粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白全长和N端的原核表达与多克隆抗体制备

采用生物信息学方法分析粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白的生物学特性,利用PCR方法扩增粟酒裂殖酵母yAS56菌株SpTrz2的全长和N-末端一半的编码基因,通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点将SpTrz2的全长和N-末端一半编码基因定向插入pET-28a(+)原核表达载体中,并转化大肠埃希菌BL21(DE3);经过IPTG诱导...     

猪伪狂犬病毒gD蛋白抗原表位的克隆及表达

依据Gen Bank中猪伪狂犬病毒(PRV)BJ/YT株gD基因设计引物,扩增gD蛋白抗原表位,其设计扩增长度为702 bp,将扩增片段克隆到p MD19-T载体获得p MD19-T-gD。利用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切p MD19-T-gD质粒,进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切片段,将回收片段与原核表达载体p ET-28a连接,成功构建了p ET-28a-gD表达载体。将表达载体转化感受态细胞Rosetta,IPTG诱导表达后,进行SDS–PAGE电泳,结果显示,在25 ku处出现特异性蛋白质条带。Western blot分析结果表明,表达产物能够被PRV的阳性血清识别。综上,成功克隆并表达了gD蛋白抗原表位,且其表达产物具有较好的生物学活性。     

牛樟芝se原核表达载体构建及重组蛋白的表达、纯化

鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)是多数中草药植物、药用菌中三萜合成途径中的限速酶,能影响三萜含量的积累。构建了牛樟芝鲨烯环氧酶基因(se)原核表达载体,并进行其重组蛋白诱导表达条件优化。以牛樟芝c DNA为模板扩增se,纯化后将其克隆到p MD18-T载体上,筛选阳性克隆并将其连接到原核表达载体p ET28a,构建重组质粒p ET-28a-se,经酶切验证后转化E.coil BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,利用L9(34)正交试验优化目的蛋白诱导表达条件及纯化。结果表明,不同正交处理间的蛋白表达差异显著(P0.05),其诱导因素的主次为时间温度IPTG浓度,诱导时间对重组蛋白表达影响最显著(P0.05)。而IPTG浓度和温度对重组蛋白表达影响并不显著(P0.05),且当IPTG终浓度为0.2 mmol/L,诱导时间为7 h,诱导温度为26℃时,对SE重组蛋白的诱导效果最佳。     

纤维素降解菌中葡聚糖酶基因的克隆表达及活性

为探明约氏梭菌(Clostridium josui)中纤维小体内某个酶的功能性,从该菌属CJ-1菌株中克隆出基因片段Cel9C,大小为1943 bp,编码647个氨基酸,将该基因构建于大肠杆菌表达载体p ET28a(+)中,获得重组表达载体p ET28a-Cel9C,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中进行表达。结果表明,该酶的最适反应温度为45℃,最适反应p H为p H6.0;对大麦-β-葡聚糖(Barley-β-glucan)和魔芋葡甘聚糖(Konjac glucomannan)具有较高的反应活性,比活值分别达到114和57 U·mg-1;几乎不能以木聚糖(Brichwood xylan)和半乳甘露寡糖(Galacto mannan)为底物。说明该酶对葡聚糖类物质时有较高的降解能力,应为葡聚糖酶。     

柔嫩艾美耳球虫烯醇化酶基因的克隆表达和抗原性分析

从纯化的柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中提取总RNA,应用RT-PCR技术克隆获得了烯醇化酶基因(Gen Bank Accession No.GU169333)。烯醇化酶基因开放阅读框长1 338 bp,编码445个氨基酸。应用DNAstar软件对氨基酸序列的亲水区域和疏水区域的分布、抗原指数及T细胞基序进行分析,结果显示该蛋白质亲水性较强,抗原指数高,含较多T细胞表位。同时构建了烯醇化酶原核表达重组质粒p ET-28a(+)-ENO。用IPTG对重组质粒p ET-28a(+)-ENO进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白大小约为5.17×104,主要存在于裂解上清中。Western blotting结果显示该重组蛋白可被抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗体识别,表明该蛋白质具有较好的免疫原性。     

刺参C型凝集素(AJL)基因的克隆及原核表达分析

为了开发海参免疫基因,生产重组免疫因子蛋白,利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE)获得了刺参凝集素基因(Apostichopus japonicus Lectin,AJL)的编码区序列(Coding sequence,CDS),CDS的长度为492 bp,编码163个氨基酸,其中成熟肽由143个氨基酸组成。将成熟肽的基因克隆并连接至载体p ET-32a(+)中,成功构建了原核表达的重组体p ET-32a(+)-AJL,进一步将重组体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,经诱导表达、分离纯化,获得了融合表达蛋白。本研究结果为进一步研究重组刺参C型凝集素在刺参健康养殖上的应用奠定了基础。     

UdhA和博伊丁假丝酵母xylI基因共表达对木糖醇发酵的影响

[目的]研究可溶性吡啶核苷酸转氢酶基因(UdhA)和醛糖还原酶基因(xylI)共表达对木糖醇发酵的影响。[方法]将来源于博伊丁假丝酵母醛糖还原酶xylI基因克隆到pET28a(+)上,并在BL21(DE3)中表达,通过SDS-PAGE对表达产物的分子量和酶活进行测定。随即将xylI基因连接lacP启动子,构建pWYZ-2质粒并将其转化到E.coli AI07菌株。进一步将来源于E.coli W3110的UdhA基因克隆到pWYZ-2质粒实现与xylI共表达,所构建pWYZ-4质粒转化到E.coli AI07菌株,比较了E.coli AI07/pWYZ-2和E.coli AI07/pWYZ-4木糖醇发酵结果。[结果]在BL21(DE3)/pET28a(+)体系诱导表达的醛糖还原酶分子量为39kD,木糖还原酶酶活为3.30 U/mL。E.coli AI07/pWYZ-2菌株发酵48 h,木糖醇产量为19.90 g/L;E.coli AI07/pWYZ-4发酵36 h,木糖醇产量达到19.91 g/L,较菌株AI07/pWYZ-2生产强度提高了33.25%。[结论]通过将UdhA基因与xyl...     

两种模式酵母中可分解丙酮醛的GLO3的特性及鉴定

GLO3是一种不依赖辅助因子就可分解丙酮醛的酶,有研究表明大肠杆菌的EcHsp31和人的HsDJ 1均属于这种GLO3。丙酮醛是细胞糖酵解过程中产生的一种有毒的副产物,乙二醛酶Ⅰ(GLO1)和乙二醛酶Ⅱ(GLO2)在谷胱甘肽(GSH)的辅助下可以降解细胞内丙酮醛,乙二醛酶Ⅲ(GLO3)不需要GSH的辅助可以直接降解MG。研究真菌的GLO3降解丙酮醛的机制,对认识和研究因丙酮醛引起的疾病具有重要的指导意义。研究表明,真菌中GLO3同源蛋白十分复杂,Hsp31在真菌中广泛存在,DJ 1只在部分真菌中存在,进化树结果支持GLO3的同源蛋白Hsp31和DJ 1是一种趋同进化。对模式真菌酿酒酵母的ScHsp31和裂殖酵母SpDJ 1进行GLO3的酶活测定和HPLC产物检测表明,这两种蛋白均具有GLO3的特性。     

小鼠Klf4基因的原核表达研究

[目的]对小鼠Klf4基因重组蛋白进行原核表达分析。[方法]利用双酶切从重组质粒p MXs-Klf4上回收小鼠Klf4基因片段,克隆入p ET-41a(+)载体后转化BL21大肠杆菌,用IPTG诱导表达,探讨诱导表达最佳浓度和时间,最后采用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定及分析。[结果]重组质粒Klf4-p ET-41a(+)在IPTG诱导下可表达与预期相符的约为51 ku的KLF4蛋白;经IPTG刺激后重组蛋白表达增多,以0.8 mmol/L IPTG诱导6 h为佳;重组蛋白以包涵体形式存在于大肠杆菌BL21中。[结论]小鼠Klf4基因可在原核细胞中表达。     

不同诱导剂及培养条件对C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因表达的影响

对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)β2毒素基因的表达载体p ETXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定,并用SDS-PAGE检测了不同培养条件下,该毒素基因在埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)工程菌株中的表达情况。结果表明,p ETXB2重组质粒中的β2毒素基因位于p ET-28c(+)表达盒中,且阅读框架和基因序列正确。以IPTG为诱导剂时,重组菌株BL21(DE3)(p ETXB2)的最佳培养条件为37℃,p H7.0,IPTG终浓度0.8 mmol·L-1,诱导4 h;以乳糖为诱导剂时,其最佳培养条件为37℃,p H 7.0,乳糖终浓度0.5 g·L-1,诱导5 h。     

H7亚型禽流感病毒HA基因的原核表达及表达产物的反应原性分析

为构建新型H7亚型禽流感HA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。从NCBI数据库下载H7亚型禽流感HA全基因序列,合成HA基因;定向克隆到原核表达载体p ET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒p ET-32a(+)-HA;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot法鉴定。结果显示,重组质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;重组的HA融合蛋白约为84 ku,大小与预期融合蛋白大小一致;重组HA融合蛋白可以与His标签单克隆抗体特异性结合,与H7阳性血清有较强的反应原性。成功构建了HA基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组HA融合蛋白表达。     

伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】为了区分伪狂犬病病毒疫苗免疫猪和自然感染猪,建立快速诊断的方法.【方法】利用PCR方法从伪狂犬病病毒中扩增出糖蛋白E(g E)基因的主要抗原表位区,用Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒p ET-g E184,并转化至大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,用纯化后的g E184蛋白作为包被抗原,建立间接g E184-ELISA检测方法.【结果和结论】用该方法检测290份临床猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果比较,两者的符合率为93.1%.     

猪瘟病毒E2蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析

为制备具有免疫原性的猪瘟病毒E2蛋白,在大肠杆菌中表达E2蛋白,并对其进行纯化及免疫原性分析。将E2基因插入原核表达载体p ET-28a,构建重组质粒p ET-28a-E2,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性E2蛋白。对IPTG浓度及诱导温度和时间进行优化,结果显示,IPTG终浓度为0.1 mmol/L时,18℃条件下诱导表达16 h,E2蛋白的可溶性表达量最高。通过分子筛一步纯化E2蛋白,其终质量浓度为0.5 g/L。Western blot分析和间接ELISA结果显示,纯化后的E2蛋白在变性及非变性条件下都能够被猪瘟阳性血清特异性识别,表明纯化后的E2蛋白活性良好。将纯化后的E2蛋白添加弗氏佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠,采集血清进行病毒中和试验,结果显示,免疫后56 d产生较高水平的中和抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。综上,成功利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达了可溶性E2蛋白,且纯化后的E2蛋白免疫原性良好。     

水稻类受体蛋白激酶OsESG1的原核表达

水稻类受体蛋白激酶Os ESG1在种胚中特异表达,属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Os ESG1基因全长c DNA经XhoⅠ、Bam HⅠ双酶切,与同样经双酶切的原核表达载体p ET-28a(+)经T4 DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21。原核表达结果显示,Os ESG1可受1 mmol/L IPTG诱导表达,且蛋白表达量随诱导时间的延长而逐渐增加,诱导7 h后,蛋白表达至较高水平。对不同浓度IPTG诱导下的蛋白表达情况进行研究,结果显示,0.1 mmol/L IPTG对Os ESG1的诱导表达效果最好。     

谷氨酸棒杆菌乳酰谷胱甘肽裂合酶基因克隆、表达及活性分析

乳酰谷胱甘肽裂合酶是生物体内降解丙酮醛的重要酶之一。食品级微生物谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组上的NCgl0106预测为乳酰谷胱甘肽裂合酶基因,但尚缺乏实验验证。本试验首先通过pCR技术扩增出预测的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032乳酰谷胱甘肽裂合酶基因lac,并将之与表达载体pET-28a连接,转化BL21(DE3)感受态细胞,成功获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-lac。然后,使用IpTG诱导E.coli BL21(DE3)/pET-28a-lac表达重组蛋白Lac。SDS-PAGE试验结果表明:重组Lac蛋白在大肠杆菌进行了可溶性表达,其分子量约为14 kDa。最后对重组Lac蛋白进行了分离纯化、活性检测及酶学特性分析。应用His-tag纯化获得的重组蛋白溶液浓度为604.9μg/mL;活性检测显示重组Lac蛋白能催化丙酮醛和谷胱甘肽生成S-D-乳酰谷胱甘肽,表明谷氨酸棒杆菌lac基因是乳酰谷胱甘肽裂合酶基因;酶学特性分析表明重组乳酰谷胱甘肽裂合酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为7,金属离子K~+和Ca~(2+)对其活性略有增强作用,Ba~(2+)对酶活性几乎没有影响,Zn~(2+)、Mg~(2+)和Fe~(2+)对酶活性有一定的抑制作用,Co~(2+)和Mn~(2+)几乎完全抑制其活性,酶反应米氏常数K_m值为0.223 2 mmol/L,最大反应速率为0.025 mmol/(L·min)。     

大豆查尔酮异构酶基因的克隆及粟酒裂殖酵母表达载体的构建

利用RT-PCR克隆Ⅱ型大豆查尔酮异构酶基因(CHI1A),然后将目的片段与克隆载体pMD18-T质粒相连接,检测后将目的基因重组于粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的MCS序列之中,使用电击法将重组质粒转化进入粟酒裂殖酵母中,用PCR和双酶切的方法来检测试验结果,表明获得了CHI1A完整开放阅读框(670bp),与已报道序列(NO:AY595413)的同源性达到99%。PCR和酶切鉴定表明,CHI1A已导入到酵母表达载体中。查尔酮异构酶基因的克隆、粟酒裂殖酵母表达载体的构建,为该基因的应用提供了依据。有望利用基因工程技术将该基因重组于酵母基因组中并表达目的蛋白,以此来催化合成黄酮和异黄酮类化合物。     

番茄黄化曲叶病毒CP基因的原核表达载体构建选择

[目的]筛选出目的蛋白能够高效表达的重组质粒。[方法]利用原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)成功构建了番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因的重组质粒p32a-CP和p28a-CP,并通过PCR和双酶切鉴定了序列连接的正确性;再分别将2个载体转化至BL21(DE3)中,采用不同浓度的IPTG对其进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳检测。[结果]测序结果显示TYLCV-CP基因已定向插入p32a-CP和p28a-CP中;SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为50 kD的目的蛋白在重组载体p32a-CP中得到了高效表达,而在重组载体p28a-CP中未表达。[结论]为下一步的抗体制备及TYLCV的免疫学检测奠定了基础。     

红鳍东方鲀白介素15的原核表达及其活性测定

为了开发红鳍东方鲀Takifugu rubripes免疫基因及其重组表达,生产重组免疫因子蛋白,通过提取红鳍东方鲀肾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到白介素15(interleukin15,IL15)基因序列,将IL15成熟肽序列与原核表达载体p ET-32a(+)连接,成功构建重组表达载体(重组子)p ET-32a(+)-IL15,并将其重组子转化至Escheria coli BL21(DE3)感受态细胞中获得重组表达IL15的基因工程菌,再经IPTG诱导,p ET-32a(+)-IL15在BL21中得到了融合表达。结果表明:通过对表达产物的纯化和Western Blotting检测,红鳍东方鲀IL15在大肠杆菌中的表达量较高,蛋白浓度为294.6μg/m L;用MTT法对该蛋白进行活性鉴定显示,加入稀释10倍和100倍的重组红鳍东方鲀IL15蛋白时,CTLL-2细胞的增殖率相对较高,分别为71%和73%。研究表明,重组红鳍东方鲀IL15蛋白具有体外促进CTLL-2细胞增值的能力。     

黄鳝醛酮还原酶的定点突变及对其酶活性的影响

为分析催化四联体中关键氨基酸突变对黄鳝醛酮还原酶活性的影响,本研究利用重叠PCR技术对黄鳝Eakr基因进行了A81K定点突变,将突变基因亚克隆至p ET-28a(+)构建了重组表达载体。重组载体转化BL21(DE3)菌株后经IPTG诱导,镍离子柱亲和层析获得了突变型蛋白(EakrA81K);以NADPH为辅酶,分析了突变型蛋白EakrA81K的底物谱,并比较了野生型(Eakr)和突变型蛋白(EakrA81K)对不同底物的还原活性;最后,以甲醛为底物比较了野生型和突变型蛋白的最适反应温度和最适p H。结果表明:EakrA81K对醛类物质以及中长链酮类物质具有较高的还原活性,而对醇、糖、酸类物质没有明显活性;A81K位点特异突变使得黄鳝醛酮还原酶和底物之间的亲和力显著增加,并提高了酶对大部分底物的还原活性;突变稍降低了黄鳝醛酮还原酶的酸度耐受能力但提升了该酶的温度耐受能力。这暗示着黄鳝醛酮还原酶Eakr的81位氨基酸在底物识别上具有重要作用。     

鸡白细胞介素18基因的克隆与原核表达

白介素18(IL-18)最早被称为干扰素诱导因子(interferon-γ-inducing factor,IGIF),是近年发现的一种重要的免疫调节因子。该实验根据Gen Bank中已公布的鸡IL-18的基因序列,设计并合成了一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出IL-18基因,并将该基因克隆到p MD18-T载体中,经过质粒酶切、PCR和测序鉴定,阳性克隆命名为Chp MD18-T-IL-18。将Chp MD18-T-IL-18双酶切后与p ET32a表达载体连接,转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达鸡IL-18蛋白,结果表明,在28k D左右出现了目的条带,经west-ern blot检测确定该蛋白获得高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。