥重要的调控作用。     

东方蜜蜂微孢子虫孢子中长链非编码RNA的竞争性内源RNA调控网络及潜在功能

【背景】 长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度>200 nt且不具有编码能力的转录本,能够在真核生物的转录水平和转录后水平通过顺式（cis）、反式（trans）或竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）机制调控基因的表达,已被证明在生物体的生长和发育等生物学过程中发挥重要的调控作用。【目的】 结合测序得到的东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）纯化孢子的small RNA（sRNA）组学数据和前期获得的lncRNA组学数据对lncRNA的调控方式进行深入细致的分析和探讨,揭示lncRNA在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的潜在功能。【方法】 利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子进行测序,通过相关的生物信息学软件对测序数据进行质控。根据lncRNA与mRNA的位置关系预测lncRNA的上下游基因;使用Blast软件比对GO和KEGG数据库,对上下游基因进行功能和代谢通路注释;利用Target Finder软件预测lncRNA-miRNA及lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,进而通过Cytoscape v3.7.2软件对调控网络进行可视化;利用RT-PCR对调控网络中的部分lncRNA、miRNA和mRNA的表达进行验证。【结果】 东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子样品的sRNA-seq分别得到16 597 883、15 451 791和12 248 316条raw reads,经质控分别得到15 608 370、14 249 255和11 440 684条clean reads,各样品的Q30≥98.58%。共预测出lncRNA的上下游基因310个,它们可注释到代谢进程、细胞进程、催化活性、结合和细胞等相关的35个功能条目;此外还可注释到56条代谢通路,涉及嘌呤代谢、碳代谢和丙酮酸代谢等物质代谢通路,以及甲烷代谢、氧化磷酸化和糖酵解/糖异生等能量代谢通路。上述结果表明相应的lncRNA可能通过cis作用调节上下游基因的表达,从而参与调控东方蜜蜂微孢子虫孢子中的物质和能量代谢以及细胞生命活动。进一步构建lncRNA-miRNA调控网络,分析结果显示MSTRG.3636.1、MSTRG.4498.1和MSTRG.4883.1可靶向结合4个miRNA（nce-miR-7729、nce-miR-7502、nce-miR-8639和nce-miR-8565）,说明此3个lncRNA可作为ceRNA在东方蜜蜂微孢子虫孢子中发挥潜在作用。LncRNA-miRNA-mRNA调控网络分析结果显示,三者之间形成较为复杂的调控网络关系,miRNA处于调控网络的中心并联系lncRNA和mRNA,nce-miR-7502和nce-miR-8639结合的mRNA最多,达到28个;与MSTRG.3636.1、MSTRG.4498.1和MSTRG.4883.1存在靶向关系的miRNA结合多个mRNA,表明上述3个lncRNA可能通过ceRNA机制发挥作用,从而影响东方蜜蜂微孢子虫孢子中的新陈代谢和生命活动。【结论】 lncRNA可能通过cis作用调控上下游基因的表达,以及作为ceRNA通过吸附miRNA间接影响靶基因的表达,从而参与调节东方蜜蜂微孢子虫孢子中的物质和能量代谢等基本生命活动。     

枯草芽孢杆菌NCD-2对棉花根系分泌物L-脯氨酸响应的转录-蛋白质组学联合分析

【目的】棉花根系分泌物L-脯氨酸是影响生防菌株定殖的关键因素之一,前期研究发现L-脯氨酸能够提高枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NCD-2生物膜形成能力。通过高通量测序技术分析L-脯氨酸调控枯草芽孢杆菌NCD-2生物膜形成和生防潜力相关的基因,为深入认识棉花根系分泌物与生防菌株的分子互作关系打下基础。【方法】以枯草芽孢杆菌NCD-2菌株为供试材料,外源添加浓度为10 mg·mL^-1的L-脯氨酸共培养24 h后,分别进行转录组（RNA-seq）和同位素标记相对定量蛋白质组技术（iTRAQ）分析,对所获得的转录组和蛋白质组数据进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证不同代谢通路中部分差异基因的表达情况。 【结果】转录组分析发现,L-脯氨酸和NCD-2菌株共培养后,获得1 071个差异表达基因（DEG）,其中602个基因上调,469个基因下调。GO分析发现在生物过程、细胞组分和分子功能方面分别有49、14和30个功能条目显著富集。KEGG代谢通路主要富集在化合物代谢、鞭毛组装、细菌运动和趋化作用。蛋白质组学分析发现,筛选到211个差异表达蛋白（DEP）,其中118个蛋白上调,93个蛋白下调。GO分析发现在生物过程和分子功能方面分别有13和8个功能条目显著富集。KEGG代谢通路主要富集在氨基酸代谢、碳水化合物类代谢、鞭毛组装和ABC转运蛋白。进一步转录-蛋白质组学联合分析发现,在L-脯氨酸作用下,检测到共有的显著差异表达基因（或蛋白）112个,其中38个基因（或蛋白）下调,74个基因（或蛋白）上调。GO功能显著富集主要集中在营养库活性、催化活性、细胞膜、定位、细胞脂质代谢过程、氧化还原过程、sigma因子活性、转运活性、芽孢形成9个方面。KEGG代谢通路主要富集在能量代谢、ABC转运蛋白、抗生素生物合成、鞭毛组装、运动或趋化作用和双组分系统方面。RT­qPCR验证了26个差异表达显著基因,结果发现在表达量上存在一定的差异,但表达趋势与RNA­seq和iTRAQ组学分析结果基本一致。【结论】棉花根系分泌物L-脯氨酸与枯草芽孢杆菌NCD-2之间的互作存在一个复杂的生物过程,依赖于不同代谢通路网络中的多个基因。双组分系统、抗生素生物合成、能量代谢、运动或趋化作用、鞭毛组装和ABC转运蛋白通路中的差异基因（或蛋白）可能在棉花根系分泌物与枯草芽孢杆菌互作过程方面发挥着重要作用。     

利用RNA-Seq发掘玉米叶片形态建成相关的调控基因

【目的】叶片宽度和长度等叶形特性是决定植株形态,进而影响种植密度的重要农艺性状,通过转录组测序技术筛选并挖掘玉米叶片形态建成相关的代谢路径及调控基因,为深入认识叶片发育的分子机理和鉴定叶宽、叶长候选基因奠定基础。【方法】以极端窄叶自交系NL409和宽叶自交系WB665为材料,利用RNA-Seq技术鉴定7叶期第七片叶近基部的差异表达基因（DEGs）,通过生物信息学分析,筛选与叶片发育密切相关的代谢通路,利用qRT-PCR验证不同激素路径叶形相关基因的表达结果,并结合启动子区域的序列差异挖掘叶形功能基因。【结果】分析对照（WB665）和样品（NL409）高通量测序结果,在叶宽形成关键部位共筛选出5 199个DEGs,其中,2 264（43.55%）个基因表达上调,2 935（56.45%）个基因下调表达,下调基因明显多于上调基因;GO功能富集分析表明,差异基因主要富集在细胞膜相关的细胞组分中,涉及代谢过程和细胞响应刺激;KEGG富集分析表明,差异基因主要参与到核糖体、植物激素信号转导、苯丙烷类代谢、乙醛酸和二羧酸代谢等过程,其中核糖体、植物激素信号转导、鞘脂类代谢下调表达基因较多的路径与叶片发育密切相关。核糖体路径富集到多个PRS（PRESSED FLOWER）基因,分析发现PRS13（PFL2）可能在调控窄叶发育过程中发挥重要作用。鞘脂代谢路径富集的基因几乎全部下调表达,引起抑制叶片发育的AP1（APETALA1）类和MAPK（Mitogen-Activated Protein Kinase）类基因上调,以及促进叶片发育的LFY（LEAFY）下调,与窄叶发育受抑制的表型一致。植物激素信号转导路径富集到的油菜素内酯（BR）响应基因和赤霉素（GA）代谢基因下调,细胞分裂素（CTK）和大部分生长素（Auxin）响应基因上调,与窄叶中DELLA蛋白基因上调表达,抑制GA并促进CTK基因表达的作用模式一致。通过qRT-PCR对18个叶片发育相关基因进行分析,结果表明,其表达趋势与转录组结果一致,分析发现BR相关的ROT3、Auxin相关的NAL7-like、AGO7-like以及TCP类转录因子CYC/TB1等基因与窄叶的形成密切相关。【结论】明确了一些与玉米叶片发育密切相关的代谢路径,还发现植物激素间的动态平衡对叶片发育有着重要影响,尤其是生长素与油菜素内酯、细胞分裂素与赤霉素之间的相互作用对调控叶片形态可能发挥重要作用。     

人工劣变处理对玉米种胚差异基因表达的影响

【目的】利用数字基因表达谱技术（digital gene expression tag profiling,DGE）探索人工控制劣变（controlled deterioration treatment,CDT）条件下玉米种胚差异基因的表达变化,为揭示种子劣变的分子机理提供依据。【方法】以玉米杂交种郑单958种子为材料,采用高温（45℃）高湿（相对湿度100%）方法处理72 h,以未处理材料为对照,利用DGE分别进行高通量测序,测序结果与参考基因组和参考基因数据库比对获得表达基因,利用RPKM（Reads Per Kb per Million reads）方法计算基因的表达量,根据FDR（false discovery rate)<0.001和|log2 ratio(T/CK)|≥1的标准筛选差异表达的基因,对获得的差异表达基因（digital expression genes,DEGs）进行GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库功能注释,并对注释结果进行富集分析处理。【结果】对照玉米种胚中检测到32 000多种mRNAs。CDT处理后差异表达基因有4 713个。其中上调表达2 874个,下调表达1 839个。GO富集分析表明,这些基因涉及细胞组分、分子功能和生物学过程方面,其编码的蛋白主要分布在细胞器和细胞膜上,参与能量代谢、信号转导、刺激响应和衰老死亡等过程,具有结合、催化和抗氧化等功能。这些基因中,能被KEGG数据库注释的有2 470个,参与了288条代谢通路,其中有16条通路存在着显著性富集。这些通路中,参与能量代谢的基因共有113个,分别参与糖酵解/糖异生过程（59个）、磷酸戊糖途径（31个）和丙酮酸代谢过程（50个）;其中,调节糖酵解/糖异生过程的烯醇化酶基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因等、丙酮酸代谢中的丙酮酸激酶基因等和磷酸戊糖途径中的α-L-岩藻糖苷酶基因等上调幅度最大。还发现,调节NADH代谢相关的基因有25个（9个上调,16个下调）;NADPH代谢的有10个（4个上调,6个下调）。这些基因的表达变化能够调节活性氧的产生和积累。【结论】DGE可以作为研究种子劣变和活力丧失的有效手段。CDT能够影响玉米种胚差异基因的表达,进而影响细胞能量代谢相关过程,主要表现在糖酵解途径受到抑制,导致ROS产生和积累,从而加速玉米种胚细胞的衰老及死亡,最终造成种子的劣变和活力丧失。在这个过程中,差异表达基因可能扮演重要角色。