对转蚕丝芯蛋白轻链基因棉花的分析

利用根癌农杆菌介导转化法,将棉纤维特异表达启动子GAE6-3A驱动的蚕丝芯蛋白轻链基因（FBN）转入陆地棉R15中。T₀代转基因再生株FNB基因PCR检测阳性率达70%。随机选取4个转基因株系T₁代材料的Southern杂交显示,3个为双拷贝插入、1个为单拷贝插入;Northern分析结果证实FBN基因在转基因棉纤维中表达。转基因后代的纯合选育主要以田间卡那霉素检测结合实验室内GUS组织化学检测进行,其中4个株系已获得了T₃代转基因材料,其他若干个转化子也获得T₁代和T₂代的不同材料。对6个转基因棉花株系后代纤维检测结果表明,蚕丝芯蛋白轻链基因对棉花纤维品质的影响主要体现于对纤维强度的改良。H18、H32、H34株系转基因棉花后代纤维强度较对照显著提高,其中H18纤维强度提高12.3%。     

转Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析

在分离克隆抗白叶枯病基因Xa23研究中获得大量转基因水稻材料。为了系统研究转Xa23基因水稻的抗病稳定性和遗传模式, 本文通过逐株进行抗白叶枯病接种鉴定、PCR和Southern blot分子检测, 对一批转Xa23基因水稻植株进行了T₀代到T₂代的跟踪分析。结果表明, Xa23基因的整合和表达, 使感病受体品种牡丹江8号获得抗病性。由于Xa23基因插入受体基因组的位点不同, 同是单拷贝插入的转基因T₀代抗病植株, 其抗病程度有明显差异。T₀代植株的抗病程度, 可以准确、稳定地遗传到T₁代和T₂代。单拷贝转基因植株分离群体的抗感植株分离比接近3∶1, 表明转Xa23基因遵循孟德尔单基因遗传模式。已获得2个纯合的单拷贝转基因抗病株系, 它们的抗病程度稍有差别, 将用于外源基因插入位置效应分析和杂交稻抗病育种。     

BCL、RIP细胞凋亡基因向小麦中的导入和赤霉病抗性鉴定

利用农杆菌介导法将BCL和RIP 2个与细胞凋亡有关的基因分别导入了小麦品种扬麦10号和Bobwhite,转化效率分别为1.60%和1.25%。Southern检测结果表明,细胞凋亡基因已稳定整合到小麦染色体上,多数植株为单拷贝整合。Northern检测结果表明,细胞凋亡基因能以小麦遗传背景高水平转录为RNA。转基因植株T₁代分离比例为2.11～2.33∶1,表明外源基因在后代中能够稳定遗传。BCL转基因植株和RIP转基因植株对赤霉病均表现出一定抗性,其中BCL-20、BCL-21、RIP-8、RIP-18等15个T₁代植株的小穗发病率为5.6%~16.1%,可望进一步培育抗小麦赤霉病新材料。     

玉米ppc基因过表达对转基因水稻光合速率的影响

通过转基因技术将外源ppc基因导入水稻以期增加产量是国内外的重要研究领域。然而,关于ppc基因过表达能否提高转基因水稻的光合速率至今尚无定论。本研究将玉米ppc基因导入水稻中花8号,获得大量转基因水稻植株。经PCR筛选、PEPC活性测定、Southern和Western杂交分析,表明玉米ppc基因已经整合到受体水稻基因组中,并得到了正确和高效的表达。测定了温室内种植的T₁代6个PEPC活性不同的转基因水稻植株的光合速率,只有活性最高的株系的光合速率显著增加,增加的幅度为27.3%。在旱作栽培条件下测定了T₃代33个转基因株系的光合速率,结果表明在高温、高光强下,绝大多数转基因水稻的光合速率增加,最大提高了68.8%。比较6个转基因株系的T₁和T₃代看到,逆境胁迫条件下转基因水稻光合速率明显提高。以上结果表明水稻中导入ppc基因可以提高其光合速率,特别是逆境条件下的光合速率。     

花粉管通道法转化大豆的分子表征

采用花粉管通道技术将含有gus基因的pBI121质粒DNA导入辽豆14，从处理的100朵花中获得53粒种子。经PCR检测53粒种子的幼苗，共检测出6株阳性植株。采用RT—PCR和GUS组织化学染色法对所获得阳性植株进行检测，其中2株幼苗(T0代17号和33号)均出现阳性结果，进一步对这2株阳性植株进行Southern blot检测，同样获得了阳性结果。上述检测结果表明，gus基因已整合到染色体上并得到了表达。对转基因植株后代进行了PCR跟踪检测，结果从17号株系的28株中检测出19株阳性植株，33号株系的35株幼苗中检测出17株阳性植株，表明gus基因可以在转基因植株后代遗传。本研究结果为大豆花粉管通道转化技术提供了比较充分的分子生物学证据。     

农杆菌敏感小麦基因型的筛选及其转化

利用C58c1农杆菌菌株（其携带的pPTN290质粒载体上含有nptⅡ 基因和GUS基因）为供体材料和小麦幼胚为受体材料,对我国35个春小麦基因型进行了农杆菌敏感性研究和转化研究。组织化学染色结果表明,PM97034、P187、巴140105、扬麦158、新春9号和克丰6号等基因型农杆菌感染后GUS基因瞬时表达率达到了15.0% ~ 30.0%,显著高于模式基因型Bobwhite。其余幼胚分别在含10-25mg/L G418培养基上诱导愈伤组织和分化植株,抗性再生植株经ELISA检测、PCR检测、叶片离体退绿检测、X-Gluc染色检测和Southerm blot检测,最终从新春9号和PM97034的农秆菌转化效率高于Bobwhite. Southerm blot检测结果同时表明,外源基因在多数转基因植株中表现为单拷贝整合。T₁代植株ELISA检测结果和PCR检测结果表明,外源基因在个别株系中的分离符合孟德尔遗传规律,而在多数株系中的分离偏离了孟德尔遗传规律。阳性植株与阴性植株分离比经X²。适合性检测,表明外源基因在多数株系中的遗传符合3：1分离规律。本文首次对不同小麦基因型进行了农秆菌敏感和转化效率研究,筛选到新春9号和PM97034两个对农杆菌比较敏感且转化效率比较高的基因型,可望广泛用于小麦转基因研究。     

小麦类甜蛋白基因的转化及转基因植株的抗病性分析

目前已克隆出许多类甜蛋白基因并成功转化马铃薯、水稻和小麦等植物,均可引起植株抗病性的提高。在以往的研究中我们从小麦中克隆了一个类甜蛋白基因(Ta-Tlp),该基因在高抗白粉病的小麦6VS/6AL易位系中能够高水平表达,推测它与白粉病抗性密切相关。为进一步研究该基因的功能,本研究构建了包含在ubi强启动子控制下的Ta-Tlp基因的表达载体pAHC-TlP,用基因枪将其导入小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织,在含除草剂的选择培养基上经两轮筛选和分化,获得再生抗性植株。对T0、T1和T2代植株进行PCR、Southern杂交与RT-PCR分析,结果表明Ta-Tlp基因已整合进受体基因组并且能够表达。对T0代及其衍生的T1代(来自6个T0代阳性株系的183个单株)和T2代(来自6个T0代阳性株系的241个单株)转化植株进行白粉病抗性鉴定,Ta-Tlp基因超量表达的转基因植株,能延缓白粉病发病进程,其白粉病抗性有一定提高。对T2代阳性转化植株进行赤霉病抗性鉴定表明,其抗性与受体对照相比无显著差异。     

农杆菌介导的RNAi CP基因在大豆中的转化

花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是大豆主要病害之一,生产上常采用种植抗性品种方法来防治。本研究以RNA干扰花叶病毒衣壳蛋白(coat protein, CP)基因为表达载体,Bar基因作为筛选标记基因,成熟子叶节为外植体,采用农杆菌介导法获得了22株T₀代转基因大豆生根苗,经草丁膦涂抹、Bar试纸条和PCR法鉴定,获得RNAi CP转基因植株18株;对转基因植株T₁代的遗传分析表明,外源基因能够稳定遗传到下一代且符合孟德尔遗传规律;T₁代Southern杂交表明,导入的干扰片段为单拷贝;花叶病毒摩擦接种表明RNAi CP转基因大豆植株具有抗花叶病毒特性;摩擦接种后3周,DAS-ELISA检测进一步表明,RNAi CP转基因植株花叶病毒检出率仅为7.69%,而非转基因植株为100%。这表明RNAi花叶病毒CP基因可用于抗大豆花叶病毒的研究。     

转大豆Na~+/H~+逆向转运蛋白GmNHX1基因植株的获得

制约大豆生产的因素很多,土壤盐渍化就是其中之一。大量研究证明过表达NHX逆向转运蛋白可以提高植物的耐盐性。为获得耐盐性良好的转基因大豆材料,我们将大豆Na~+/H~+逆向转运蛋白(GmNHX1)基因构建到植物表达载体pCAMBIA3300上,应用农杆菌介导法将GmNHX1导入大豆品种黑农56和黑农59中,共获得18个转基因株系,并对T_1代转基因株系进行了PCR和实时荧光定量PCR检测。PCR结果表明转基因后代株系呈阳性的植株有4株;经Real-time PCR检测该4个PCR阳性转基因株系的G NHX1基因表达水平均高于对照株系;200 mmol/L NaCl溶液的盐试结果表明;对照植株的生长速度滞缓于4个转基因株系的生长速度。     

BADH基因转入玉米自交系的研究

采用花粉管通道法将甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)转入玉米自交系京24,以提高玉米的耐盐性。在玉米植株T0代喷洒200mg/L草铵膦除草剂进行抗性试验,获得4株抗性苗。在T0代进行PCR初步检测得到3株转基因植株。在T2代通过Southern blotting以及Northern blotting检测,表明外源BADH基因已经整合并表达。对T2代株系和京24自交系(CK)在高盐胁迫下进行相对含水量、叶片电解质外泄率、甜菜碱含量、脯氨酸含量等生理指标的测定,结果表明转基因株系的生理指标明显好于对照,说明转入BADH基因能提高玉米的耐盐性。     

大豆主要病害多抗性资源筛选鉴定

大豆灰斑病、根腐病和疫霉病是生产上主要发生的病害,对大豆的产量和品质影响很大,用抗病品种是防治病害的有效方法,抗病资源筛选鉴定是抗病育种的基础。因此,本研究对这3 种病害进行抗病性鉴定,旨在筛选出单抗和多抗资源。用人工接种鉴定的方法,对139 份大豆材料分别接种大豆灰斑病菌、根腐病菌、疫霉病菌,进行单一病害鉴定,发病后按每种病害的抗性评价标准确定每份材料的抗病性。结果表明,对大豆灰斑病和疫霉病表现高抗的材料总计为51份,中抗材料总计为80份;对大豆灰斑病和根腐病表现为抗病材料总计为102 份;对3 种病害鉴定为感病的材料总计为179 份。抗2 种以上病害鉴定结果为,抗根腐病和疫霉病的材料12份;抗灰斑病和疫霉病的材料14份;抗灰斑病和根腐病的材料16分。抗3种病害的材料7份。明确了在供试的大豆材料中对单一病害的抗源居多,抗2 种以上病害特别是抗3种病害的材料较少,因此,应合理的利用这些多抗性的资源材料。     

大豆种粒斑驳抗性的遗传分析及基因定位

运用SSR标记技术及分离群体组群分析法(BSA法), 对大豆品系3C624×东农8143的F₂、F₃代群体接种SMV1号株系鉴定种粒斑驳抗性, 并进行抗种粒斑驳基因的分子定位。结果表明, 东农8143对SMV1号株系的种粒斑驳抗性受1对显性基因控制。用Mapmaker/Exp 3.0b进行连锁分析, 抗种粒斑驳基因位于大豆染色体组的F连锁群上, 并获得了与抗种粒斑驳基因紧密连锁的5个SSR标记Sat_297、Sat_229、Sat_317、Satt335和Sct_188, 标记与抗病基因间的排列顺序和连锁距离为Sat_297–12.4 cM–Sat_229–3.6 cM–SRSMV1–1.7 cM–Sat_317–2.4 cM– Satt335–13.8 cM–Sct_188。其中近距离标记Sat_229(3.6 cM)、Sat_317(1.7 cM)和Satt335(4.1 cM)可用于标记辅助选择育种和抗源筛选。     

反义外壳蛋白基因介导的抗SCMV转基因玉米研究

玉米矮花叶病（MDM）是一种世界性病害，在我国主要由甘蔗花叶病毒(SCMV)所致。为探索一条高效、安全的抗SCMV转基因途径，构建了无标记基因的SCMV反义外壳蛋白基因（cp）表达载体pACP。通过冻融法将该载体与抗除草剂标记基因(bar)载体分别导入农杆菌LBA4404,然后共转化玉米自交系综3的幼胚。通过除草剂梯度筛选，从抗性愈伤组织分化获得了35株再生苗。PCR检测证明，其中26株带有抗除草剂标记基因（bar），14株带有SCMV反义cp基因。这14株带有目的基因的玉米植株自交，其种子在田间种植成株行（T₁代）。玉米T₁代幼苗人工接种SCMV，筛选出2个抗病株率高于70%的株行。ELISA检测表明，抗病株SCMV含量极低，抗性达高抗水平。PCR检测表明，抗病性是反义cp基因作用的结果，并且获得了2株cp基因阳性而标记基因阴性的抗病株。     

RNAi介导SMV-P3基因沉默增强大豆对花叶病毒病的抗性

大豆花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是我国各大豆主产区最重要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒外观品质。培育抗病品种是防治该病最经济有效的措施。本研究基于植物介导RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,将编码参与SMV运动和影响宿主域范围的P3蛋白基因RNAi片段导入栽培大豆品种,研究RNAi介导SMV-P3基因沉默对大豆抗SMV的影响。Southern杂交检测结果表明,外源RNAi片段以低拷贝的形式(1~4个)整合至大豆基因组中。对T1~T3代转基因大豆喷施除草剂和PCR鉴定结果表明,外源T-DNA插入片段在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。对T2和T3代转基因大豆接种SMV鉴定结果表明,转基因大豆对我国大豆产区主要流行SMV株系SC-3较非转基因对照受体品种Williams 82和SN9的抗性水平显著提高,病情指数降低至4.37%~18.51%,且抗性能够稳定遗传。综上所述,RNAi介导SM-P3基因沉默能够显著提高转基因大豆对SMV的抗性水平。     

大豆感染灰斑病菌后叶片中多酚氧化酶活性的变化

分析了大豆感染灰斑病菌后叶片中多酚氧化酶酶活性的动态变化,探讨了多酚氧化酶在大豆抗灰斑病中的作用。研究的结果表明,抗病品种感染灰斑病菌后,叶片中多酚氧化酶活性均比对照增加;而感病品种接种后叶片中多酚氧化酶活性比对照下降。这表明多酚氧化酶在大豆抗灰斑病中起着重要的作用,其活性的大小与大豆抗病性成正相关,可以作为大豆品种抗性鉴定的一个重要生理生化指标。     

大豆(Glycine max) GmDREB5互作蛋白GmGβ1的筛选及鉴定

从大豆(Glycine max)中克隆了一个与抗逆相关的DREB (Dehydration Responsive Element Binding Protein) 基因GmDREB5。功能分析证明, GmDREB5基因能够显著提高烟草的抗旱性和耐盐性。为了筛选GmDREB5的互作蛋白, 采用酵母双杂交系统以GmDREB5蛋白73~226位氨基酸区段为诱饵筛选干旱处理的大豆cDNA文库, 发现一个互作蛋白含有保守的WD40结构域, 与棉花(Gossypium hirsutum)和水稻(Oryza sativa)的G蛋白β亚基分别具有61%和52%的同源性, 说明蛋白可能是一类新的大豆G蛋白β亚基, 将其定名为GmGβ1。将GmDREB5与GmGβ1共转化酵母菌株AH109, 转化的酵母能够在四营养缺陷型培养基上(SD/ trp- leu- his- ade-)正常生长, 而对照不能生长; 同时, 共转化的酵母能够激活LacZ报告基因的表达, 证明GmGβ1与GmDREB5之间存在相互作用。表达特性分析表明, GmGβ1基因受干旱、低温、高盐等胁迫和激素ABA处理的诱导而表达, 证明GmGβ1不仅参与植物对非生物胁迫的响应, 同时参与对GmDREB5蛋白水平的调控。     

大豆对胞囊线虫(Heterodera glycines Ichinohe) 1号和4号生理小种抗性的遗传分析

大豆胞囊线虫(Heterodera glycines Ichinohe)是我国大豆的全国性主要病害之一。1号和4号生理小种是黄淮地区的优势小种。以Essex×ZDD2315、Peking×ZDD2315、PI88788×ZDD2226、Peking×ZDD2226的P₁、P₂、F₁、BC₁F₂为材料，用主基因＋多基因混合遗传模型分析大豆对胞囊线虫1号和4号生理小种抗性的遗传机制。结果表明，ZDD2315、ZDD2226对1号生理小种的抗性受主效基因控制，未发现多基因效应，且与Peking存在相同的抗病基因；抗性遗传表现组合特异性，Essex×ZDD2315组合为3对加性主基因遗传模型，主基因遗传率72.02%，PI88788×ZDD2226组合为2对显性上位主基因遗传模型，主基因遗传率62.33%。对4号生理小种的抗性为主基因＋多基因混合遗传模型，Essex×ZDD2315、Peking×ZDD2315、PI88788×ZDD2226等3个组合为3对主基因+多基因遗传模型，主基因遗传率分别为67.76%、72.46%和53.25%，多基因遗传率分别为24.48%、21.31%和35.77%；Peking×ZDD2226表现为2对主基因遗传模型，主基因遗传率45.40%。抗性基因表现为隐性，育种上可以在早代选择。培育多抗品种应以抗4号生理小种为主要目标进行基因聚合。     

Marker-assisted identification of resistance genes to soybean mosaic virus in soybean lines

Soybean plants react differentially to soybean mosaic virus (SMV) strains because of interactions among different resistant genes in the soybean genome. Three independent genes resistant to SMV have been identified by inheritance studies and linkage analyses. To develop durable SMV-resistant soybean cultivars, it is necessary to determine which soybean SMV resistance genes can be readily transferred from resistant to susceptible cultivars in a breeding system. Here, we report the type and number of resistance gene(s) in four Korean elite soybean cultivars using a combination of disease reaction symptoms, inheritance studies, and molecular marker mappings. The disease reactions of Sowonkong and Keunolkong soybean varietals in response to infection with SMV strains suggested that both cultivars most likely harbor the Rsv1 gene similar to that in York. Subsequent inheritance studies confirmed that Sowonkong has the Rsv1 gene. The inheritance studies suggested that Sinpaldalkong harbored the Rsv1 gene, which was then confirmed by molecular marker mapping. The inheritance studies also suggested that Jinpumkong 2, which is the most resistant to SMV infection among the four cultivars, contained the Rsv1 and Rsv3 genes; this was confirmed by molecular marker mapping. Our approach, which combined inheritance studies and molecular linkage analyses, allowed the efficient identification of resistance gene(s) in four Korean soybean cultivars.