澳大利亚香蕉组织培养研究进展

香蕉是澳大利亚一种主要亚热带水果，主要分布在昆士兰州及新南威尔士州的部分地区．与世界各国一样，其香蕉业的发展也受到香蕉束顶病因ananaBunChyTopVirus）、香蕉镰刀菌枯萎病ousa。mOxyspo。mf．spCubense）及香蕉叶斑病（MrcosPhacrcllafiyCnsls和MycosphaercllamasiCola）的严重威胁．八十年代以来，农业科研单位在努力寻找新方法、新技术来解决这一难题．以昆士兰马卢奇园艺研究所（MaroodHortlcu【tUralResearChStun。if）等为代表的科研机构，全面应用组培技术，在香蕉品种改良；抗病资源筛选；病毒脱除及快速检测；潜在优…     

香蕉束顶病毒海口分离物Rb蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗血清制备

应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆了Rb(Rb-binding-like protein)基因的编码区,将其插入原核表达载体pET-28b中构建重组质粒pET28b-Rb。转化重组质粒的E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为22.6ku,且主要以包涵体形式稳定表达。目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后免疫家兔并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的BBTV编码Rb蛋白发生特异性反应。间接ELISA法测定的抗血清效价大于1:250000。用抗血清对感病香蕉和健康香蕉进行检测,结果表明,抗血清对感病香蕉有很高特异性,最佳工作浓度为1:1500。     

香蕉束顶病毒Haikou 2分离物DNA2编码框原核表达及抗血清制备

香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是危害香蕉的主要病毒之一,严重威胁着香蕉的生产.BBTV基因组至少由6个环状ssDNA组分组成,其中DNA2组分变异最大,是否编码蛋白及其功能缺乏研究.本研究通过PCR方法克隆了BBTV Haikou2 DNA2ORF,将其构建到pET32a载体中,进行原核表达和抗血清制备.结果表明重组表达载体pET32a-DNA2ORF在表达菌Transetta(DE3)中表达一个约21 ku的特异融合蛋白,通过超声波破碎仪破碎细胞和诱导条件优化,分析表明,该蛋白主要以可溶形式存在,最佳表达条件为30℃、1.0 mmol/L IPTG诱导3h.融合蛋白经过Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化,免疫家兔制备出抗血清.Western blot实验表明抗血清具有特异性; 酶联法(ID-ELISA)测定表明,抗血清效价达到25 000,能够检测出香蕉汁液中加入的0.954 μg/mL浓度的表达纯化蛋白.     

香蕉束顶病毒海口分离物CP基因的原核表达、纯化及其抗血清制备

用PCR方法从感染香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增外壳蛋白(coat protein,CP)基因。回收目的片段,经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后与同样酶切的质粒载体pET30a(+)相连接,酶切验证及测序结果获得了含BBTV CP基因的重组质粒pET30a-CP。将重组质粒转化Codon plus表达菌,在25℃、0.4mmol/L IPTG条件下诱导6h或过夜,经12%SDS-PAGE电泳分析可知,该重组菌表达了一个与预期分子量大小一致的His-CP融合蛋白,约为30ku,且主要以包涵体的形式存在。多次洗涤包涵体后得到高纯度的融合蛋白,用其免疫家兔,获得BBTV CP蛋白抗血清。间接ELISA法测定抗血清效价大于51200。Western blot分析表明,抗血清能与融合蛋白特异性结合。     

应用实时荧光定量PCR研究BBTV DNA1在香蕉不同组织中的含量

为准确定量香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)DNA1组分在香蕉组织中的分布和含量,建立以SYBR Green-I荧光染料为标记的实时荧光定量PCR(Real Time Fluorescence Quantitative PCR)方法。利用B1-F/B1-R引物扩增海南BBTV DNA1组分并构建到pMD18T sample载体,再以B2-F/B2-R引物测定该质粒的标准曲线,其线性方程为Y=-3.247×LOG(X)+8.01,相关系数r2=0.997,扩增效率为103.2%,标准质粒检测灵敏度约为214 copies/μL。分别选取染病香蕉的嫩叶、叶鞘、假茎和球茎各100 mg,提取DNA并进行实时荧光定量PCR检测。结果表明:病株各部位均含BBTV病毒,但含量有明显差异,其中嫩叶(3.08×108 copies/mg)叶鞘(2.50×108 copies/mg)假茎(1.29×108 copies/mg)球茎(1.67×107 copies/mg),呈依次递减。     

蒸汽爆破预处理降解香蕉茎秆纤维素组分的研究

分析测试香蕉茎秆总固体含量(TS)和挥发性固体含量(VS)及香蕉茎秆固体剩余物中纤维素、半纤维素、木质素含量;采用蒸汽爆破法对香蕉茎秆进行预处理,探讨不同压力及维压时间下对香蕉茎秆中半纤维素、纤维素、木质素组分的降解程度,分析蒸汽爆破预处理优缺点。试验结果表明,经过蒸汽爆破预处理后,香蕉茎秆的组分被不同程度破坏,当压力为3.5 MPa,维压时间为4 min时,香蕉茎秆中半纤维素含量由预处理前13.33%降至4.36%,降解率高达67.29%,纤维素含量由48.33%降至39.15%,降解率为18.99%,木质素含量由14.62%降至6.52%,降解率为55.40%,总体含量由76.28%降至50.03%,降解率为34.41%。说明蒸汽爆破技术对香蕉茎秆固体剩余物的预处理效果比较显著,有一定的优越性。     

香蕉束顶病毒海口分离物NSP基因的原核表达

应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆NSP (Nuclear shuttle protein)基因的编码区,并通过Gateway技术定向重组到原核表达载体pDEST~(TM)-17中的6xHis标签下游,经菌落PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了原核表达载体pDEST~(TM)-17-NSP.阳性克隆转化Ecoli BL21(DE3),经IFFG诱导表达、SDS-PAGE分析和western blot检测,结果显示,融合蛋白以包涵体的形式稳定表达,分子量约为20 ku,与预计值相符.通过诱导条件的优化,确定了最佳的融合蛋白表达条件为25℃、0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4h.从而为制备NSP多克隆抗体和进一步研究NSP的功能奠定了基础.     

海南香蕉花叶病病毒分离物的研究

对海南产区感染花叶病的香蕉病株进行生物学分离获得一种直径为28—30nm的球形病毒分离物,该分离物汁液接种可引起香蕉花叶症状,并侵染一些黄瓜花叶病毒(CMV)的诊断寄主植物,提纯病毒外壳蛋白由一种分子量约为3.2×10~6道尔顿的亚基构成,琼脂免疫双扩散试验表明,该病毒分离物和CMV有血清学关系,根据这些性质该病毒分离物被鉴定为黄瓜花叶病毒。     

海南香蕉花叶病的研究

鉴定结果表明，海南香蕉花叶病的病原病毒为黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）。该病毒可通过莴苣指管蚜、玉米蚜和豆蚜传播。首次发现假败酱、白落葵、鸡蛋果三种植物是人工接种的新寄主。该病毒可制备抗血清，效价达１：１２８。抗血清与提纯病毒进行琼脂双扩散反应，出现肉眼可见的特异沉淀带。制备的抗血清可用于检测香蕉种苗及繁殖材料的带毒情况。     

香蕉束顶病毒海南分离物DNA2编码区的克隆及抗血清的制备

利用PCR方法克隆香蕉束顶病毒海南分离物(Banana bunchy top virus,BBTV-HN)DNA2编码区,将其插入到原核表达载体pGEX-6p-1谷胱苷肽-S-转移酶(GST)基因下游.所得克隆pGEX-HN-B2测序结果表明,插入的DNA2片段为267 bp,且表达相位和理论上设计的完全一致.把此重组质粒转化到E.coli Rosetta(DE3)中,经过异丙硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后出现约33 Ku融合蛋白质表达条带.为获得特异的血清,切下目的表达条带并免疫兔子.经Western-blotting检测,获取的血清可以和表达的33 Ku融合蛋白特异结合,表明已成功获得DNA2编码蛋白的血清.     

Purification of potato leaf roll virus and an evaluation of methods for its diagnosis

To evaluate four diagnostic methods for potato leaf roll virus (PLRV), an antiserum was prepared against a virus preparation purified from infectedDatura stramonium L. by an exudation method. The antiserum had a titer of 1:64 in microprecipitin tests. In a procedure developed subsequently PLRV was purified by a method that involved grinding liquid nitrogen frozen stems, petioles, and veins from different solanaceous hosts. A chloroform and n-butanol clarification was done followed by two cycles of differential centrifugation. On sucrose gradients, these preparations formed one band containing spherical particles 25 nm in diameter. In Ouchterlony double-diffusion plates, the antiserum reacted positively with virus preparations from frozenPhysalis, Datura or potato tissue partially purified by two cycles of differential centrifugation. No visible reaction was obtained between the antiserum and the virus preparation from density gradient centrifugation. Antiserum neutralized infectivity of 40–50% of the virions in a partially purified preparation. No virus peak was detected in the scanning patterns obtained after a mixture of antiserum and virus was centrifuged on a sucrose density gradient. A few virus particles were seen attached to serologically specific grids. Methods to diagnose PLRV in infected potato tubers were then compared. In the first, aphids were used to acquire the virus from tuber sprouts. They transmitted the virus to 100% of thePhysalis test plants. Results of the second method, visual inspection of symptoms on potato plants, were similar to those of the first method. Sarkar’s electron microscopic method and immuno-specific grids were less efficient than aphid transmission to diagnose PLRV in tuber sprouts. The low virus concentration in infected tissue made these last two methods unreliable.     

建兰花叶病毒的分离,鉴定及检测研究

从石斛兰病株中获得一个病毒分离物，利用曼陀罗进行分离纯化和繁殖，并通过梯度离心获得提纯病毒，经生物学、血清学鉴定及电镜观察，鉴定该分离物属于建兰叶病毒。分别用纯化病毒及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ回收病毒外壳蛋白免疫家兔。获得２种特异性抗血清，并用ＳＰＡ－ＥＬＩＳＡ方法对兰花样品进行了检测研究。     

辣椒环斑病毒提纯及抗血清制备

为获得高效、灵敏的辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus,ChiRSV）多克隆抗体,通过差速离心、密度梯度离心等方法首次对辣椒环斑病毒进行了分离纯化,并将获得的高纯度病毒粒子用于免疫新西兰大白兔,制备了该病毒的多克隆抗血清。获得的抗血清经间接法酶联免疫吸附测定（ID-ELISA）,效价高达1 ∶ 125 000,且特异性高,与黄灯笼辣椒中另一种亲缘关系很近的同属病毒辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）不发生血清交叉反应、可有效鉴别这2种Potyvirus病毒。获得的抗血清可用于ChiRSV的检测及后续实验,最适工作浓度在1 ∶ 5 000~1 ∶ 25 000之间。     

小西葫芦黄化花叶病毒罗汉果分离株抗血清的制备和应用

将分离自罗汉果(Siraitia grosvenorii)的小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV-LHG)在西葫芦上繁殖,利用差速离心法与PEG沉淀法相结合提纯病毒粒子,用于免疫新西兰大白兔,成功制备出效价为1∶10 240的抗血清。分别用健康西葫芦叶片总蛋白及健康西葫芦叶片汁液吸附处理抗血清,比较2种处理后抗血清背景反应,以健康西葫芦汁液吸附法较佳。用间接ELISA对罗汉果果园及附近共46个科114种植物进行检测,其中9个科25种植物有阳性反应,以葫芦科、苋科、豆科、锦葵科等阳性率较高。田间病毒病发病率调查表明,宿根苗发病率比组培苗高,发病时间更早,是田间罗汉果病毒病的主要初侵染来源之一。     

马铃薯卷叶病毒的鉴定与提纯

自东北农学院育种试验地的马铃薯植株上所分离的14个具有卷叶症状的病毒标样经生物鉴定、蚜传特性、粒体形态和血清反应等鉴定均为PLRV。分离物85-1在曼陀罗上繁殖,经PEG沉淀,两次差速离心和蔗糖梯度离心后的得毒率为0.1mg/kg材料。提纯材料以接种后4～6周的曼陀罗最好。     

52个甘蔗品种在广西受病毒侵染情况

为明确国家糖料体系甘蔗集成示范及区试品种在广西被病毒侵染情况,2017年从广西北海、南宁、崇左、百色、来宾、柳城、桂林等地集成示范及区试的52个甘蔗品种上采集带有甘蔗花叶病、甘蔗黄叶病和甘蔗杆状病毒病显著病症或不显病症叶片样品,采用特异引物通过RT-PCR和PCR方法进行5种病毒检测（甘蔗黄叶病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗杆状病毒）。结果表明,SCYLV的平均检出率为25.00%;SCSMV的平均检出率为7.97%;SrMV的平均检出率为7.69%;SCMV的平均检出率最低,为7.42%;SCBV的平均检出率最高,为68.41%,远远高于其他病毒。7个地方的甘蔗受病毒混合侵染现象普遍存在,北海的病毒混合侵染率甚至高于单一病毒侵染率。52个甘蔗品种在广西受5种病毒的总侵染率为79.67%,对甘蔗的生产安全存在着严重的潜在威胁,建议推广种植甘蔗脱毒种苗来缓解甘蔗病毒病害的危害。     

辽宁省玉米矮花叶病毒原鉴定及cDNA克隆与序列分析

田间采集玉米矮花叶病标样，常规摩擦接种检测，几个分离物寄主范围局限于禾本科植物，可汁液摩擦、蚜虫(棉蚜和桃蚜)传毒、种子带毒(带毒率3%)。病叶汁液体外稳定性测定稀释限点(DEP)为10^-3～10^-4、失毒温度(TIP)为55～60℃、体外存活期(LIV)为1～2d。病毒粒子线状约430～750×13～15nm，病叶超薄切片内可见风轮状、环状内含体。病毒提纯制剂紫外最大吸收为262nm，最小吸收为245nm，A260/A280=1.2，病毒提纯制剂制备抗血清与MDMV-B(对照为北京分离物)和所采集的其它分离物均呈阳性反应。以朝阳、大连两分离物病毒RNA为模板，按文献报道的MDMV-B外壳蛋白(CP)基因序列合成引物反转录PCR，cDNA序列分析表明，和已报道的MDMV-B外壳蛋白基因序列同源率达98.7%，推导的氨基酸序列存在2个氨基酸差异，其同源率为99.4%。通过病原鉴定及病毒外壳蛋白基因克隆与cDNA序列分析，结果认为引起辽宁地区玉米矮花叶病的病原病毒是MDMV，其流行株系为B株系。     

3个甘蔗与斑茅远缘杂交后代BC1的染色体遗传分析

对3个甘蔗与斑茅远缘杂交后代BC1进行真实性鉴定及染色体核型分析,以探讨甘蔗与斑茅BC1的染色体传递方式。利用2对鉴定斑茅真实杂交后代的特异引物对3个甘蔗与斑茅BC1进行鉴定,采用根尖分生区细胞去壁低渗涂片法制片,显微拍照计数染色体数目,并进行染色体核型分析。3个BC1材料均为斑茅的真实杂交后代,崖城01-69体细胞染色体核型公式为2n=121=120 m+1 sm,其染色体按2n+n方式传递;崖城01-116的体细胞染色体核型公式为2n=122=118 m+4 sm,其染色体传递方式为2n+n;崖城01-134的体细胞染色体核型公式为2n=121=120 m+1 sm,其染色体传递为2n+n。推断甘蔗与斑茅BC1的染色体以2n+n的方式传递。