能量水平和来源对后备母猪卵母细胞质量及相关基因表达的影响

选择初始体质量（59±4．2）kg的长白×大白杂交母猪54头,采用3×2试验设计,研究日粮能量水平和来源对后备母猪卵泡发育和卵母细胞体外成熟以及排卵前卵丘-卵母细胞复合物（COCs）中生长分化因子-9（GDF-9）、骨形态发生蛋白-15（BMP-15）、促黄体素受体（LHR）、促卵泡素受体（FSHR）mRNA表达的影响。3个能量水平分别为NRC推荐能量需要的87．5％、100％和112．5％;每个能量水平分别以淀粉和油脂为主要能量来源。试验母猪在第2个发情期的第19天屠宰。结果表明：随能量水平升高,大卵泡数增多（P〈0．05）,能量来源对卵泡数量没有显著影响（P〉0．05）;高能量水平下卵丘扩散程度（P〈0．05）和卵母细胞成熟的比例最高（P〈0．01）,能量来源对卵丘扩散程度影响差异不显著（P〉0．05）,淀粉组卵母细胞成熟的比例高于油脂组（P〈0．05）;基因分析表明,饲喂低能量水平组的GDF-9和BMP-15mRNA的表达量最高（P〈0．05）,淀粉组上调GDF-9mRNA的表达（P〈0．05）,能量来源对BMP-15mRNA表达影响差异不显著;各处理小卵泡的卵丘-卵母细胞复合物中GDF-9和BMP-15mRNA表达量高于大卵泡（P〈0．01）;高能量水平组的LHR和FSHRmRNA表达量最高（P〈0．05）,能量来源对大卵泡卵丘-卵母细胞复合物中FSHRmRNA表达无显著影响,淀粉组上调LHRmRNA表达（P〈0．05）。研究表明,提高日粮能量水平增加母猪排卵前大卵泡数量和卵母细胞成熟的比例,以淀粉为能量来源对卵泡数量没有显著影响,但提高了卵母细胞成熟的比例;能量影响卵泡数量和卵母细胞成熟可能与GDF-9、BMP-15和LHR、FSHRmRNA表达有关。     

BMP-15基因研究进展

骨形态发生蛋白15(BMP-15)属于生长因子β(TGFβ)超家族成员,仅在卵母细胞中表达,对卵泡生长发育和生殖功能等方面有着重要影响.近年来,BMP-15基因的研究取得了较大进展,本文综述了BMP-15基因与繁殖性能、产仔数性状和疾病的关系,及其与GDF-9基因的协同作用.     

GDF-9基因真核表达载体的构建及其对牛卵丘细胞扩展相关基因表达的影响

为构建牛生长分化因子9(GDF-9)基因真核表达载体,观察GDF-9基因真核表达载体转染牛卵丘细胞后对卵丘扩展相关基因表达的影响,试验在质粒pcDNA4 myc-his的多克隆位点插入GDF-9基因构建真核表达载体pcDNA4 myc-his-GDF-9,用脂质体转染牛卵丘细胞,利用Western blotting检测了GDF-9蛋白的表达量,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测牛卵丘细胞中卵丘扩展相关基因的表达量.结果发现,转染了pcDNA4 myc-his-GDF-9的牛卵丘细胞中检测到GDF-9蛋白的表达,且牛卵丘细胞扩展相关基因PTGS2、PTX3和HAS2的表达量显著提高(P< 0.05),表明牛pcDNA4 myc-his-GDF-9可有效地转染到牛卵丘细胞中,该试验结果为进一步研究GDF-9基因的功能奠定了基础.     

牦牛生长分化因子-9基因cDNA克隆及序列分析

根据GenBank中普通牛生长分化因子9(GDF-9)基因序列(AF 307092)设计1对引物,以麦洼牦牛卵母细胞总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛GDF-9基因cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:所克隆的1399 bp片段为预期的牦牛GDF-9基因cDNA序列,包含由2个外显子组成的全编码区和3′-下游部分序列.牦牛GDF-9基因编码区核苷酸序列长度为1362 bp,编码453个氨基酸,与GenBank中报道的普通牛、水牛、绵羊、山羊相应序列一致,而与人和黑猩猩存在差异.和普通牛相比,牦牛GDF-9基因编码区存在1处碱基转换(C→T),导致相应的氨基酸由丙氨酸(A)转换为缬氨酸(V).牦牛与普通牛、水牛、绵羊、山羊、人和黑猩猩的核苷酸同源性分别为99.9%、98.4%、97.0%、96.8%、85.6%和85.1%;氨基酸同源性分别为99.8%、97.1%、95.1%、95.4%、79.4%和79.5%.利用NJ法和MP法以该基因编码区核苷酸序列构建的物种间分子系统进化树结果基本一致,即牦牛与普通牛先聚为一类,再与水牛聚为一类,而后与绵羊和山羊聚为一类,最后与人和黑猩猩聚为一类.该聚类结果与物种间遗传距离大小一致,也与各物种在动物学上的分类相吻合,表明GDF-9基因编码区适用于构建物种间系统进化树.     

生长分化因子8在动物生殖过程中的作用

生长分化因子8(Growth differentiation factor 8,GDF-8),又名肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN),是转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)超家族中的一员,主要参与肌肉发育的负调控。近期研究发现GDF-8还参与生殖活动。本文通过了解GDF-8在生殖系统中的表达与定位,探索GDF-8在生殖配子的形成与胚胎发育中的作用,分析其对生殖活动的影响等方面,提出GDF-8基因不仅对于动物肌肉的生长发育有调控作用,而且在生殖活动方面也具有重要作用。本文为多角度认识GDF-8的生理与病理功能及其在生命活动中的作用提供新思路。     

牛卵泡发育相关下调基因的筛选

为寻找牛卵泡颗粒细胞(GCs)凋亡的关键调控因子,阐明单胎动物卵泡闭锁调控机理,本研究对奶牛优势卵泡与从属卵泡GCs深度测序,筛选卵泡发育相关的下调基因。选取健康荷斯坦奶牛,屠宰后,分别采集卵巢上正常发育的最大卵泡(8～10 mm)与第二大卵泡(5～8mm),并结合雌激素/孕激素确定卵泡优势与否,优势卵泡(DF):E_2/P1;从属卵泡(SF)E_2/P1。分别刮取GCs,提取总RNA并建库,Illumina测序,将获得序列与牛Refseq数据库比对后,利用DESeq2软件对获得的RNA进行差异表达分析,并对其中表达下调的基因进行GO和KEGG信号通路分析,最后通过Real-time PCR对筛选出的表达下调基因进行验证。测序共获得32 346个基因,其中194个在DF中表达显著上调,502个表达下调;GO分析结果显示,这些下调基因的生物学功能共分为3大类104组,其中生物学过程相关基因占61.5%,细胞组分有关基因占25.0%,分子功能相关基因占13.5%;KEGG信号通路分析,共发现5条通路,其中基因富集最为显著的是癌症通路;从下调基因中筛选出4个在牛卵泡发育过程中可能会起抑制作用的基因,QRT-PCR结果显示,PPP1R14A、QRFPR和EGR1在DF和SF中的表达趋势与深度测序结果一致,OLA1在DF和SF中的表达趋势与深度测序结果正好相反,但差异不显著。本研究筛选出的4个表达下调基因可能是牛卵泡发育过程中抑制卵泡发育的候选基因。     

水牛水通道蛋白9基因克隆及其表达分析

本研究旨在对水牛水通道蛋白9 (aquaporins 9,AQP9) 基因进行克隆,并对其在水牛不同组织中的表达规律及其在水牛卵巢和睾丸组织中的表达差异进行探索。根据GenBank上黄牛AQP9基因序列(登录号:NM_001205833.1)设计特异性引物,以水牛睾丸组织cDNA为模板,应用RT-PCR方法扩增AQP9基因编码区片段;运用生物信息学方法分析其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质;应用实时荧光定量PCR技术分析AQP9基因在水牛组织中的表达情况;免疫组织化学方法分析AQP9蛋白在不同发育阶段水牛卵泡及睾丸组织中的表达差异。结果表明,克隆获得了888 bp的水牛AQP9基因编码区序列,其编码295个氨基酸。多重序列比较显示,水牛AQP9核苷酸序列与牛、猪、绵羊和人相应序列相似性分别为99%、90%、97%、88%;氨基酸序列的同源性分别为99%、86%、97%、83%,系统进化树分析结果推测,AQP9基因在物种进化过程中具有高度保守性。实时荧光定量PCR结果显示,AQP9基因在水牛肝脏、肺脏、大脑、皮肤、睾丸和卵巢组织中有不同程度的表达,在肝脏组织中表达最高,皮肤和睾丸次之,肺脏和卵巢表达较低。免疫组化结果显示,在卵巢组织中,AQP9蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,并随着卵泡发育其表达逐渐增强;在睾丸组织中,AQP9蛋白在各级精母细胞和间质细胞中均有表达。结果提示,成功克隆得到水牛AQP9基因序列;AQP9在水牛卵巢和睾丸中的表达及其功能可能与水牛卵泡发育和精子发生有重要的关联。     

生长分化因子9基因的研究进展

转化生长因子β（TGF－β）超家族成员对卵巢卵泡的发育起着重要的作用，在这个超家族中发现1个新成员生长分化因子（GDF－9），它对早期卵泡和卵母细胞的生长是必需的。本文主要阐述了生长分化因子9基因结构和功能、基因克隆以及在小鼠、人类和绵羊卵巢中的作用机理，并讨论了该基因对繁殖性能的影响。     

水通道蛋白在哺乳动物卵泡发育过程中作用的研究进展

水通道蛋白(AQPs)是一类分布广泛的能促进水转运的小分子跨膜蛋白家族。作为细胞膜表面通道分子,水通道蛋白不仅对小分子类物质及水等有运输作用,还广泛参与哺乳动物生殖细胞发生及生殖调控等重要过程。研究发现,在哺乳动物卵泡发育过程中,卵泡形成和成熟、卵泡液的转运、窦腔形成、卵泡闭锁等均与水通道蛋白基因的表达及调节密切相关。文章对水通道蛋白基因及其在哺乳动物卵泡发育中的作用进行综述,并就其在卵泡发育及闭锁机制方面提出设想。     

BMP4诱导的Smad9在小鼠卵泡发育中的作用及其机制的初步研究

本研究旨在探讨Smad9在小鼠卵泡发育中的作用,为卵泡生长发育及其调控机制的研究提供新思路。将6周龄的雌性昆明小鼠随机分成3组,分别腹腔注射生理盐水、骨形态发生蛋白-4(BMP4)和Smad9抑制剂(LDN-193189),依次作为对照组、BMP4组和LDN组。48h后收集卵巢制作石蜡切片,HE染色后观察卵泡发育情况并对各级卵泡进行计数;采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测Smad9蛋白和mRNA水平。同时通过ELISA试验测定各组小鼠血清中雌二醇(E2)、孕酮(P4)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)和芳香化酶等的浓度,并检测了CYP19a1、LHR、PRLR和FSHR基因的表达情况,进一步探究Smad9可能的作用机制。结果显示,与对照组相比,BMP4组Smad9蛋白和mRNA水平较高,而LDN组较低;BMP4组有腔卵泡显著增加(P0.05),而LDN组显著减少(P0.05)。此外,ELISA试验结果显示,BMP4组血清E2、FSH和芳香化酶含量增加,而P4和LH含量降低;LDN组中E2和芳香化酶的含量降低。实时荧光定量PCR结果显示,BMP4组FSHR和CYP19a1基因的mRNA水平升高,而LHR和PRLR基因的mRNA水平降低;LDN组PRLR基因的mRNA水平升高,而CYP19a1基因的mRNA水平降低。由以上试验结果可以得出,BMP4诱导的Smad9能促进小鼠有腔卵泡的发育,而其可能主要通过影响E2、PRL和芳香化酶等的产生而起作用。     

Construction of Eukaryotic Expression Vector of GDF-9 Gene and its Effect on the Expression of Expansion-related Genes in Bovine Cumulus Cells

The objective of the study was to construct the eukaryotic expression vector of bovine GDF-9 gene,and investigate its effect on the expression of expansion-related genes in transfected bovine cumulus cells.Eukaryotic expression vector plasmid pcDNA4 myc-his-GDF-9 was constructed by insert GDF-9 in the multiple cloning site.pcDNA4 myc-his-GDF-9 was transfected into bovine cumulus cells by liposome.The expression of GDF-9 gene was detected by Western blotting and the expression of the expansion-related genes in bovine cumulus cells was detected by qRT-PCR.The results showed that GDF-9 could express in transfected bovine cumulus cells and the expression of expansion-related genes PTGS2,PTX3 and HAS2 in transfected bovine cumulus cells were significantly increased (P< 0.05).In a conclusion,the bovine pcDNA4 myc-his-GDF-9 could effectively transfected into bovine cumulus cells,which could help to study farther functions of the GDF-9 gene.     

Promotion of ovarian follicular development by injecting vascular endothelial growth factor (VEGF) and growth differentiation factor 9 (GDF-9) genes

Ovarian follicular development in mammals is the complex process including endocrine, paracrine and autocrine. There is the development of four basic stages of ovarian follicles, i.e. the primordial, primary, secondary and tertiary or Graafian follicles. There are few blood vessels in the cortical area where primordial and primary follicles are assembled. The development of these follicles is stimulated by oocytes derived factor including growth differentiation factor 9 (GDF-9) or bone morphogenetic protein 15 (BMP-15). Porcine GDF-9 complementary DNA (cDNA) cloned, and then injected its gene into the ovary in gilts. The injection of porcine GDF-9 gene resulted in an increase in the number of primary, secondary and tertiary follicles, concomitant with a decrease in the number of primordial follicles, indicating that exogenous GDF-9 can promote early folliculogenesis in the porcine ovary. On the other hand, the development of antral follicles is associated with increased density of blood vessels within the theca cell layers surrounding the follicles. A recent study reported that vascular endothelial growth factor (VEGF) play an important role in the process of thecal angiogenesis during follicular development. To investigate whether additional induction of thecal angiogenesis would support subsequent follicular development, miniature gilts were directly injected VEGF gene into the ovary. Injection of VEGF gene increased the levels of mRNA expression of VEGF 120 and VEGF 164 isoforms in the granulosa cells and VEGF protein contents in the follicular fluid. The number of preovulatory follicles and the capillary density in the theca interna increased significantly in the ovaries injected with VEGF gene compared with those treated with eCG alone, indicating that the regulation of thecal angiogenesis during follicular development is a very important factor in the development of ovulatory follicles. This technique may be an innovative technique for enhanced induction of follicular development in the ovary through gene and hormonal treatment, which may lead to prevention of infertility caused by ovarian dysfunction.     

肌肉生长抑制素基因在不同动物中的研究进展

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因也叫生长分化因子(growth differentiation factor-8,GDF8),其作为肌肉生长发育及分化的负向调控因子,可通过抑制正向调控因子--生肌决定因子(myogenic determination gene,MyoD)的转录活性来抑制成肌细胞的增殖和分化。MSTN基因在进化过程中具有较高的突变性,在不同动物中的表达量和表达范围均不相同。作者就该基因的表达、生物学功能、作用机制及在不同动物中的研究进展进行了详细阐述。     

绵羊排卵率相关基因的研究进展

文章综述了与绵羊排卵率相关的主效基因和候选基因,主要包括FecX1、FecXH、FecX2W、FecB、GDF-9、FecG(E)、BMPR-IB、BMP-15等基因的最新研究进展,并阐述了其对绵羊繁殖率的影响。     

Differential expression of bone morphogenetic protein 4-6 (BMP-4, -5, and -6) and growth differentiation factor-9 (GDF-9) during ovarian development in neonatal pigs

Growth differentiation factor-9 (GDF-9) and bone morphogenetic proteins (BMPs), comprise the largest subgroups of ligands in the TGF-β superfamily, and have been shown to be involved in follicle development in mammals. However, whether these factors are involved in folliculogenesis in pigs is still unknown. The present study was performed to determine the relationships between early folliculogenesis and the expression of GDF-9 and BMP (BMP-4, -5 and -6) mRNAs in neonatal pigs. Ovaries were removed at 5, 16, 28 and 39 days after birth to examine the follicular population (the right ovary of each animal) and to detect mRNA expression (the left ovary of each animal). Primordial follicles accounted for >80% of the ovarian follicles from 5 days until 39 days after birth. A marked increase in primary follicles and the appearance of secondary follicles were observed in the ovaries at 28 days after birth. BMP-4, -5, and -6 and GDF-9 mRNAs were expressed by ovaries at 5-, 16-, 28- and 39-day-old pigs. The peak expression of BMP-4, -5, and -6 and GDF-9 mRNAs was observed in the ovaries at 5, 39, 28 and 16 days, respectively, after birth. These data demonstrate that folliculogenesis in piglets might be controlled by the interaction with these factors. We conclude that BMPs and GDF-9 may have distinct functions in several stages of follicle development in neonatal pig ovaries.     

鸡GDF-5基因外显子1多态性与鸡骨骼发育性状的相关研究

根据GenBank发表的鸡GDF-5基因的mRNA序列设计引物，以白耳鸡和东北农业大学选育的肉鸡高、低腹脂系第8世代鸡群为试验材料，通过测序和PCR-SSCP的方法进行SNP检测和基因型分析，探讨GDF5基因多态性与鸡生长和骨骼发育性状之间的关系。结果发现在GDF-5基因外显子1的84bp处存在1个C／T的突变位点，对该突变位点在研究群体中进行基因型分析，结果产生3种基因型，AA型个体的基因序列和GenBank（Accession No：AF123389）中的一致为C，而BB型个体的基因序列在84bp处突变为T。基因型与鸡体组成性状的统计分析结果表明，AA基因型个体的跖骨围显著高于AB基因型个体（P〈0．05）；AA基因型和AB基因型个体的跖爪重和跖爪率显著高于BB基因型个体（P〈0．05）；AB基因型个体的股骨长和股骨重显著高于BB基因型个体（P＜0．05）；表明该基因对鸡的骨骼性状有较大的影响或与控制骨骼发育性状的主效基因相连锁。     

影响瘦肉率的主基因及其分子标记的研究进展

近年来，影响瘦肉率及其相关的分子标记研究有一个巨大的飞跃，除已有较深入研究的氟烷基因外，还有肥胖基因及其受 体基因，胰岛素样生长因子2基因，肌肉生长和抑制素基因及脂肪酸结合蛋白基因等，本文综述了上述后4种基因的研究现状与前景，同时还简述了其他一些基因如肌浆蛋白基因，垂体特殊转录因子基因，原癌基因，激素敏感脂肪酶基因等。     

猪生长分化因子11的原核表达及抗体制备

本研究旨在获得猪GDF-11的特异性抗体,以便于进一步研究猪GDF-11的功能.对猪GDF-11的编码区进行了克隆、表达载体的构建和转化、原核诱导表达和纯化以及将GDF-11注射到小鼠中并分离抗体.从猪胚肾中分离总RNA,经RT-PCR扩增得到猪GDF-11基因的编码区,插入pMD18-T载体中.再经限制性内切酶BarnH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切,将回收的GDF-11酶切片段插入原核表达载体pGEX-4T-2中,获得重组原核表达质粒pGEX-4T-2-GDF-11.重组质粒经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导产生了65 ku的GST-GDF-11融合蛋白.融合蛋白经凝血酶酶切,分离纯化出42 ku左右的GDF-11蛋白;然后注射小鼠,制备了多克隆抗体,其滴度最高可达1:25 600,而且特异性好,表明得到了猪GDF-11的多克隆抗体.     

动物肌肉生长发育调控的功能基因研究进展

成肌细胞的增殖和分化是受生肌决定因子 (MyoD)调控 ,生肌决定因子包括 4个基因 ,MyoDl(myf3)、Myogenin(MyoG)、Myf5、Myf 6 (herculin或MRF4 )。MyoD家族基因属于碱性螺旋 环 螺旋 (bHLH)转录因子 ,它能激活肌肉生成的特定基因。肌细胞生长抑制素 (MSTN ,Myostatin ,又称GDF 8) ,属于转化生长因子超家族 ,它通过负向控制肌细胞的生长发育 ,GDF 8基因缺失的小鼠表现出比正常小鼠具有“双肌现象”。