牡丹PsAP2基因的克隆及表达

以牡丹品种‘赵粉’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得1个牡丹APETALA2基因cDNA全长,命名为PsAP2,GenBank登录号为HM167511。序列分析结果表明:PsAP2全长2138bp,包含47bp的5'非编码区、557bp的3'非编码区和1个长度为1533bp编码510个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因属于AP2家族。序列比对和系统进化分析表明,PsAP2与葡萄的亲缘关系最近,相似性达70%以上。相对荧光定量PCR分析表明,PsAP2在根、茎、叶和四轮花器官中均有表达。花瓣中的表达量最高,叶片中表达量最低。     

油桐生物素羧基载体蛋白编码基因VfBCCP的克隆与表达分析

油桐(Vernicia fordii)属于大戟科(Euphorbiaceae)油桐属植物,原产于我国,是世界上著名的木本工业油料树种.其种子榨出的桐油是品质最好的天然干性油之一.桐油具有干燥快、抗酸碱、耐冷热、防腐蚀等特性,作为重要的工业用油广泛应用于制造涂料、高级油墨、增塑剂、医药以及化学试剂等行业(黄挺,2001;Brown et al.,2005).同时油桐作为生物柴油原料树种具有良好的应用前景(钱能志等,2007;Shang et al.,2010;Chen et al.,2010).在油桐种子生长发育过程中,7月为桐油的缓慢形成期,7月底到9月初为桐油的迅速累积期,而9月初至10月中旬为桐油累积完成期(王汉涛等,1985).     

油桐ALDH22A1和ALDH2C4基因克隆及其序列分析

为给油桐ALDH基因的结构与功能研究提供理论依据,以葡萄桐的近成熟种子为材料,根据油桐转录组测序结果设计引物,采用RT-PCR技术克隆了油桐ALDH22A1基因和ALDH2C4基因的全长cDNA序列。ALDH22A1的cDNA序列全长1 782 bp,编码593个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为65.60 kDa,理论等电点为6.62,蛋白二级结构以α螺旋为主,具有1个明显的跨膜结构,是稳定的非分泌蛋白。ALDH2C4的cDNA序列全长1 506 bp,编码501个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为54.82 kDa,理论等电点为6.58,蛋白二级结构以α螺旋为主,是不具有跨膜结构的膜外蛋白。BLASTp分析结果表明,这2个基因所编码序列与麻疯树、蓖麻的乙醛脱氢酶一致性最高,高达80%以上,含有醛脱氢酶基因家族的保守结构域。     

毛竹PeAP2基因及其启动子的克隆与表达初步分析

APETALA2(AP2)基因在植物生长发育过程中发挥着重要作用.利用RT-PCR和RACE方法,从毛竹中克隆到1个AP2同源基因的全长cDNA序列,命名为PeAP2.序列分析表明:PeAP2基因全长1 750 bp,其中,5′端非编码区106bp,3′端非编码区174 bp,开放阅读框1 470 bp,编码1个489 aa的蛋白,该蛋白含有2个AP2结构域,属于AP2/EREBP家族的AP2亚家族.PeAP2蛋白与来自其它单子叶植物的AP2蛋白均有着较高同源性,其中,与二穗短柄草的AP2蛋白同源性最高,达74.85％.实时定量PCR分析显示:PeAP2基因在毛竹的根、茎、叶、鞘和节5种器官中均有表达,其中,叶片中的表达丰度最高,鞘中次之,而在根、茎、节中的表达丰度接近,均较低.利用hiTAIL-PCR方法克隆获得了PeAP2上游启动子区序列1 359 bp,分析显示其含有光、激素等多种信号应答相关的作用元件.     

山鸡椒1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶 DXR基因的克隆和SNP分析

在转录组测序结果分析基础上,以山鸡椒cDNA 为模板,克隆得到山鸡椒1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶DXR 基因cDNA 全长,以山鸡椒基因组DNA 为模板,设计引物、扩增拼接后获得山鸡椒DXR 基因全长,命名为LcDXR。序列分析表明,LcDXR cDNA 全长为1 501 bp,5'非编码区长34 bp,3'非编码区长53 bp,开放阅读框长1 413 bp,预测编码含有470个氨基酸残基的蛋白质,等电点为6.62,分子量为51.12 kD。LcDXR 基因全长为12 601 bp,其中外显子12 个,内含子11 个。对来自10个种源的LcDXR 基因编码区单核苷酸变异位点进行分析表明:在cDNA 区间内共发现10 个SNP(single nucleotide polymorphism)位点,其中有4 个单核苷酸变异导致了所编码的氨基酸的改变,为了分析氨基酸突变导致的蛋白质精细结构的变化,利用Swiss-PDB Viewer 模拟4 个突变位点氨基酸残基的替换。其中江西安远(AY)的突变Lys119Thr 引起了氢键的变化,推测可能对酶的活性产生影响。研究结果为深入研究山鸡椒脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶的活性和功能奠定了基础,同时为山鸡椒遗传育种提供理论依据。     

毛竹苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及组织特异性表达分析

苯丙烷类代谢途径是植物代谢中一条非常重要的途径,一切含苯丙烷骨架的物质都是由这一途径直接或间接生成.     

Cloning of <Emphasis Type="Italic">XET</Emphasis> gene from <Emphasis Type="Italic">Anthocephalus chinensis</Emphasis> and its plant expression vector construction

A full-length cDNA sequence of xyloglucan endotransglycosylase gene (XET), abundantly expressed in the cambium of Anthocepha-lus chinensis was cloned by conserved PCR, rapid-amplification of cDNA ends and by chromosome walking. Analytical results of the DNA sequence show that a 912 bp complete open reading frame (ORF) encoded a 303-amino acid protein was in the 1205 bp full cDNA sequence. The deduced amino acid sequence of AcXET, which contained the conserved specific EIDFE catalytic site sequence to XETs was homologous to the other known XET proteins. In order to study the gene function of AcXET and obtain transgenic plants, a plant expression vector pBIAcXET was constructed by recombinating the AcXET fragment from the cloning vector pMD19AcXET and the binary vector pBI121 between the XbaI and SmaI sites. The fragment of AcXET gene was inserted between the CaMV 35S promotor and the coding region of the GUS gene in pBI121. The identification results show that the plant expression binary vector pBIAcXET was constructed successfully. These results lay the foundation for studying the molecular mechanism of AcXET gene during wood formation.     

毛白杨蔗糖合酶基因PtSUS1的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次从毛白杨成熟木质部cDNA文库中分离出PtSUS1 cDNA全长,并进行了测序和序列分析。结果表明:克隆的毛白杨PtSUS1 cDNA片段总长为2703bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为2415bp,可编码长度为805个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtSUS1、水稻OsSUS1的蛋白质氨基酸序列同源性分别为83.4%,75.7%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtSUS1在成熟木质部表达丰度最高,在成熟叶片、根部和正在发育的木质部表达丰度中等,在韧皮部和形成层有少量表达,在嫩叶与顶端分生组织中表达丰度最低。在此基础上,组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件对毛白杨40株基因型个体的PtSUS1序列进行比对和分析,共检测到235个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/25bp,多样性指数π为0.00924。在外显子区域,共检测到66个SNP位点,其中55个为同义突变,10个为错义突变,1个为无义突变。在编码区内,非同义突变与同义突变的比率<1,这一结果显示在毛白杨物种演化过程中,纯化选择是PtSUS1基因内同义SNP位...     

多穗柯4-香豆酸辅酶A连接酶基因的克隆和表达分析

为了克隆多穗柯4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate-CoAligase,4CL)基因,了解其表达情况,从而为深入研究4CL基因分子功能及黄酮类化合物生物合成奠定基础,依据多穗柯转录组测序结果,设计特异性引物,PCR扩增得到4CL基因cDNA全长序列,利用相关软件进行生物信息学分析;采用qRT-PCR法检测4CL基因在不同器官中的表达情况,使用SPSS18.0软件分析其表达量与根皮苷含量间的关系。结果表明:多穗柯4CL基因cDNA全长1704bp,包含长1629bp的开放阅读框,编码含542个氨基酸的蛋白质。该蛋白定位于细胞质中,属亲水性蛋白。多穗柯4CL基因在除根以外的各个器官中均有表达,且表达量与根皮苷含量间呈极显著的正相关关系(P<0.01)。     

茶树2个MYB转录因子基因的克隆及表达分析

MYB类转录因子是一类包含一段保守的DNA结合结构域的基因家族,广泛地参与植物发育和植物次生代谢的调节。根据前期芯片杂交和文库筛选得到的2个MYB转录因子的部分序列,采用RT-PCR和RACE技术分离得到它们的全长基因:CsMYB1和CsMYB2,在GenBank的登录号分别为HQ660373和HQ660374。序列分析表明:CsMYB1基因全长1132bp,开放阅读框长879bp,编码292个氨基酸,推测的蛋白分子量约为32.9ku,理论等电点为8.13;CsMYB2基因全长1020bp,其中开放阅读框长675bp,编码224个氨基酸,推测的蛋白分子量约为25.4ku,理论等电点为9.05。2个基因编码的蛋白均具有明显的R2R3MYB结构域,且在R3结构域的下游都含有1个相对保守的C1(LIXXGIDPXTHR)基序。同源性分析表明:茶树CsMYB1和CsMYB2编码的氨基酸序列与其他植物的MYB类转录因子具有较高的相似性,其中CsMYB1编码的氨基酸序列与陆地棉MYB1的相似性为57%,CsMYB2编码的氨基酸序列与葡萄MYBC2的相似性为75%。利用荧光定量PCR技术检测2个转录因子基因在遮荫处理条件下的表达规律,及其在茶树不同组织中的表达特性,结果表明:CsMYB1和CsMYB2在不同组织中均有表达,但表达量具有明显区别,其中CsMYB2在叶片中的相对表达量是根中的100多倍;而遮荫处理能明显降低叶片中的花青素含量,并提高CsMYB1的表达,但对转录因子CsMYB2的影响不大。     

Cloning and Sequence Analysis of a Full-length cDNA Encoding Light-harvesting Complexes of Photosystem II in Phyllostachys edulis

The light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex plays an important role in photosynthesis of plants. A full-length cDNA of light-harvesting chlorophyll a/b （cab） gene was cloned from the first strand of Moso （Phyllostachys edulis） cDNA through RT-PCR and RACE methods, named as cabPhEIO （cab gene 10 from Ph. edulis）. The length of cab- PhEIO （GenBank accession number： EU118754） is 1 151 bp, which contains an open reading frame encoding 283 amino acids from 81st to 932nd position. The bioinformatics analysis indicated that the protein encoded by cab-PhElO had a chlorophll a/b binding domain （83rd -247th position）, two protein kinase C-phosphorylation sites, three Nmyristoylation sites and a yia A/B double helix domain.The amino acid sequence of cab-PhElO showed high similarity with the cab genes of Oryza sativa, Zea mays, Hordeum vulgare, and Vitis vinifera, more than 80%, respectively, which indicated that cab-PhElO gene belongs to lhcb5 gene family.     

毛白杨纤维素合酶基因PtCesA_4的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

组合利用生物信息学和RT-PCR方法,首次从毛白杨未成熟木质部cDNA中分离出PtCesA4cDNA全长,并进行测序和序列分析,结果表明克隆的毛白杨PtCesA4 cDNA片段总长为3 757 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为3 129 bp,可编码长度为1 042个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtCesA4、水稻OsCesA,和火炬松PtCesA2的蛋白质氨基酸序列同源性分别为80.3%,78.9%和75.6%.组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtCesA4基因在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PtCesA4在成熟叶片、未成熟木质部和成熟木质部中表达丰度最高,在根部和顶端分生组织表达丰度中等,在树皮和韧皮部有少量表达,在形成层中表达丰度最低.在此基础上,组合利用MEGA3.1和DnaSP4.50.4软件对毛白杨40株基因型个体的PtCesA4序列进行比对和分析,检测到153个单核苷酸多态性(sinsh nueleotide polymorphism,SNP)位点,SNP频率为1/35 bp,多样性指数π/0.005 02.其中51个是常见SNPs,102个为罕见SNPs.在这些SNPs中,有118个属于转换,35个属于颠换.在外显子区域,共检测到69个SNP位点,其中59个为同义突变,10个为错义突变.对PtCesA4基因内SNPs进行的连锁不平衡分析结果显示,随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连锁不平衡在基因内部迅速衰退,因此,在毛白杨中,基于PtCesA4基因的连锁不平衡作图是可行的,而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的.也是不必要的.研究结果为毛白杨PtCesA4基因的连锁不平衡作图及其基因辅助毛白杨木材纤维性状的分子育种提供了理论依据.     

杨树热激转录因子HsfA1d的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次由小叶杨受热激胁迫后构建的cDNA文库中扩增获得一热激转录因子HsfA1d cDNA克隆,测序结果表明克隆的PsHsfA1d cDNA片段总长为2036bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1449bp,可编码长度为482个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列在HSF DBD结构功能域与拟南芥AtHsfA1d和水稻OsHsfA1蛋白的相似性分别为86.3%和87.4%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PsHsfA1d主要在杨树叶片和根部组织中高丰度表达。非生物胁迫、激素及糖诱导表达表明,PsHsfA1d不仅受高温、干旱与盐诱导表达,还受到激素中GA_3与ABA,及葡萄糖与蔗糖信号的上调表达。组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.7软件对小叶杨36株基因型个体的PsHsfA1d序列进行比对和分析,共检测到207个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/16bp,多样性指数π为0.00772。在编码区域,共检测到69个SNP位点,其中37个为同义突变,31个为错义突变,1个为无义突变;非同义突变与同义突变的比率0.132<1,推测在小叶杨物种演化过程...     

小叶杨GA20氧化酶基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次从小叶杨未成熟木质部cDNA中分离出PsGA20Ox cDNA全长及其基因组DNA,并进行测序和序列分析.结果表明:克隆的小叶杨PsGA20Ox cDNA片段总长为1 403 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1 155 bp,编码区可编码长度为385个从残基,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥和水稻GA20Ox蛋白的同源性分别为66.0%和57.0%.组织特异性RT-PCR结果显示,PsGA20Ox基因在杨树茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PsGA20Ox在成熟木质部中表达丰度最高,在未成熟木质部和嫩叶中表达丰度较高,在顶端分生组织中有少量表达,在形成层组织中表达丰度极低.在此基础上,组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件对小叶杨36株基因型个体的PsGA20Ox基因组DNA序列进行比对和分析,检测到49个单核苷酸多态性(SNP)位点,频率为1/35 bp.其中,15个是常见SNPs,34个为罕见SNPs.在这些SNPs中,37个属于转换,12个属于颠换.在外显子区域,共检测到26个SNP位点,其中23个为同义突变,3个为错义突变.对PsGA20Ox基因内SNPs进行的连锁不平衡分析表明,随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连锁不平衡在基因内部就迅速衰退,因此,在小叶杨中,基于候选基因的连锁不平衡作图是可行的,而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的,也是不必要的.     

慈竹木质素合成酶基因4CL RNAi载体构建与烟草转化

根据慈竹4-香豆酸辅酶A连接酶(Na4CL)全长cDNA序列,通过RT-PCR从慈竹幼笋cDNA中扩增约600 bp的保守片段。DNAMAN多重比对分析表明,该目标片段与3条烟草4CL基因同源性达84.08%。将目标片段插入到pSK-int中间表达载体中,获得pSK-4CL-RNAi中间表达载体,然后将其转入植物双元表达载体pBI121中,构建该基因的shRNA表达载体,并利用农杆菌介导法转化烟草(K326)。对获得的抗性再生植株的PCR检测分析初步表明该基因已插入烟草基因组中。     

油茶乙酰辅酶A羧化酶BC亚基全长cDNA克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE、交错PCR等技术,获得了油茶乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因的全长cDNA克隆。该基因cDNA序列全长1 901 bp,含有一个1 599 bp的ORF,编码533个氨基酸残基。BC蛋白的等电点pI为6.88,分子量为58 509.3 u,含两个跨膜结构域,是一个不稳定的非分泌蛋白。模体搜索结果表明在BC上具有N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、ATP结合位点等多个功能结构域。同源建模的模型中发现12个α-螺旋,整个BC蛋白为一个内凹的结构。该基因已登录到GenBank,并被命名为co-bc。     

白桦APETALA2(AP2)转录因子基因的分离及其表达

白桦(Betula platyphylla Suk.)是我国常见阔叶树种,用途广泛。其花单性,雌雄花均为不完全花,只有两轮花器官,雌雄同株,其雌雄花发育特殊,同年生雌雄花异熟,花期不遇,且雄花发育存在越冬宿存现象[1]。这些不同于模式植物两性花的特征,预示着单性花发育的特殊性,具有重要的研究价值。     

Isolation and sequence analysis of a Dof protein gene (PtDof1) in Populus

Both cDNA and DNA clones of PtDof1 (GenBank Accession No. FJ402844 and FJ402845) were isolated from plants grown in tissue culture of Populus tomentosa. The DNA sequence is 1597 bp including two exons and one intron. The cDNA is 969 bp in length with a 765 bp open reading frame which is capable of encoding 255 amino acids. The deduced amino acids sequence of the PtDof1 protein shares 65%, 56% and 55% identity with Vitis vinifera (CAO48618), Nicotiana tabacum (CAA08755) and Glycine max (ABI16022) Dof protein by blast analysis in GenBank. Phylogenic analysis suggests PtDof1 gene could belong to the Dof gene family. PtDof1 protein contains an unusual conserved single zinc finger with the pattern of C-X2-C-X21-C-X2-C, which may play a functional role in tissue-specific expression and possibly the auxin response of endogenous plant genes.