农杆菌介导的RNAi CP基因在大豆中的转化

花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是大豆主要病害之一,生产上常采用种植抗性品种方法来防治。本研究以RNA干扰花叶病毒衣壳蛋白(coat protein, CP)基因为表达载体,Bar基因作为筛选标记基因,成熟子叶节为外植体,采用农杆菌介导法获得了22株T₀代转基因大豆生根苗,经草丁膦涂抹、Bar试纸条和PCR法鉴定,获得RNAi CP转基因植株18株;对转基因植株T₁代的遗传分析表明,外源基因能够稳定遗传到下一代且符合孟德尔遗传规律;T₁代Southern杂交表明,导入的干扰片段为单拷贝;花叶病毒摩擦接种表明RNAi CP转基因大豆植株具有抗花叶病毒特性;摩擦接种后3周,DAS-ELISA检测进一步表明,RNAi CP转基因植株花叶病毒检出率仅为7.69%,而非转基因植株为100%。这表明RNAi花叶病毒CP基因可用于抗大豆花叶病毒的研究。     

转chi和rip双价基因大豆抗疫霉根腐病评估

大豆疫霉根腐病(phytophthora root rot,PRR)是由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)引起的一类世界性大豆病害。培育抗病品种是控制病害发生,减少大豆产量损失最为经济有效的措施。本研究采用农杆菌介导转化法,将菜豆几丁质酶基因chi和大麦核糖体失活蛋白编码基因rip导入栽培大豆品种,获得对大豆疫霉菌1号生理小种抗性显著提高的转基因大豆。Southern杂交表明,外源基因以寡拷贝形式整合至大豆基因组中。连续多代(T1~T4)喷施草丁膦和PCR跟踪检测表明,外源基因在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。采用下胚轴伤口接种法,对T3和T4代转基因大豆接种鉴定表明,转基因大豆接种死亡率为6.0%~15.0%,均显著低于对照受体品种沈农9号(93.33%~94.44%)和Williams82(41.18%~56.25%),表明chi和rip双价基因过表达显著提高了转基因大豆抗PRR水平。农艺性状分析表明,转基因大豆在生育期、株高、分支数、节数、叶形、花色、结荚高度、和百粒重等方面与对照受体品种没有显著差异。本研究将chi和rip双价基因转入大豆中,显著提高了转基因大豆对PRR的抗性,对大豆PRR抗性育种工作具有重要的意义。     

转几丁质酶和b-1,3-葡聚糖酶双价基因小麦的获得和鉴定

利用农杆菌介导法将几丁质酶基因和b-1，3-葡聚糖酶双价基因导入小麦品种扬麦10号和Bobwhite，共得到了13棵T0代转基因植株，2个小麦品种的转化效率分别为1.4%和1.0%。T1代植株赤霉病抗性鉴定结果表明，转基因植株对赤霉病具有一定抗性，小穗发病率4.76%～11.76%，低于抗病对照和感病对照。T1代植株分子检测结果表明，外源基     

转几丁质酶和核糖体失活蛋白双价基因大豆的获得与抗病性鉴定

以东北地区4个主栽大豆品种为试材,通过农杆菌介导法,将2个抗真菌病基因,即几丁质酶基因和核糖体失活蛋白基因构建在同一植物表达载体上,对受体材料进行遗传转化,获得了经Southern检测同时整合双价基因的T₀代转基因大豆植株,转化频率为0.5%。将T₀代转基因大豆植株扩繁至T₂代,并进行了大豆疫霉根腐病和大豆灰斑病的抗性检测,4个株系的抗性均比对照有明显提高。分子生物学验证及RT-PCR检测表明2个外源基因在4个株系中均进行了转录表达。     

转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶双价基因小麦的获得和鉴定

利用农杆菌介导法将几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶双价基因导入小麦品种扬麦10号和Bobwhite,共得到了13株T0代转基因植株,2个小麦品种的转化效率分别为1.4%和1.0%.T1代植株赤霉病抗性鉴定结果表明,转基因植株对赤霉病具有一定抗性,小穗发病率4.76%～11.76%,低于抗病对照和感病对照.T1代植株分子检测结果表明,外源基因分离比例为2.33∶1,较低的分离比例可能与外源基因的丢失有关.     

BCL、RIP细胞凋亡基因向小麦中的导入和赤霉病抗性鉴定

利用农杆菌介导法将BCL和RIP 2个与细胞凋亡有关的基因分别导入了小麦品种扬麦10号和Bobwhite,转化效率分别为1.60%和1.25%。Southern检测结果表明,细胞凋亡基因已稳定整合到小麦染色体上,多数植株为单拷贝整合。Northern检测结果表明,细胞凋亡基因能以小麦遗传背景高水平转录为RNA。转基因植株T₁代分离比例为2.11～2.33∶1,表明外源基因在后代中能够稳定遗传。BCL转基因植株和RIP转基因植株对赤霉病均表现出一定抗性,其中BCL-20、BCL-21、RIP-8、RIP-18等15个T₁代植株的小穗发病率为5.6%~16.1%,可望进一步培育抗小麦赤霉病新材料。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ab和Cry1C同源重组及转化大豆

在研究和确定Cry1Ab和Cry1C蛋白对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾协同杀虫作用的基础上,利用同源重组技术进行Cry1Ab和Cry1C之间的结构域交换获得高效融合蛋白,利用农杆菌介导的子叶节法将融合抗虫基因表达载体导入大豆中,从而获得抗虫转基因大豆新材料。采用PCR及蛋白试纸条检测法对获得的大豆再生植株进行鉴定,测得结果初世代阳性植株为121株。对部分后代转基因植株的遗传分析表明外源基因能够稳定遗传。室内接种斜纹夜蛾鉴定表明,含有重组基因的转基因大豆对斜纹夜蛾有较强的抗性。因此,利用同源重组技术进行Cry1Aa和Cry1C之间的结构域交换,是获得高抗食叶性害虫大豆的有效途径。     

兼抗全蚀病和白粉病小麦新种质的创制与鉴定

TaLTP5是从小麦中分离到的一个脂质转移蛋白编码基因。利用基因枪介导法将TaLTP5表达载体pA25-TaLTP5转入抗白粉病的小麦品种扬麦18 (含抗白粉病基因Pm21)中, 旨在选育兼抗全蚀病和白粉病的小麦新种质。对转基因小麦T₀~T₃代植株中引入TaLTP5基因进行分子检测和抗病性鉴定。PCR检测、Southern杂交分析结果表明, 外源TaLTP5基因已转入、整合到3个转基因小麦株系的基因组中, 并能稳定遗传; 荧光定量RT-PCR的分析以及全蚀病菌的接种与鉴定结果表明, 与受体小麦扬麦18相比, 这3个转基因小麦株系中TaLTP5表达量显著提高, 其对全蚀病的抗性也明显增强。对3个转基因株系的Pm21分子标记和白粉病抗性鉴定表明, 外源TaLTP5基因的导入没有影响受体小麦对白粉病抗性, 说明这些转基因株系为兼抗全蚀病和白粉病小麦新种质。     

高粱C_4型pepc基因转入大豆可改善大豆光合特性

改善作物的光合性能能够有效突破作物的产量潜力,目前国内关于转高粱C4型pepc基因大豆的研究尚未见报道。本研究以东北地区主栽大豆品种‘黑农41’为材料,通过农杆菌介导法将高粱C4型全长pepc基因转入‘黑农41’,获得了转基因植株。通过对转基因植株T0代和T1代进行了分子生物学检测、农艺性状调查和生理指标检测,结果表明目的基因已整合到大豆基因组中,T0代和T1代植株的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均有不同程度的提高,而胞间CO2浓度降低,其中T0代和T1代植株的净光合速率分别比对照提高了37.4%和20.7%,在T1代净光合速率增幅最大的T1-3-3,单株产量增加也最多,说明pepc基因的导入改善了转基因植株的光合特性,进而使转基因大豆产量提高。本研究可为高光效转基因大豆新品种的选育提供重要素材。     

基于大豆花叶病毒衣壳蛋白基因的RNA干扰植物表达载体的构建

大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)是马铃薯Y病毒组(Potyvirus)成员之一,大豆花叶病毒病可造成大豆10%~30%的产量损失,并严重影响大豆的品质。不同株系间致病力差异源于它们在碱基序列上的差异。采用传统的抗病育种技术育成的抗病品种抗谱窄,品种抗性可因病毒株系的变异而丢失。依靠RNA引发的基因沉默改善植物的抗病毒能力是基于RNA i(RNA inference)原理建立的植物抗病毒新策略,本研究对来源于武汉SMV分离物的CP基因和Nib基因进行了克隆,通过对保守区域的扩增,采用Gateway技术构建了大豆抗花叶病毒的RNA干扰载体。为防治大豆花叶病毒新技术的探索奠定基础。     

国外大豆种质资源对大豆花叶病毒株系3（SMV3）的抗性评价

大豆花叶病毒病是危害大豆生产的主要病害之一。为今后开展抗大豆花叶病毒育种工作提供基础材料，对222份国外大豆种质资源进行了抗SMV3强毒株系的鉴定评价。结果表明，供试材料对SMV3株系的抗性变异丰富，病情指数呈连续分布，变化范围为12.82%~92.59%。2年重复鉴定筛选出10份高抗资源，占供试材料的4.51%，分别来自日本（4份）、美国（3份）、加拿大（2份）和韩国（1份）。10份高抗资源在播种类型、生育日数、百粒重、株高、种皮、种脐、花色和茸毛色等性状上存在丰富的遗传变异。     

大豆对SMV抗侵染与抗扩展的遗传分析

大豆花叶病毒（SMV）抗性研究最早着重于系统病症,后来发现感病材料还存在发病程度上的遗传差异,抗侵染与抗扩展并不相同,从而鉴别出一批具不同类型抗性的抗源。本研究利用抗侵染和抗扩展品种（系）配置10个不同类型杂交组合,在分别接种Sa或SC8株系条件下,研究两类抗性的遗传模式。结果表明,大豆对大豆花叶病毒抗侵染和抗扩展分属不同遗传体系,抗侵染由一对主基因控制,抗病对感病表现为显性;抗扩展由一对加性主基因+加性-显性多基因控制,F₂代主基因和多基因遗传率分别为23.91%~74.97% 和18.43%~37.04%,F_2∶3代主基因和多基因遗传率分别为49.46%~82.42% 和17.42%~39.93%,抗性大小依亲本而异。两类抗性都有育种价值。因中抗×高感组合的遗传率明显低于高感×高抗组合,抗扩展育种应尽量选择抗性强的品种作亲本。     

冀豆系列品种抗病基因型分子推断

大豆花叶病毒病(SMV)和大豆孢囊线虫病(SCN)是危害大豆生产的重要病害。本试验以冀豆系列14个品种为材料,利用RAPD和SCAR标记技术对其进行了大豆花叶病毒病和孢囊线虫病的抗病基因型分析,以寻找可供在大豆生产和育种中利用的抗源。所用引物为重复性较好的OPL_07,OPAO_19和SCW_05。通过分析,我们初步推断冀豆4号和五星一号同时具有大豆花叶病毒SC和Sa两种株系的抗性基因,其中五星一号既具有大豆花叶病毒病抗性基因同时还具有大豆孢囊线虫病抗性基因,可推荐作为大豆生产和育种中优先选用的抗源材料。     

大豆花叶病毒(SMV)株系SC4和SC8的抗性遗传分析

选用我国黄淮和长江流域大豆产区发生频繁的SMV株系SC4和SC8,利用大豆抗病材料和感病材料配制抗感和抗抗杂交组合,研究抗病材料对SC4和SC8株系的遗传方式以及不同大豆材料对SMV抗性基因位点间的等位性关系。结果表明, 接种SC4株系后,由冀LD42、徐豆1号、跃进4号、科丰1号、PI96983、晋大74、汾豆56、大白麻和齐黄22为抗源配制的9个抗感组合的F₁均表现抗病,经卡方测验, F₂抗感分离比例3∶1,F_2:3家系分离比例为1(抗)∶2(分离)∶1(感),表明这些抗源均有1对基因控制对SC4株系的抗性,且抗病表现为显性;5个抗抗组合的F₁均表现抗病,F₂群体分离比例15(抗)∶1(感),表明大白麻与汾豆56、科丰1号和齐黄1号携带抗SC4的基因是不等位的,冀LD42与汾豆56,晋大74与中作229是不等位的。接种SC8株系后,用齐黄1号、中作229、NY58、科丰1号、PI96983、晋大74、汾豆56、大白麻和齐黄22为抗源配制的抗感组合杂交后代分离符合1对基因的分离比例且F₁均表现抗病,说明这些品种对SC8株系的抗性也均由1对显性基因控制。抗抗组合晋大74×汾豆56接种SC8株系后的F₂群体全部表现抗病,F_2:3家系没有抗感分离,表明抗病品种晋大74与汾豆56携带的抗病基因是等位的;齐黄1号×科丰1号、大白麻×汾豆56的F₂群体分离比例15(抗)∶1(感),表明抗病亲本齐黄1号与科丰1号、大白麻与汾豆56携带抗SC8的基因是不等位的,而且独立遗传。     

大豆花叶病毒侵染初期的抗病性表达序列标签分析

以抗花叶病毒病品系东农8143为材料,利用抑制消减杂交技术构建了一个大豆花叶病毒接种初期的cDNA文库,共获得2000个阳性克隆。随机挑取64个阳性克隆测序,与GenBank进行BLAST_x和BLAST_n同源比较,其中49个有比较明确的比对结果,占测序EST的76.6%。测序的ESTs片段中最短的为136 bp,最长的691 bp,平均长度为456 bp,有41条序列带有Poly(A)尾。功能已知基因的EST涉及大豆的细胞自身保护、信号传导、抑制病原菌生长、系统获得性抗性以及持家基因等许多方面,其中SAR（Systemic aquired resistance）系统基因在表达谱中的种类和数量最多。未知功能ESTs与GenBank的dbEST库中序列比较表明,其中许多与生物、非生物胁迫cDNA文库来源的ESTs同源。     

Transfer of the Rsv3 locus from ‘Harosoy’ for resistance to soybean mosaic virus strains C and D in Japan

Resistance to soybean mosaic virus (SMV) is imperative for soybean (Glycine max (L.) Merr.) production in the Tohoku region. Molecular markers for SMV resistance were previously reported for U.S. SMV strains, but they cannot be applied because of the differences in strain classification between Japan and the U.S. A U.S. variety ‘Harosoy’ has been used mainly as a donor of resistance to SMV strains C and D in a Japanese breeding program, resulting in resistant varieties such as ‘Fukuibuki.’ Because ‘Harosoy’ harbors the Rsv3 gene conferring resistance to the virulent SMV strain groups, G5 through G7, it appears that the Rsv3 gene confers resistance to strains C and D. In this study, we introduced resistance to the two strains from ‘Fukuibuki’ into a leading variety ‘Ohsuzu’ by recurrent backcrossing with marker-assisted selection. All lines selected with markers near Rsv3 showed resistance to the strains, suggesting that the Rsv3 locus is responsible for the resistance. Three years of trials showed that one of the breeding lines, ‘Tohoku 169,’ was equivalent to ‘Ohsuzu’ with respect to agricultural characteristics such as seed size, maturity date, and seed yield, except for the SMV resistance.     

大豆抗烟粉虱的鉴定体系研究

2004年和2007年分别在济南、冠县两地对419份国内外大豆品种资源进行了抗烟粉虱鉴定, 综合分析2年3点自然虫源条件下各品种的鉴定结果和各种抗性鉴定指标之间的关系, 发现大豆感染烟粉虱的数量虽然受环境因素影响较大, 但特定品种的相对抗性表现稳定;筛选出滑皮豆等4个高抗和齐黄26等4个高感烟粉虱的标准品种, 确定了以烟粉虱若虫为调查对象, 以单叶感染烟粉虱若虫的平均数为抗性评价指标, 以标准品种该指标为参照, 当该指标<(a+d)时为高抗、≥(a+d)~<(a+3d)时为抗、≥(a+3d)~<(a+5d)时为中间、≥(a+5d)~ <(a+7d)时为感、≥(a+7d)时为高感, 其中d=(b–a)/8, a、b分别为4份高抗和4份高感标准品种单叶烟粉虱的平均数。同时确定了顶部叶片为有限结荚习性品种的有效调查叶位, 中上部叶片为亚有限和无限结荚习性品种的有效调查叶位。     

中品95-5117抗大豆花叶病毒基因源分析

中品95-5117和中品95-5383是以中品661为亲本选育的抗东北花叶病毒病3号株系(SMV3)的大豆新品系。中品95-5383抗病基因的SCAR标记已被定位于大豆F连锁群(Chr.13),与抗病基因Rsv1紧密连锁。利用大豆F连锁群的34个对SSR标记引物及与抗病基因紧密连锁的SCAR标记SCN11及Rsv1候选基因标记Rsv1-f/r,对中品95-5117系谱亲本进行检测,结合对SMV3的抗性鉴定结果进行分析,旨在明确抗SMV3基因在系谱中的传递规律,为利用分子标记辅助选择培育抗SMV3新品种提供依据。通过SSR标记分析发现,中品95-5117和中品95-5383与亲本中品661的相似性最高,而与另外一个亲本鲁豆4号关系较远。SCAR标记SCN11检测表明,只有1份材料Mangnolid(F-53)B为感病基因型。系谱的Rsv1-f/r标记分析表明,Williams82是中品95-5117中Rsv1基因的供体亲本。抗病性鉴定发现鲁豆4号高抗SMV3,但它并不携带Rsv1基因。据上述结果推测中品95-5117中不仅含有Rsv1,还具有来自鲁豆4号的抗病基因,证明该品系比其亲本中品661具有对SMV3更强的抗性。