霸王的原生质体培养及植株再生研究

本研究建立了霸王原生质体再生植株的试验体系。以子叶切块诱导的松软愈伤组织为材料,通过酶法分离出大量有活力的原生质体,原生质体经培养持续分裂形成了愈伤组织,并分化出再生苗。比较了不同培养基和培养密度对原生质体分裂和再生的影响。结果表明,原生质体以2×10⁵个/mL的植板密度,采用液体浅层法培养在附加1.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.2 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、0.2 mg/L激动素(KT)、500 mg/L水解酪蛋白(CH)、2%蔗糖和0.5 mol/L甘露醇的DPD培养基中,可获得最佳效果,其细胞分裂频率达28.4%左右。转移到附加1.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L萘乙酸(NAA)的MS分化培养基上,获得大量的再生苗。     

草地早熟禾午夜Ⅱ号原生质体培养及植株再生

对草地早熟禾(Poa Pratensis L.)品种-午夜Ⅱ号进行了原生质体培养及其植株再生的研究。以午夜Ⅱ号成熟种子诱导的松软胚性愈伤组织为材料,利用酶解法分离出大量有活力的原生质体。原生质体经培养,持续分裂形成愈伤组织,并分化出再生绿苗和白化苗。研究了不同酶液组成和酶解时间对原生质体游离的影响。结果表明:采用继代培养8-10 d的胚性愈伤组织在1.0%纤维素酶+1.0%离析酶+0.5%果胶酶+0.3%崩溃酶条件下,酶解14-16 h可得到产量和活力较高的原生质体。原生质体以2.0×10⁵-5.0×10⁵个/mL的植板密度,采用液体浅层法在附加1.0 mg/L 2,4-D、0.3 mg/L 6-BA、100 mg/L水解酪蛋白、100 mg/L水解乳蛋白、1.0%蔗糖、0.4 mol/L甘露醇的KM₈P培养基中培养,可形成较小的愈伤组织。愈伤组织经过增殖在分化培养基上(MS+0.5mg/LNAA+2.0 mg/L 6-BA)可诱导芽、根的形成,再生出完整植株。     

苜蓿原生质体电融合适宜条件的筛选

为改良培育苜蓿(Medicago)新品种,拟建立苜蓿原生质体融合体系.通过电融合方法,使俄罗斯杂花苜蓿(M.varia)原生质体和甘农4号紫花苜蓿(M.sativa‘Gannong No.4’)原生质体进行非对称融合,获得了杂交细胞,研究不同失活处理条件、电场条件、原生质体密度对苜蓿原生质体融合的影响.结果表明:经过紫外灯辐射5min的俄罗斯杂花苜蓿原生质体和6 mmol· L-1 IOA处理的甘农4号紫花苜蓿原生质体,密度调至3×105～5×105个·mL-1,以交流电场强度15～20 V·cm-1、交流频率2000～2500 kHz,直流脉冲场强200～250 V·cm-1、脉冲宽幅40 μs、脉冲个数为3的条件为最适电融合条件,此时一对一有效融合率最高可达13.8％.     

不同荧光染料对苜蓿原生质体染色效果的研究

以紫花苜蓿品种甘农4号(Madicago sativa L.‘Gannong No. 4’)愈伤组织酶解的原生质体为材料,采用FDA、罗丹明B、罗丹明6G、吖啶橙和DAPI共5种荧光染料对原生质体进行染色效果比较,以期为原生质体活力测定、细胞核计数及原生质体融合过程的观察提供参考。结果表明:FDA、罗丹明B、罗丹明6G和吖啶橙均可使紫花苜蓿原生质体清晰染色,可用于细胞融合时亲本原生质体的标识。FDA是检测原生质体活力的理想染料;吖啶橙和DAPI可对细胞核进行特异性染色,可用于融合时细胞核的观察和计数,前者还可用于检测融合细胞的活力。通过对异源融合体的鉴别及其活力的测定,为摸索融合条件和融合细胞的培养提供了理论依据。     

甘肃野生草地早熟禾原生质体分离与培养研究

建立高效的原生质体再生体系是通过原生质体融合技术培育草地早熟禾(Poa pratensis)新品种的重要前提。以甘肃陇西野生草地早熟禾(LX)和定西野生草地早熟禾(DX)胚性愈伤组织为材料,探索其原生质体游离和培养条件。结果表明,LX和DX原生质体分离的最佳酶液组合为1.5%纤维素酶R-10+0.5%果胶酶Y-23+1.0%离析酶R-10+0.3%崩溃酶;酶解时间为16 h;LX原生质体最适宜的甘露醇浓度为0.6 mol·L-1,而DX原生质体的最适甘露醇浓度为0.5 mol·L-1。LX原生质体的产量最高可达6.59×106个·g-1,DX可达5.95×106个·g-1。DX原生质体培养的最适密度为3.0×105个·m L-1,最适2,4-D浓度为1.0 mg·L-1,此时,DX原生质体再生细胞的分裂频率可达9.56%,植板率为4.62%。     

桑树原生质体分离条件的优化试验

为了分离获取高产量、高活力的桑树原生质体,分别以桑树的组培苗细切叶片、胚性悬浮培养细胞、粗切愈伤组织和细切愈伤组织等为材料,采用正交试验和单因素试验的方法对桑树原生质体酶解分离条件中的分离酶液组合、渗透压调节剂、酶解温度、酶解时间等因素进行优化。最佳分离酶液组合为100 U/mL纤维素酶R-10+150 U/mL果胶酶Y-23+6 U/mL离析酶R-10+细胞-原生质体洗液(1 480 mg/L CaCl2.2H2O,27.2 mg/L KH2PO4),以0.6 mol/L甘露醇为渗透压调节剂,在28℃酶解温度条件下酶解6 h,用桑树胚性悬浮培养细胞作分离材料可获得7.8×106个/g的原生质体产量,且原生质体活力达91.4%。研究结果显示,选择合适的分离材料以及酶解分离条件是高效获取高活力桑树原生质体的关键。     

紫花苜蓿愈伤组织耐NaCl变异体的诱变筛选与初步鉴定

本试验应用植物组织培养技术。甲基磺酸乙酯(EMS)作为一种化学诱变剂,被以处理紫花苜蓿的愈伤组织,初步研究了紫花苜蓿愈伤组织耐盐变异体的诱变,筛选和鉴定。试验采用在培养基中以不同浓度和组合的2、4-D。KT,NA A NAA和蔗糖等处理,研究了它们对紫花苜蓿愈伤组织的诱导,植株的再生以及根系的诱导影响。从而建立了一个有效的紫花苜蓿组织培养系统。它包括:诱导和保持愈伤组织的脱分化培养基(4mg/l     

miR396-MsGRFs参与调控紫花苜蓿愈伤组织再生

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)愈伤组织再生率受基因型限制,是影响苜蓿遗传转化效率的主要因素之一。研究发现,GRF转录因子家族基因在提高多种植物愈伤再生中起着重要促进作用。本试验以拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGRF序列为模板,在紫花苜蓿基因组序列中查找,获得了含有miR396靶点的9个MsGRFs基因。除MsGRF3a和MsGRF4a外,其余7个MsGRFs在紫花苜蓿胚性愈伤组织中的表达量均显著高于非胚性愈伤。为了进一步研究MsGRFs对紫花苜蓿愈伤再生效率的影响,我们在紫花苜蓿中转入MIM396基因,降低miR396的表达。结果显示：MIM396植株叶片愈伤组织再生时间显著缩短,再生率显著提高;与野生型愈伤组织相比,在MIM396植株叶片诱导的愈伤组织中,除MsGRF3a外,其余MsGRFs显著高表达。以上研究表明,miR396-MsGRF通路对苜蓿愈伤组织再生起着重要调控作用,这为提高苜蓿再生效率,并打破基因型对不同苜蓿品种再生的限制提供候选基因。     

紫花苜蓿不同栽培品种植株再生的研究

离体培养条件下对紫花苜蓿地方栽培品种--陇东苜蓿、和田苜蓿、准格尔苜蓿以及引进品种Rambler苜蓿植株不同部位的再生进行了研究,结果表明,不同的苜蓿品种、外植体、外源激素种类及其浓度等因素均影响着植株的再生.陇东苜蓿下胚轴愈伤组织出愈率和体细胞胚形成率最高可达91.04%和63.75%;和田苜蓿下胚轴愈伤组织出愈率最高可达92.05%,体细胞胚形成率最高为56.82%.这2个品种在紫花苜蓿的组织培养植株再生中是较理想的试验材料;紫花苜蓿下胚轴是理想的受体材料.苜蓿愈伤组织的诱导、体细胞胚的形成以2.0 mg/L 2,4-D处理2周为最佳;在2.0 mg/L 2,4-D 0.5～2.0 mg/L 6-BA的作用下,外植体产生愈伤组织以及进一步发育的趋势较强.对体细胞胚的发育和幼苗的形成则以2.0 mg/L 6-BA 0.5 mg/L NAA的激素组合进行处理.适宜的生根培养基为1/2 MS 1.0 mg/L IBA 1%蔗糖 0.7%琼脂.     

俄罗斯杂花苜蓿愈伤组织原生质体游离与培养条件的优化

对俄罗斯杂花苜蓿(Medicago varia)原生质体游离和培养条件进行优化,建立其原生质体融合的体细胞杂交体系.以下胚轴诱导所碍愈伤组织为材料进行原生质体游离,研究酶液组合、渗透压调节物甘露醇浓度、酶解时间、愈伤组织继代时间及预处理措施对原生质体游离效果的影响,以及激素浓度与培养密度对原生质体培养的影响.结果表明:最佳酶液组合为2％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.3％离析酶,最佳渗透压为0.55mol/L,最佳酶解时间为12h,愈伤组织继代培养至14d的游离性最佳;固—液综合培养条件下最适激素组合为1.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA,最适原生质体培养密度为3×10 5个/mL.     

牛皮蝇HA抗原基因转化紫花苜蓿的研究

以“甘农1号”紫花苜蓿(Medicago sativa)7 d苗龄子叶和下胚轴为受体材料,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系,筛选出MS+2,4 D 2.0 mg/L+6 BA 0.5 mg/L和MS+6 BA 0.5 mg/L+NAA 0.03 mg/L+GA3 2.0 mg/L为苜蓿子叶愈伤组织诱导和分化的适宜培养基;探讨了农杆菌浓度OD600约0.5、感染时间8~10 min、共培养时间2 d为适宜的转化条件。采用农杆菌介导法将Hyperdomin A（HA）基因导入紫花苜蓿,经PCR检测和Southern分子杂交分析,结果表明HA基因已经整合到苜蓿基因组中,可为牛皮蝇蛆病可食性疫苗的研究提供理论基础。     

耐亚磷酸盐紫花苜蓿品种筛选及评价指标的鉴定

亚磷酸盐是正磷酸盐的一种还原形态,具有溶解度高、运输效率高、与土壤反应活性低等优势。通过探讨不同紫花苜蓿品种苗期对亚磷酸盐的耐逆能力,旨在为紫花苜蓿耐亚磷酸盐品种筛选和亚磷酸盐新型磷肥的开发提供科学依据。以37个紫花苜蓿品种为试验材料,设置正磷酸盐（0.5 mmol·L^-1 KH₂PO₄）和亚磷酸盐（0.5 mmol·L^-1 KH₂PO₃）两个处理,测定不同品种幼苗的株高（PH）、茎粗（SD）、茎叶磷含量（SPC）、茎叶干重（DWS）、根干重（DWR）、根冠比（RSR）、总根长（RL）、根表面积（RSA）、根磷含量（RPC）、叶绿素含量（Chl）、叶面积（LA）、净光合速率（P_n）12个形态和生理指标变化情况。以各单项指标的耐亚磷酸盐系数（PTC）作为衡量依据,运用主成分分析、隶属函数分析、聚类分析和逐步回归等方法对其耐亚磷酸盐的特性进行综合评价并建立数学模型。在亚磷酸盐胁迫下,不同紫花苜蓿品种根磷含量和叶绿素含量增加,其余指标均显示下降。通过主成分分析,可将12个单项指标转换成5个相互独立的综合指标,根据耐亚磷酸盐综合评价值和聚类分析,可将37个品种划分为4个类别,其中,高度耐亚磷酸盐包括WL903和可汗2个,中度耐亚磷酸盐12个,低耐亚磷酸盐17个,亚磷酸盐敏感型6个。进一步利用逐步回归方法建立了耐亚磷酸盐特性的评价回归模型Y=-0.174+0.102PH+0.189DWR+0.168 RL+0.187RSA-0.061P_n （R²=0.9908）,且各品种对回归方程的估计精度均大于93.22%。综合表明：高度耐亚磷酸盐的品种有可汗和WL903;在亚磷酸盐胁迫下,株高、根干重、总根长、根表面积和净光合速率等可作为紫花苜蓿品种耐亚磷酸盐特性强弱的快速鉴定和预测指标。     

苜蓿褐斑病接种方法研究

以苜蓿假盘菌为接种菌源,对3个不同抗性的苜蓿品种(即伊鲁瑰斯、沙湾和泾阳)采用3种活体整株接种方法,即接种盘倒扣接种法、活体病株覆盖接种法和孢子悬浮液喷雾接种法,进行比较,以筛选出稳定、可靠、操作简便、发病速度较快的接种方法.结果表明,病株覆盖接种和孢子悬浮液喷雾接种为较理想的接种方法,可以比较准确、快速的鉴定出品种及单株的抗病性,其中孢子悬浮液最佳缓冲液组成为:0.5%吐温-20 4.5%葡萄糖 9mg/L萘乙酸 1g/L菌落.     

不同秋眠性苜蓿SRAP体系优化及遗传多样性分析

用改良CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取苜蓿基因组DNA,用L₁₆(4⁵)正交设计,研究了模板DNA、dNTPs、Mg²⁺、Taq酶和引物的浓度对扩增迁移率重现性的影响,结果表明,在20 μL体系中含有50 ng DNA、1.4 mmol/L Mg²⁺、1.2 U Taq酶、0.4 mmol/L dNTPs和0.25 μmol/L浓度的引物最为稳定,重现率达到100%。利用最佳体系从100对引物中筛选出8对在34个苜蓿上扩增效果好的引物,共扩增出87个SRAP标记,有84个多态性位点。聚类分析结果表明,来自安徽和江苏两地的野生南苜蓿和其他栽培苜蓿的遗传差异最大,单独聚为一类;其他32个苜蓿品种在相似系数0.68附近聚为3个亚群,秋眠型苜蓿品种主要分布在第2个亚群中,半秋眠和非秋眠型苜蓿品种分布散乱,并不表现出成族分布,表明秋眠性与苜蓿的亲缘关系不完全一致。     

高寒地区紫花苜蓿农艺性状与产量形成关系的多重分析

对15份紫花苜蓿（Medicago sativa L.）种质的8个农艺性状与产量的形成关系进行多重分析.结果表明：①紫花苜蓿主要农艺性状的变异系数达15.08％～38.76％,且茎粗（0.8538）、单株分支数（0.8432）、主枝侧枝数（0.6341）、节间长（0.9259）、茎叶比（0.6848）和株高（0.5952）与产量呈（极）显著正相关.②通径分析显示：8个农艺性状对产量直接作用大小的顺序依次为：单株分支数＞主枝侧枝数＞节间数＞叶长宽比＞茎粗＞节间长＞株高＞茎叶比.③主成分与回归分析显示,单株分支数、主枝侧枝数、节间数和叶长宽比4个农艺性状对产量形成的贡献最大,是构成产量的主要因素.④筛选评比发现,普拉蒂尼、三得利和游客这3种紫花苜蓿在天祝高寒地区适应性强,草产量高,适合在全县大面积推广种植.     

灌溉量对紫花苜蓿水分利用效率和耗水系数的影响

采用大型非称重式蒸渗仪法,在河北省坝上地区研究了灌溉量对紫花苜蓿（Medicago sativa L．）水分利用效率和耗水系数的影响。结果表明：随着灌溉量的增加,第1、2、3莅和全生长季（1～3茬）生物产量和经济产量水分利用效率皆呈现先升后降的趋势;第1茬中灌溉量处理显著高于低和高灌溉量处理（P〈O．05）。随灌溉量增加,各茬次和全生长季（1—3茬）生物产量和经济产量耗水系数均呈先降后升趋势;第1茬中灌溉量处理显著低于低和高灌溉量处理（P〈0．05）。不同茬次间水分利用效率及耗水系数差异显著（P〈0．05     

54Q53紫花苜蓿愈伤组织诱导及再生初探

为建立高效诱导54Q53紫花苜蓿(Medicago sativa)愈伤组织体系,分别研究2种细胞分裂素,3种外植体及4种培养基对愈伤组织诱导的影响,并优化细胞分裂素和生长素的浓度组合.结果表明,采用下胚轴作为外植体在MS基本培养基上添加2.0 mg/L2,4-D+0.5 mg/L 6-BA为最佳诱导愈伤组织方案.另外,...     

紫花苜蓿保卫细胞原生质体的制备

为了获得紫花苜蓿(Medicago sativa)保卫细胞原生质体,并为后续的紫花苜蓿保卫细胞原生质体的相关研究奠定基础,本研究探索了适合紫花苜蓿保卫细胞的提取方法。利用研磨和匀浆机处理的方式获得表皮条,将获得的表皮条再通过两步酶解法去除残留的叶肉细胞和细胞壁,并经多次过滤和离心获得保卫细胞原生质体。最后统计原生质体数目并用FDA染色检测保卫细胞原生质体活性。结果表明,本研究成功分离并获得了高活性的紫花苜蓿保卫细胞原生质体。每5片成熟叶获得1 000个保卫细胞原生质体,经FDA染色后在荧光下显示活性保卫细胞原生质体占90%以上。