植物基因定点突变与定点置换技术及其在作物遗传改良中的应用

随着大量植物基因组测序工作的完成及EST数据库的充实，利用基因定点突变与定点置换技术精细的研究基因功能是功能基因组学研究的重要手段。同时，基因定点突变与定点置换技术可以克服现有转基因技术的基因沉默和位置效应等诸多缺陷，在植物遗传改良方面具有重要的意义。基因定点突变与定点置换技术在酵母和小鼠胚胎干细胞中已经比较成熟，但在高等植物中同源重组频率非常低，限制了其使用。新近研究发现，利用锌指核酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）引入DNA分子的定点断裂（double-strand breaks, DSBs）可以高效介导基因的同源重组，使得ZFN成为遗传工程的一个研究热点。利用嵌合寡核苷酸(Chimeric oligonucleotides)可以介导基因的单碱基定点突变，在植物遗传改良上有广阔的应用前景。对同源重组相关的调控途径进行基因修饰也可以提高植物的基因打靶效率。植物基因定点突变与定点置换技术难题的攻克，必将加快植物功能基因组研究的步伐，同时给植物基因工程育种带来新的革命。     

组织特异性定点重组Cre/LoxP系统的研究概况

Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ系统是一种对转入基因进行组织特异性，定点操作的基因重组系统，可进行基因的定点整合、特定基因的组织特异性删除、基因的条件性重组、染色体易位等方面的研究，在小鼠的转基因方面已经开展了广泛深入的研究，并为我们建立了谦好的实验动物模型，这对家畜转基因工作的开展开辟了一条全新途径。下面公就Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ系统的研究概况做简单介绍，希望能在转基因动物制备上得以借鉴。     

大肠杆菌glgC基因的克隆,序列分析与定点突点

通过ＰＣＲ、从Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｙ１０９０株系中扩增获得ｇｌｇＣ基因,插入ｐＵＣ１９的ＰｓｔＩ和ＳａｃＩ位点之间,得到重组质粒ｐＡＧＰ。对所克隆的ｇｌｇＣ基因进行全序列测定,结果表明,与已发表的序列相比,有７个核苷酸发生了改变,核苷酸顺序的同源性为９９．４％,推导的氨基酸序列的同源性为９９．２％,其中,第２９６位由赖氨酸变为谷氨酸。通过寡核苷酸介导的定点诱变,将第１００７位核苷酸由Ｇ变为Ａ,从     

利用植物叶绿体表达重组药用蛋白和疫苗研究进展

植物是医用药物的重要来源之一,约占整个医用药物市场的1/4以上。现代生物技术的发展进一步拓宽了植物在医药领域的应用范围,许多具有重要应用价值的重组药用蛋白在植物中获得成功表达,部分重组药用蛋白已进入商业化应用阶段。与其他重组药用蛋白生产系统相比,植物叶绿体生产系统具有独特的优势,如外源基因的高效和稳定表达、多基因表达、环境安全等。利用植物叶绿体表达系统生产的重组药用蛋白和疫苗已达40多种。本研究对近年来利用叶绿体表达重组药用蛋白和疫苗的研究进展进行了综述,并就植物叶绿体表达重组药用蛋白方面的几个问题进行了探讨。     

人TPO基因定点整合荷斯坦牛αs1-酪蛋白基因打靶载体构建

应用LA-PCR的方法,从荷斯坦牛基因组中成功地扩增获得6.0 kb和1.78 kb两个基因片段,其中6.0 kb包括αs1-酪蛋白基因5′调控序列到第三内含子部分,1.78 kb包括αs1-酪蛋白基因第十二内含子到第十四内含子之间序列,作为打靶载体的同源臂;从新生儿血液基因组中扩增获得5.5 kb的血小板生成素（thrombopoietin,TPO）基因组序列,包括第一内含子部分序列到3′终止子后的序列。以水牛β-酪蛋白基因的5′调控区4.4 kb片段为启动子,以pLoxp质粒为打靶载体骨架,加上同源臂片段和目的基因TPO的片段,经多步酶切-连接-转化-筛选-鉴定基因重组过程,最终建成长达25 kb的人TPO基因定点整合荷斯坦牛αs1-酪蛋白基因打靶载体,PCR和酶切分析表明载体构建正确,为研制定点整合荷斯坦牛乳腺生物反应器奠定了基础。     

构建食品级植酸酶黑曲霉工程菌

植酸是植物种子中肌醇和磷的主要存在形式,由于单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶,以植酸磷形式存在的磷难以被单胃动物吸收。植酸酶作为饲料添加剂已经广泛应用,但在食品中的应用研究刚刚开始。本研究以黑曲霉(Aspergillus niger)CICC2462基因组DNA为模板,PCR扩增植酸酶基因片段,并在其两端加上糖化酶基因(glaA)的5'同源臂和3'同源臂,构建农杆菌Ti质粒基因置换载体pSZHG-phy。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化黑曲霉,筛选以植酸酶基因替换糖化酶基因的同源重组转化子,以实现植酸酶基因的高效表达。结果表明,筛选获得4株同源重组转化子,同源重组率为100%,通过分光光度计法测定重组植酸酶菌株的最高发酵酶活为316.2 U/mL,为出发菌株的20.8倍,证明植酸酶phy基因是可以在黑曲霉糖化酶生产菌中实现高效表达。本研究为进一步构建食品级植酸酶工程菌提供了基础资料。     

大肠杆菌天冬氨酸激酶lysC基因的克隆及定点突变

以大肠杆菌Ｋ１２菌标总ＤＮＡ为模声,利用技术扩增了编码天冬氨酸激酶的ｌｙｓＣ基因,序列分析结果表明,目的含有１３５０个核苷酸（包括起始密码和终止密码）,与文献报道相比,核苷酸序列同源率为９９．６％,推测的氨基酸序列与报道的相比,同源率为９９．３％,利用定点突变方法,将核苷酸序列的第１０５５位的Ｃ变成Ｔ,从而引起第２３５２位的苏氨酸变为异亮氨酸,以改变天冬氨酸激酶对赖氨酸的馈抑制的敏感性。     

植物抗逆反应中的转录因子网络研究进展

植物生长发育过程中会经历各种生物及非生物胁迫,转录因子所介导的基因表达调控网络在植物抵御各种胁迫反应中起着重要的作用.目前已鉴定的与植物抗胁迫有关的转录因子及家族主要有碱性域亮氨酸拉链(basic-domain leucine-zipper,bZIP)、禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物类(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)、乙烯应答元件组合蛋白/因子(APELATA2/ethylene-responsive element binding proteins/factors,AP2/EREBP)、WRKY和NAC等.这些转录因子与特定的顺式作用元件结合组成调控网络,特异地调控植物胁迫反应中各种相关抗性功能基因的表达,提高植物对环境胁迫的适应能力.     

植物LFY基因的研究进展

LFY基因在植物花分生组织形成中处于关键位置，维持花分生组织的正常功能、花启动，防止花分生组织的逆转。LFY基因需要其他成花基因相互作用，构成一个基因调控网络，其中任一基因的失活，其功能都会被其他基因部分补偿。LFY基因的表达除受碳源、植物激素等因子影响外，还受其他诸多因素的影响。文章就国内外对LFY基因及其同源基因的一些研究进展进行了综述，重点介绍了该基因在植物花发育中的功能、表达及其影响因子，同时展望其应用前景。     

气孔蛋白同源物在单、双子叶植物中的生物信息学分析

本文对NCBI数据库中的4种单子叶植物（玉米,高粱,水稻和二穗短柄草）和5种双子叶植物（筷子芥,大豆,蒺藜苜蓿,毛果杨和蓖麻）的气孔蛋白同源物,利用生物信息学分析工具在基因结构、碱基组成、氨基酸理化性质、信号肽结构、磷酸化位点、二级结构及三维结构上进行了比较分析,并构建系统进化树。结果表明,单、双子叶植物中的气孔蛋白同源物在基因结构上均由3个外显子和2个内含子构成;编码的蛋白均属于不稳定的疏水性蛋白,且存在信号肽结构和C端保守的6个半胱氨酸残基;在保守的成熟肽区段含有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（T）,不含α-螺旋结构,但三维结构基本一致。它们之间的不同点如下：单子叶植物气孔蛋白同源物在基因结构上存在一致的上游同框终止密码子,且G-C含量高于双子叶植物,而AT含量低于双子叶植物;单子叶植物中气孔蛋白同源物的氨基酸残基数目较庞大（除大豆外）,在前肽和信号肽区域分别含有相对保守的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（S）和N端豆蔻酰化位点;二级结构中的延伸折叠结构和任意卷曲结构分别多于和少于双子叶植物。系统进化树表明,气孔蛋白在单子叶作物和双子叶植物之间产生了进化上的差异。气孔蛋白同源物在单、双子叶植物中存在明显的差异,这可能与基因的表达调控以及蛋白功能的活化机制有关。但是否与单、双子叶植物表皮细胞气孔的形态差异有关仍待进一步的研究。     

耐辐射奇球菌同源重组修复机制研究新进展

耐辐射奇球菌是迄今为止人们发现的地球上最抗辐射的生物之一。本文根据本实验室和国内外关于该菌耐辐射的最新研究成果,以各个修复蛋白为线索,详细介绍了耐辐射奇球菌同源重组修复机制上取得的进展。     

甜杨低温响应microRNAs的克隆与分析

MicroRNAs（miRNAs）作为一类21碱基左右的非编码小RNAs,参与植物生长发育的调控,并在植物对生物与非生物胁迫的应答过程中发挥重要作用。本研究依据miRNA高度保守特点,利用已公布的毛果杨（Populus trichocarpa）基因组序列设计引物,从甜杨（Populus suaveolens）基因组中克隆获得了12个miRNA基因座序列。序列比对结果表明,这些miRNA基因均为毛果杨低温响应miRNA基因的同源序列。同时,以低温（0℃）处理0～48h的甜杨幼苗为试材,通过半定量RT-PCR法对miRNA基因的成熟体序列在不同处理时间下的表达谱进行分析,结果显示,大多数miRNA成熟体序列在甜杨低温胁迫下的表达模式与其在毛果杨中的表达极为相似,由此可推测这些保守性miRNAs可能在甜杨和毛果杨两物种对低温胁迫的应答反应中发挥相似的功能,而miR168a、miR168b和miR475a在两物种间表达现象的差异,表明它们可能通过调控多种靶基因而发挥不同作用。本文结果将为进一步研究甜杨基因功能提供基础。     

极端耐辐射奇异球菌Deinococcus sp.BR501切除修复系统突变株的构建及功能的鉴定

极端辐射异常球菌Deinococcussp.BR501的核苷酸切除修复系统,可能包含两条途径:依赖于UV损伤内切酶β(UvsE)的修复途径和依赖于UV损伤内切酶α(UvrABC)的修复途径,其关键酶分别为UvsE(dr1819编码)和UvrABC(A亚基dr1771编码)。根据Deinococcus radiodurans的序列,采用同源克隆的方法,设计PCR引物、克隆基因和体外阻断目的基因,再通过PCR产物线性转化的方法,筛选到同源双交换的重组阻断突变株△dr1771、△dr1819和△dr1771与△dr1819的双突变株。对此突变株和野生型均进行UV辐射抗性和化学损伤试剂MMC与H2O2的损伤修复能力的分析。结果表明了BR501中两条核苷酸切除修复途径的存在,并且只有两条途径同时缺失时,才能使菌体对UV和DNA交联剂MMC敏感。     

RED同源重组法敲除发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB

RED同源重组法敲除发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB,为发光光状杆菌基因敲除提供方法。采用TOPO克隆方法将基因cipA和cipB克隆到质粒pTA上,获得质粒pTA-cipA和pTA-cipB;采用Red／ET方法分别将Gentd基因和Aprar基因分别插入pTA-cipA和pTA-cipB的cipa和cipB基因中,并替换cipA和cipB基因部分序列,获得pTA-Gentalncip A和pTA-ApralncipB;pTA-GentalncipA通过BamH I酶切,从0．7％琼脂糖胶上回收获得GentalncipA,将GemaIncipA导入带有质粒pASK-αβγA的P.luminescens subsp.Akhurstii中,通过的RED同源重组敲除发光光状杆菌晶体蛋白cipA;pTA—ApraIncipB用EcoR I酶切,从0．7％琼脂糖胶上回收获得ApraIncipB,将ApmIncipB导入带有质粒pASK-αβγA的P.luminescens subsp．Akhurstii中,通过的RED同源重组敲除发光光状杆菌晶体蛋白cipB;42℃下热激去除突变菌中的质粒pASK-αβγA。克隆PCR和SDS—PAGE电泳结果表明发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB均被敲除。采用RED同源重组法成功地敲除了发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB。     

茶树CsSNAT基因的克隆与表达分析

为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMART^TM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄 VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L^-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量 PCR 分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。     

诱发籼稻早熟同型系的研究 Ⅰ.早熟同型系的发生及其规律

在同一籼稻类型品种中,早熟同型系发生率4年间基本类似(分别为1.41%、1.37%、1.42%、1.64%),但在不同生态类型品种中早熟同型系发生率则不相同:早熟种为0.73%,中熟种为1.51%,迟熟种为1.97%.系谱亲缘相同的品种,其早熟同型系发生率各自相似;系谱不同的品种则相反.早熟同型系发生的基本规律与特点:1.早熟同型系发生的基础是抑制的表现型;2.早熟同型系的发生与原品种的生育期密切相关;3.出现早、晚熟双向熟期变异的同时,发生株型、叶型等性状的平行变异;4.早熟同型系的发生有不平衡性.早熟定向诱变育种,根据同型系系列的基本原理,只要准确地了解和掌握种、属类型、品种生态特性和品种系谱亲缘3个方面,就能预估诱变后代产生早熟同型系,进行早熟定向诱变,培育新品种.     

毛竹液泡膜Na+/H+逆向运输蛋白基因克隆及表达分析

植物Na+/H+逆向转运蛋白具有稳定细胞质内Na+浓度和调节pH值的功能,对植物的耐盐性具有重要的作用。利用RT-PCR和RACE技术分离出毛竹(Phyllostachys pubescens)Na+/H+逆向转运蛋白编码基因PpNHX1的cDNA序列,全长2290bp(GenBank登录号为GU295174)。该基因的编码蛋白PpNHX1包含545个氨基酸残基,进行BLASTp比对,发现其与芦苇(Phragmites communis)PcNHX1、水稻(Oryza sativa)OsNHX1的序列同源性分别为89%和88%。系统发育分析表明,PpNHX1蛋白与禾本科植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。以半定量RT-PCR检测PpNHX1基因的表达情况,发现PpNHX1受到200mmol/L NaCl胁迫的诱导,在4h内的表达量随NaCl处理时间延长持续增强,其中根部的表达增强幅度明显高于茎和叶;但4h后,PpNHX1在根与叶中的表达量均有所下降。推断PpNHX1基因在盐胁迫下的表达调控与毛竹耐盐能力密切相关。     

青花菜ProDH基因的克隆及功能鉴定

脯氨酸是水分胁迫植物中最常见的渗透保护物质之一,脯氨酸脱氢酶（ProDH）是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶,构建RNAi表达载体转化青花菜可以抑制脯氨酸分解提高其抵抗干旱胁迫和盐胁迫的能力。本研究利用同源重组和RACE技术克隆青花菜脯氨酸脱氢酶基N（ProDH）,以酶切、连接的方法利用载体pFGC1008构建植物RNAi表达载体pFGC—PDHi。序列分析表明,本文首次克隆了1595bp的青花菜脯氨酸脱氢酶基因cDNA全长,该序列编码498个氨基酸;序列比对发现该核酸序列与拟南芥、甘蓝型油菜、芜菁分别有83．26％、89．07％和97．73％的同源性,其氨基酸序列和拟南芥、甘蓝型油菜、芜菁分别有89．78％、91．38％和98．80％的同源性。测序和酶切鉴定表明青花菜ProDH基因RNA干扰表达载体已经构建成功,并将其转化青花菜得到转化株,经PCR检测,转化株均为阳性株,证明干扰载体的T-DNA区已经成功地整合到了青花菜基因组中。研究还发现在外源的L-脯氨酸存在时,转化株的脯氨酸脱氢酶的活件受到了明显的抑制。本研究为青花菜的抗旱育种提供了非常有价佰的新种质材料。     

白头叶猴采食植物的再研究

2006年使用了较先进的录像设备,结合单筒望远镜对白头叶猴进行了全天候的跟踪观察和录像,使我们有可能更准确地仔细鉴定白头叶猴采食的植物及采食部位,也为动物生态的研究提供一个可重复验证的方法。经统计分析发现:白头叶猴属热带分布的灵长类动物,全以植物的各部分器官为食;被采食的植物大多数为热带分布的物种,是当地植被重要的建群种或优势种;在白头叶猴采食的物种中,有一部分是人类使用的药用植物;其中落叶成分和喜钙植物都较多;初步认为白头叶猴对不同的植物其喜食程度有明显不同。