TLR2~(+/+)与TLR2~(-/-)小鼠乳腺灌注乳房链球菌后血浆中抗氧化能力及细胞因子水平的比较

为探讨TLR2在乳房链球菌(Streptococcus uberis)感染小鼠乳腺后对血浆中抗氧化能力及细胞因子产生的影响,本研究以B6小鼠TLR2~(+/+)(野生型)和TLR2~(-/-)(TLR2敲除)B6小鼠为研究对象,在小鼠分娩72 h时,乳腺灌注乳房链球菌(设生理盐水灌注对照),24 h后采集血液并制备血浆。实验结果表明:TLR2~(+/+)小鼠血浆中总抗氧化能力(T-AOC)显著高于TLR2~(-/-)小鼠,乳房灌注乳房链球菌后TLR2~(+/+)及TLR2~(-/-)小鼠血浆中T-AOC水平均显著降低,同对照组相比差异显著(P0.05),且TLR2~(+/+)中也显著高于TLR2~(-/-)型;超氧化物歧化酶(SOD)活力在TLR2~(-/-)小鼠中无变化,而在野生小鼠中显著降低,丙二醛(MDA)含量在两种小鼠中均显著升高,野生型小鼠中含量低于敲除小鼠(P0.05);TLR2~(-/-)小鼠在乳房链球菌感染后血浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌显著增加(P0.05);野生型小鼠在感染后白细胞介素-6(IL-6)分泌显著增加(P0.05)。研究表明,TLR2参与了乳房链球菌诱发乳腺局部炎症后的机体整体水平的抗氧化能力及细胞因子分泌的变化,但不是唯一因素。     

奶牛乳房炎血清学相关指标的变化

为了研究乳房炎对奶牛血清细胞因子及生理生化指标的影响,试验随机选择48头泌乳期奶牛,按体细胞数(SCC)高低分为健康组和乳房炎组,分别采用体细胞计数法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法、全自动生化分析法和比色法测定乳汁SCC和各项血清细胞因子及生理生化指标。结果表明:乳房炎组奶牛血清白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)的表达水平均显著或极显著高于健康组(P0.05或P0.01),乳房炎组与健康组奶牛血清白介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平差异均不显著(P0.05);乳房炎组奶牛血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性、白蛋白(ALB)水平、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活性均显著或极显著高于健康组(P0.05或P0.01),乳房炎组与健康组奶牛血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)活性差异均不显著(P0.05)。说明奶牛血清免疫指标、生化指标与乳房炎的发生具有相关性,特别是IL-1β、IL-8、ALB水平及NAGase活性的显著变化与乳房炎的感染和发生关系密切,故这些指标可作为诊断奶牛乳房炎和乳腺组织损伤程度的血清学敏感指标。     

牛源无乳链球菌分离及其诱导的乳房炎小鼠模型构建

研究旨在分离并鉴定致病性无乳链球菌并构建小鼠乳房炎模型。试验从病牛乳汁中成功分离并鉴定1株无乳链球菌(命名为HZ-032)。HZ-032以10~4CFU菌量感染哺乳期小鼠,同时设相同剂量无乳链球菌ATCC 13813菌悬液组、阴性对照(等体积无菌PBS)组及空白组作为对照,观察攻毒后小鼠乳腺组织病变并进行组织细菌载量的测定;制作乳腺组织石蜡切片,经HE染色镜下观察组织病理变化;采用荧光定量PCR测定乳腺组织中IL-1α、IL-6、IL-10、TNF-α4种炎性因子相对表达量。结果表明,感染组小鼠乳腺组织可分离出大量HZ-032菌株;组织病理切片显示,感染后小鼠乳腺组织较阴性对照和空白组明显观察到乳腺上皮细胞溶解,腺泡内有大量中性粒细胞浸润;荧光定量PCR结果显示ATCC 13813和HZ-032处理组中IL-1α、IL-10、TNF-α表达量均显著升高(P0.05),IL-6在HZ-032处理组显著升高(P0.05)。本研究从患病奶牛乳样中分离1株致病性无乳链球菌HZ-032,并使用该菌成功构建小鼠乳房炎模型,为进一步研究无乳链球菌致乳房炎的相关致病机制及防治措施奠定了基础。     

β-防御素在荷斯坦奶牛正常和炎性乳腺上皮细胞中的差异表达

为探讨荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞在正常和炎性2种情况下β-防御素（BNBD5）的表达量是否存在差异,本研究通过添加内毒素（LPS）建立了实验性乳房炎的乳腺上皮细胞模型,并采用实时荧光定量RT-PCR方法检测了乳腺上皮细胞中BNBD5mRNA表达水平的变化。结果显示,添加LPS后乳腺上皮细胞中炎性因子IL-6、IL-12和TNF-α的mRNA表达量与空白对照组相比显著增加（P〈0.01）,并且α-酪蛋白mRNA表达量显著降低（P〈0.01）,说明添加LPS诱发上皮细胞产生了一定的炎性反应;并且当添加LPS终质量浓度为300μg/L并培养48h之后BNBD5的表达量最高,与空白对照组存在极显著差异（P〈0.01）;推测BNBD5基因可能参与了由LPS诱发的奶牛乳房炎的防御机制。     

EP4受体参与调控大肠杆菌感染后奶牛子宫内膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达、分泌及组织损伤

为了研究EP4受体是否参与调控大肠杆菌感染后的奶牛子宫内膜组织中促炎性细胞因子的表达及组织损伤,试验以体外培养的奶牛子宫内膜组织为研究对象,利用实时荧光定量PCR、ELISA和石蜡切片H.E.染色法检测EP4受体途径对大肠杆菌感染后的奶牛子宫内膜组织中白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达和分泌情况,并观察EP4受体激动剂(CAY10598)对子宫内膜组织损伤情况的影响。结果表明:与空白对照组比,大肠杆菌感染组感染12 h后IL-1β、IL-6、TNF-α的表达和分泌量均极显著升高(P0.01);与大肠杆菌感染组比,大肠杆菌+CAY10598共同作用组共同培养12 h后,IL-1β、IL-6、TNF-α的表达和分泌量均极显著升高(P0.01),奶牛子宫内膜上皮细胞和腺细胞崩解、脱落。说明EP4受体参与大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达和分泌及组织损伤。     

蒙药成分复方对乳房炎模型小鼠治疗作用的研究

旨在探讨蒙药成分复方对乳房炎模型小鼠的治疗作用。利用乳腺内注射大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合菌悬液的方法制备小鼠乳房炎病理模型;模型制备24 h后,阳性对照组、阴性对照组、蒙药成分复方组分别灌胃环丙沙星、生理盐水、蒙药成分复方水溶液,连续给药3 d,每天1次;于注射菌液后24 h(治疗前)和给药后72 h(治疗后),观察各组小鼠的临床症状、组织病理学变化,测定母鼠乳腺组织匀浆中的TNF-α、IL-6含量和乳腺内菌落数。结果表明,蒙药成分复方可以修复由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染所造成的乳腺组织损伤,显著降低乳房炎模型小鼠乳腺组织中的TNF-α、IL-6含量和乳腺菌落数(P0.05)。蒙药成分复方可以治疗由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合感染引起的小鼠乳房炎。     

葎草黄酮对牛乳腺上皮细胞相关基因表达的影响

以奶牛乳腺上皮细胞为细胞模型,用MTT法检测细胞的存活和生长情况,用不同浓度的黄酮溶液(0、100、200、400、600、800mg/L)刺激奶牛乳腺上皮细胞12h,再用相同浓度的黄酮溶液(400mg/L)作用于奶牛乳腺上皮细胞不同时间(1、4、9、12、16、24h),分别提取细胞总RNA,用荧光定量PCR法测定GHR、β-CN、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ泌乳相关基因的表达,研究葎草提取物总黄酮对乳腺上皮泌乳及炎性相关因子表达的影响。结果表明,试验组与空白组相比,奶牛乳腺上皮细胞中IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-8的表达水平降低(P0.05);生长激素受体(GHR)、β-酪蛋白(β-CN)的表达量高于对照组(P0.05)。说明葎草黄酮能上调奶牛乳腺上皮细胞β-CN和GHR的表达量,以浓度为400mg/L培养4h~12h的效果最佳。     

炎症相关miRNAs在LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎性反应中的表达及miR-223真核表达载体的构建

小分子RNA(miRNA)是近年来发现的一类内源性、非编码单链小RNA,其在乳腺组织免疫防御过程中发挥的调控作用逐渐引起了人们的关注。作者拟用qRT-PCR检测炎症相关miRNAs在LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应中的表达变化;构建3种miR-223真核表达载体并检验重组载体的转染效率。用不同浓度LPS处理小鼠乳腺上皮细胞(EpH4-Ev)48h,qRT-PCR检测miR-223、miR-146a、miR-181a和miR-155的表达变化。以EpH4-Ev细胞基因组DNA为模板,PCR扩增pre-miR-223序列,以质粒Minicircle、pcDNA3.1(+)和转座子piggyBac为母本构建3种miR-223真核表达载体,将其转染EpH4-Ev细胞,通过观察荧光、qRT-PCR检测miR-223的表达,评价重组质粒转染效率。结果:qRT-PCR检测结果表明,LPS诱导EpH4-Ev细胞炎症反应时,4种炎症相关miRNAs的表达均显著(P0.05或P0.01)增加,并呈现不同程度的剂量依赖性;重组质粒转染EpH4-Ev细胞后,qRT-PCR检测结果显示,Mini-miR-223质粒转染组的miR-223表达水平无统计学差异(P0.05);PBmiR-223和pcDNA-miR-223转染EpH4-Ev细胞后,miR-223的表达均极显著(P0.001)增加。本研究表明炎症相关miRNAs参与LPS诱导小鼠EpH4-Ev细胞的炎性反应过程。成功构建3种miR-223真核表达载体,为后续miRNAs在乳腺炎症反应中的功能研究奠定基础。     

肺炎克雷伯菌大鼠乳腺炎模型的建立与致病力

为探究肺炎克雷伯菌诱导大鼠乳腺炎的分子机制，试验选用妊娠Wistar大鼠经乳头导管在第4对乳腺中接种肺炎克雷伯菌建立乳腺炎模型，分别在感染后6,12,24 h采集外周血和乳腺组织，用于血常规、乳腺组织细菌载量和病理组织学检查。通过荧光定量PCR检测乳腺组织中炎症相关基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α和模式识别受体TLR4和NOD2的mRNA表达水平。结果显示，肺炎克雷伯菌感染后乳腺组织出现明显的炎性细胞浸润和组织病理学损伤。与对照组相比，肺炎克雷伯菌感染后外周血白细胞数量极显著下降(P<0.01)。与感染12 h时相比，肺炎克雷伯菌在乳腺中的数量在24 h时极显著增加(P<0.01)。与对照组相比，炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α和模式识别受体TLR4和NOD2的mRNA表达水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)。结果表明，成功建立肺炎克雷伯菌大鼠乳腺炎模型，炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α及模式识别受体TLR4和NOD2在肺炎克雷伯菌诱导的大鼠乳腺炎炎症反应中具有重要作用。     

金黄色葡萄球菌诱导的亚临床乳房炎小鼠血清IL-17研究

细胞因子与乳腺免疫紧密相关,IL-17是否是介导乳腺免疫的重要细胞因子对深入研究乳腺免疫机制和乳房炎防控具有重要意义。研究以分娩后7~12d的C57BL/6小鼠为模型动物,将从隐性乳房炎的奶牛乳汁分离的金黄色葡萄球菌(S.aureus)50μL(1×107CFU)或等量的无菌生理盐水通过乳导管缓慢注入小鼠第四、五对乳腺,分别于感染后2h、4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、60h和72h摘眼球采血并分离血清,通过ELISA法测定血清中IL-17A、IL-6、TGF-β的含量。结果显示IL-17在S.aureus感染后8~24h含量升高,其中18h时显著高于对照小鼠,48h和时60hIL-17低于对照小鼠,而IL-6和TGF-β含量无明显变化。研究结果表明,这小鼠存在已分化的记忆性IL-17分泌细胞,S.aureus的感染诱导其快速的分泌了IL-17,也证实IL-17也是乳房炎病理过程中的细胞因子之一。