玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞发育能力的影响

试验首次采用OPS法玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞(不带卵丘细胞,下同),同时尝试用EDFS30对小鼠卵巢进行细管法玻璃化冷冻,以研究GV期卵母细胞冷冻后的发育潜力。首先,利用MEM培养和MEM-腔前卵泡培养新鲜GV期卵母细胞,并把较好的培养方式用于冷冻后培养试验。2种培养方式培养24h后新鲜GV期卵母细胞成熟率无显著性差异;OPS法冷冻的GV期卵母细胞解冻后成熟率及体外受精后卵裂率与对照组差异不显著(P>0.05)。细管法冷冻卵巢组织的GV期卵母细胞成熟率极显著低于对照组(P<0.01),其受精后未获得受精卵。结果表明:OPS法可有效地冷冻保存小鼠GV期卵母细胞,而细管法冷冻小鼠卵巢对GV期卵母细胞损伤较大。     

玻璃化冷冻山羊卵母细胞效果研究

为了提高玻璃化冷冻保存山羊卵母细胞的效果,试验用不含Ca2+的玻璃化冷冻液1[30%乙二醇(EG)]、玻璃化冷冻液2[27.5%EG+2.5%二甲基亚砜(DMSO)]和玻璃化冷冻液3(25%EG+5%DMSO)研究抗冻保护剂DMSO和EG的不同浓度配比对山羊卵母细胞形态正常率、孤雌激活率、体外受精卵裂率及胚胎发育能力的影响。结果表明:山羊卵母细胞经玻璃化冷冻液1,2,3处理后细胞形态正常率(97.1%、97.3%、97.3%)与对照组(100%)相比有所降低,但差异不显著(P>0.05),且对卵母细胞均不产生具有化学毒性作用的孤雌激活;山羊卵母细胞经3种玻璃化冷冻液冷冻保存后,玻璃化冷冻液2冷冻保存卵母细胞的囊胚率(13.8%)显著高于玻璃化冷冻液1(5.7%)和玻璃化冷冻液3(5.1%)(P<0.05)。说明采用玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞可获得较为理想的效果。     

牛GV期卵母细胞冷冻保存后发育潜力的研究

二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)和甘油(GL)4种冷冻保护剂程序化冷冻牛GV期卵母细胞的结果表明,EG和PROH的保护效果比GL和DMSO好。4种不同冷冻方法冷冻保存牛GV期卵母细胞,比较解冻后卵母细胞的体外成熟率、受精后卵裂率。结果表明,在程序化冷冻法与细管玻璃化法(Straw)之间的差异不显著(P>0.05),在开放式拉管法(OPS)与毛细玻管法(GMP)之间的差异不显著(P>0.05);但OPS和GMP与程序化冷冻法和Straw之间的差异极显著(P<0.01)。玻璃化冷冻效果优于程序化冷冻。说明GMP和OPS玻璃化冷冻优于Straw玻璃化冷冻。说明可以采用GMP方法冷冻保存牛GV期卵母细胞。     

绵羊体外成熟卵母细胞OPS法玻璃化冷冻保存试验

研究以EDFS30为玻璃化冷冻液,以卵母细胞解冻后孤雌激活和体外受精后的卵裂率、囊胚发育率作为评价指标,探讨了以OPS法玻璃化冷冻保存体外成熟绵羊卵母细胞的效果。结果表明:卵母细胞孤雌激活后的卵裂率,冷冻组(64.2%)显著(P<0.05)低于毒性组(76.7%)和对照组(79.1%),而毒性组和对照组无显著(P>0.05)差异;卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率,冷冻组(4.2%)和毒性组(5.8%)均显著(P<0.05)低于对照组(20.2%),毒性组和冷冻组无显著(P>0.05)差异;冷冻组和毒性试验组卵母细胞体外受精后的卵裂率和囊胚发育率(67.6%和7.1%;62.3%和9.1%)均显著低于对照组(78.4%和28.4%)(P<0.05),而毒性组和冷冻组无显著(P>0.05)差异。可见以EDFS30为玻璃化冷冻液,采用OPS法冷冻保存绵羊体外成熟卵母细胞会在一定程度上降低其受精能力和胚胎发育能力。     

小鼠卵母细胞SSV法冷冻保存技术的研究

试验用2种前处理液(10%EG和10%EG 10%DMSO)和4种玻璃化冷冻液(EFS30、EFS40、EDFS30和EDFS40)对小鼠卵母细胞进行玻璃化(SSV)法冷冻保存,研究小鼠卵母细胞冷冻后的发育潜力。结果表明:小鼠未成熟卵母细胞形态正常率最高可达92.3%,成熟率达57.2%;成熟卵母细胞形态正常率最高可达91.5%。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展

卵母细胞冷冻保存对于畜牧业生产和人类辅助生殖具有重要意义。随着玻璃化冷冻技术日趋成熟，其现已广泛应用于牛、羊等大家畜的卵母细胞冷冻保存。然而，猪卵母细胞的冷冻保存至今仍处于试验研究阶段，由于猪卵母细胞脂质含量高，对低温敏感，在玻璃化冷冻保存过程中极易受到冷冻保护剂毒性以及渗透胁迫、氧化应激等损伤，造成细胞骨架以及亚细胞器受损，最终导致细胞发育能力降低甚至死亡。近年来，人们在提高猪卵母细胞冷冻保存效率的研究中取得了突破性进展。本文简要介绍了卵母细胞冷冻保存的常见方法及作用机理，总结了猪卵母细胞在玻璃化冷冻过程中造成的细胞损伤类型及影响，概述了人们针对不同类型的冷冻损伤提出的解决方法和取得的成就，并对其应用前景进行展望，为今后提高猪卵母细胞的玻璃化冷冻效率提供新思路。     

细胞松弛素B对玻璃化冷冻牛卵母细胞的影响

用不同浓度细胞松弛素B(CB)预处理体外成熟牛卵母细胞,以固体表面玻璃化(SSV)法冷冻解冻后的存活率和孤雌激活发育能力作为评价指标,探讨CB对体外成熟牛卵母细胞冷冻保存的影响。结果显示,存活率方面,各浓度CB处理组与对照组无显著差异(P0.05);激活后卵裂率方面,20μg/mLCB处理组显著高于对照组(47.67%和30.25%,P0.05);囊胚率方面,20μg/mLCB处理组极显著高于对照组(9.00%和1.75%,P≤0.01),同时还显著高于其他4个处理组(P0.05)。研究表明,CB在玻璃化冷冻过程中的保护作用存在一定浓度的依赖性,其中用20μg/mLCB浓度处理最适于牛成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果的改善。     

奶牛GV期卵母细胞OPS法和GMP法超低温冷冻效果

采用OPS管和GMP管对GV期的牛的卵母细胞进行玻璃化冷冻.在不同的前处理液中平衡5 min,然后在冷冻液(EFS30,EFS40,EDFS30或EDFS40)中平衡30 s,进行OPS法和GMP法玻璃化冷冻保存.结果显示,OPS法用EFS40液和EDFS40液冷冻后形态正常卵率为69.6%和76.1%,2组差异显著(P<0.05),成熟率最高达19.2%和33.3%,2组差异显著(P<0.05);GMP法用EFS40液和EDFS40液冷冻后形态正常卵率最高达75.6%和80.8%,2组差异显著(P<0.05),成熟率最高达15.6%和34.9%,2组差异显著(P<0.05).而采用EDFS40液,OPS法和GMP法对GV期卵母细胞体外发育的影响差异均不显著,但GMP法的冷冻效率较高.表明采用EDFS40液GMP法对GV期卵母细胞的冷冻效率优于OPS法.     

小鼠卵母细胞冷冻技术研究

采用PBS作为冷冻基础液,分别用甘油和二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护液,在程序化冷冻保存和玻璃化冷冻保存条件下,研究小鼠生发泡期(GV期)卵母细胞的抗冻能力。结果表明,2种冷冻方法对小鼠GV期卵母细胞解冻后形态正常率和存活率无显著影响(P>0.05)。冷冻保护剂种类对小鼠GV期卵母细胞解冻后形态正常率无显著影响(P>0.05);但对存活率有显著影响,玻璃化冷冻采用二甲基亚砜作为冷冻保护液效果极显著优于甘油(P<0.01)。以冷冻效果较好的二甲基亚砜作为冷冻保护液,采用玻璃化冷冻不同发育阶段(GV期和MⅡ期)的小鼠卵母细胞,解冻后形态正常率无显著差异(P>0.05),但存活率GV期要显著优于MⅡ期卵母细胞(P<0.05)。     

发育阶段对牛卵泡卵母细胞冷冻效果的影响

研究了用3种不同方法（A法：程序冷冻法：B法：超快速冷冻法；C法：玻璃化冷冻法）冷冻保存的牛GV期和IVM卵母细胞的发育潜力，结果表明，无论采取哪种方法。GV期卵母细胞的发育潜力均显著低于IVM卵母细胞。三种冷冻方法中，以玻璃化冷冻为最佳。     

纽胞松弛素B(CB)对水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的影响

研究主要探讨冷冻前细胞松弛素B(CB)预处理水牛M Ⅱ期卵母细胞对其冷冻效果的影响.以水牛M Ⅱ期的卵母细胞为材料,通过玻璃毛细管(GMP)和玻璃化冷冻液EDS33(16.5%EG 16.5%DMSO Sucrose)对水牛M Ⅱ期的卵母细胞进行两步法玻璃化冷冻保存,即卵母细胞首先放入预平衡液(7.5%EG 7.5%DMSO Sucrose)中平衡3 min,然后再移入玻璃化冷冻液中30 s后装管直接投入液氮.冷冻前卵母细胞随机分为2组,一组用7.5μg/mL CB预处理30 min,另一组未用CB预处理作对照组,然后都冷冻保存.解冻是在蔗糖浓度逐渐降低的解冻液中进行的.解冻后存活的卵母细胞进行孤雌激活,以分裂率和囊胚发育率作为评定卵母细胞冷冻效果的指标.结果发现,GMP组和GMP CB组卵母细胞解冻后的存活率(88.89%、94.20%)和培养后发育到囊胚的比率(8.82%、14.55%)差异均不显著(P＞0.05),但GMP组和GMP CB组存活卵母细胞激活后的分裂率差异显著(32.69%、55.56%,P＜0.05),所以细胞松弛素B预处理可以提高GMP冷冻卵母细胞的发育能力.     

未成熟牛卵母细胞与成熟牛卵母细胞冷冻保存的比较

试验以OPS玻璃化冷冻为方法,以成熟和未成熟牛卵母细胞为材料,研究冷冻保存效果与卵母细胞成熟度的关系.一组将牛卵母细胞从牛卵巢内取出后直接进行冷冻,另一组将牛卵母细胞从牛卵巢内取出后先置于TCM199 FSH的培养液中培养20～22 h,即进行体外成熟后再进行两步法冷冻,两步法解冻后检测卵母细胞的存活率.结果表明,牛体外成熟卵母细胞冷冻效果较未成熟卵母细胞冷冻效果好,卵母细胞的存活率为48.1%,未成熟牛卵母细胞冷冻效果较成熟卵母细胞冷冻效果差,卵母细胞的存活率为35.1%.     

绵羊体内外受精胚胎玻璃化冷冻保存

用 EFS4 0溶液对绵羊体内外受精的早期囊胚进行了玻璃化冷冻保存的研究。经卵母细胞体外成熟、体外受精和体外培养获得的早期囊胚 ,分别作如下处理 :( A) 1 0 %EG中预处理 5min后 ,在 EFS4 0平衡 3 0 s(两步法 ) ;( B) EFS4 0中平衡 1 min(一步法 ) ;( C) EFS4 0中平衡 2 min(一步法 )。然后投入液氮中冷冻保存 ,解冻胚胎的继续发育率分别为 80 %、78%和 50 %,A、B2组的结果与对照组 ( 88%)无显著性差异 ( P >0 .0 5)。经超数排卵获得的体内受精早期囊胚用两步法冷冻保存 ,解冻后胚胎发育继续率为 89%,与对照组( 93 %)也无显著性差异 ( P >0 .0 5)     

昆明小白鼠卵巢玻璃化冷冻的研究

为了探讨小鼠卵巢组织玻璃化冷冻时适宜的平衡时间和冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)的适宜浓度,试验采用不同平衡时间(10 min、15 min、20 min)及不同浓度(15%、20%、25%)的DMSO作为冷冻保护剂对2月龄昆明小白鼠的卵巢组织进行处理,处理后的卵巢组织采用玻璃化冷冻法进行冷冻,用解剖法采集冷冻解冻后的卵巢卵母细胞,通过对卵母细胞染色及体外成熟培养判定卵巢的冷冻效果。结果表明:以平衡时间为20 min的试验组小鼠卵巢冷冻效果较好,其卵母细胞存活率为65.0%,卵母细胞成熟率为27.4%;DMSO浓度则以20.0%为宜,冷冻解冻后卵巢内卵母细胞染色后存活率为66.7%,体外培养后卵母细胞成熟率为38.3%。     

牛卵泡卵母细胞的体外成熟和冷冻保存

在简化牛卵母细胞体外成熟的基础上,观察了保护剂、平衡温度、预平衡方法、解冻方法以及冷冻方法对牛卵泡卵母细胞冷冻的影响。结果表明:在体外成熟培养液中添加26.2 mmol/L的NaHCO3和对屠宰场卵巢进行选择更能促进牛卵母细胞的体外成熟;无论是程序冷冻还是玻璃化冷冻,乙二醇(EG)与甘油(GLY)相比更能促进牛卵泡卵母细胞的冷冻效果;在程序冷冻中,冷冻液中添加0.1 mol/L蔗糖比添加0.3mol/L的蔗糖更能促进牛卵泡卵母细胞的冷冻;在玻璃化冷冻中,37℃和25℃的平衡温度比4℃更适合牛卵泡卵母细胞的冷冻;在10%、5%、1%的预平衡浓度之间,5%的预平衡浓度即可达到预平衡的效果;在解冻时,多步脱除保护剂更能保护冷冻的卵母细胞;比较了几种最小样本量(minimum size sample,MSS)玻璃化冷冻方法,解冻成熟培养后的成熟率,拉细毛细玻璃管冷冻法为(41.67±3.19)%,极显著高于未拉细毛细玻璃管冷冻法(glassmicropipette,GMP)的(30.19±1.93)%和固体表面冷冻法(solid surface vitrification,SSV)的(28.33±2.89)%(P<0.01)。     

不同冷冻和解冻方法对绵羊卵母细胞发育效果的影响

卵母细胞冷冻保存具有广泛而潜在的应用价值.试验主要分析了不同冷冻及解冻方法对绵羊GV期和MII卵母细胞发育效果的影响.GV期卵母细胞程序化冷冻解冻后形态正常率(54.8%)以及体外培养成熟率(14.7%)均显著低于细管玻璃化(71.8%,29.5%;P＜0.05)和OPS玻璃化(78.3%、35.4%;P＜0.05),卵裂率OPS玻璃化高于细管玻璃化,但差异不显著(26.1%,16.7%;P＞0.05);MII期卵母细胞形态正常率程序化冷冻显著低于细管玻璃化和OPS玻璃化冷冻(67.2%,77.6%,84.8%;P＜0.05),卵裂率OPS玻璃化显著高于程序化冷冻法(31.3%,10.3%;P＜0.05);3种不同方法冷冻不同发育时期卵母细胞成熟率和卵裂率与对照组相比较均差异极显著(P＜0.01).解冻后卵母细胞形态正常率三步与五步解冻法极显著高于一步解冻法(85.9%,82.7%,63.1%; P＜0.01);成熟率为三步法和五步法显著高于一步法(10.8%,26.9%,25.3%;P＜0.05);卵裂率三步法和五步法高于一步法,但没有差异显著性(14.3%,23.9%,21.1%; P＞0.05).     

卵巢玻璃化冷冻保存研究进展

卵巢玻璃化冷冻是一种操作简单、冷冻效果好的卵巢组织冷冻降温技术,对动物繁殖能力保存、物种保护、生物多样性保存,以及动物胚胎工程和人类临床医学研究与应用等具有重要意义。卵巢组织冷冻保存较卵母细胞冷冻保存,具有明显的优点。在冷冻保护剂的选择、冷冻材料、冷冻平衡及冷冻方法上都有其特殊之处。卵巢组织冷冻保存技术已在人类医学临床上发挥其应用价值。     

玻璃化冻存对蒙古驴卵母细胞甲基化及GFM1、MRPL15基因表达水平的影响

旨在探讨玻璃化冷冻对驴卵母细胞发育的影响。采集新鲜驴卵巢组织,将收集的卵母细胞分别按以下3种方式进行处理:直接冷冻(T1组)、冷冻复苏+成熟处理20h(T2组)、冷冻复苏+成熟处理40h(T3组);同时,取新鲜的GV期卵母细胞,分别设置相应的对照处理方式:新鲜细胞不进行成熟处理(C1组)、成熟处理20h(C2组),成熟处理40h(C3组)。各处理组细胞经转录组测序后,采用Trimmomatic(v0.36)软件对原始数据进行过滤,并对后续数据进行分析。过滤后将原始数据与参考基因库比对,进行注释分析和甲基化位点识别,比较各处理组之间的甲基化水平。结果显示,T1、T2组甲基化水平分别大于C1、C2组,T3组甲基化水平小于C3组;各冷冻处理组卵母细胞的CpGs甲基化水平为T1组>T2组>T3组。共选择出总体差异基因1269个,玻璃化冷冻处理细胞与未冷冻处理细胞之间具有差异的基因确定为677个。GFM1与MRPL15基因甲基化差异最为显著,基因通路富集到线粒体延伸途径中,这是导致玻璃化冷冻后驴卵母细胞成熟率较低的因素。研究结果为确定卵母细胞冷冻最佳条件奠定了试验基础。     

小鼠卵母细胞和胚胎不同冷冻方法的比较研究

探讨程序化冷冻与玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞及二细胞期胚胎的复苏率及其发育潜能的影响。通过小鼠的卵母细胞与早期胚胎的不同冷冻方法的比较,为后续阿旺绵羊的胚胎冷冻保存提供参考。采用程序化冷冻与玻璃化冷冻技术,分别冷冻小鼠GV期卵母细胞及二细胞期胚胎,复苏后培养,比较不同冷冻处理后的复苏率、成熟率与囊胚率。小鼠GV期卵母细胞程序化冷冻复苏率(48.00%±5.29%)显著低于玻璃化冷冻复苏率(65.00%±5.00%),有统计学差异(P=0.0147<0.05);而程序化冷冻后复苏卵母细胞的发育成熟率略高于玻璃化冷冻组,但无统计学意义。小鼠二细胞期胚胎程序化冷冻组复苏率(76.00%±2.00%)显著高于玻璃化冷冻组复苏率(70.00%±2.00%),有统计学差异(P=0.0213<0.05);冷冻后复苏胚胎发育的囊胚率程序化冷冻略低于玻璃化冷冻及对照组,但无统计学意义。     

昆明小鼠成熟卵母细胞冷冻保存方案的优化与改进

5-6周龄雌性昆明小鼠的成熟卵母细胞,在不同前处理液(10% EG或10% EG 10% DMSO)中平衡5 min,然后在冷冻溶液(EFS30、EFS40、EDFS30或EDFS40)中平衡30 s后进行开放式拉长麦管法(OPS,open pulled straw)和固体表面冷冻法(SSV,solid-surface vitrification)玻璃化冷冻保存研究.试验结果表明:玻璃化冷冻中,多种抗冻保护剂组合使用的效果优于使用单一抗冻保护剂,而且EDFS冷冻液冷冻保存小鼠卵母细胞的效果好于EFS,尤其是EDFS30;SSV法冷冻保存小鼠成熟卵母细胞效果优于OPS法.