芒果SEPALLATA3基因的生物信息学与表达分析

SEPALLATA3（SEP3）属于MADS-box基因家族,与植物的成花时间和花器官分化有关。在本研究中,从芒果转录组数据中挖掘获得了2个MiSEP3s基因,分别命名为MiSEP3-1和MiSEP3-2。生物信息学分析显示,MiSEP3-1和MiSEP3-2基因的基因组DNA长度分别为4189 bp和3721 bp,2个基因的开放阅读框长度一致均为732 bp,编码244个氨基酸,蛋白质分子量分别为59.29 kD和59.28 kD。2个MiSEP3s的氨基酸序列中含有典型的MADS结构域和K-box结构域。启动子序列分析显示,2个MiSEP3s基因启动子均包含光响应元件、激素响应元件、逆境响应元件和转录因子结合位点,但调控元件种类和数量存在差异。基因表达模式分析显示,2个MiSEP3s基因在营养期的茎、叶和芽中表达量较低,但在成花转变后期的芽中持续上调表达,在花中达到表达高峰。该结果为MiSEP3基因功能的研究提供参考。     

龙眼DlWRKY52基因克隆及表达分析

WRKY转录因子在植物的生长发育和逆境胁迫响应中起着重要作用。前期研究发现,部分WRKY基因（比如DlWRKY52）参与了龙眼的成花诱导和逆境胁迫响应过程。为进一步研究龙眼WRKY基因的功能,以‘四季蜜’龙眼叶片cDNA为模板克隆得到DlWRKY52基因,并对其序列特征、组织表达模式、花果发育过程表达模式及亚细胞定位进行研究。结果表明：DlWRKY52基因的开放阅读框（open reading frame, ORF）全长为918 bp,编码306个氨基酸,具有典型的WRKY结构域和锌指结构,属于Ⅱc型WRKY蛋白。qRT-PCR结果表明,DlWRKY52基因在叶片、茎和果实器官中高表达;在花后80 d的果肉中显著上调表达;特异在‘四季蜜’成花诱导中下调表达。拟南芥原生质体瞬时表达结果显示,荧光信号主要集中在细胞核。上述结果表明,作为典型的转录因子,DlWRKY52编码的蛋白定位于细胞核。DlWRKY52可能参与了龙眼成花诱导及果实早期发育调控。     

油棕Δ9硬脂酰-ACP脱氢酶EgSAD基因的克隆及表达分析

^Δ9硬脂酰-ACP脱氢酶（^Δ9 stearoyl-ACP dehydrogenase,SAD）是植物中重要的脂肪酸脱氢酶,在调控不饱和脂肪酸合成中发挥着重要作用。本研究以非洲油棕和杂交油棕为材料,在油棕果实油脂积累期,分别测定花后120、140、160 d 3个时期的脂肪酸组分;从油棕中克隆SAD基因,并对其理化性质、进化关系、启动子顺式作用元件进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测SAD在2个油棕品种果实成熟期的表达特征。结果表明：非洲油棕中总不饱和脂肪酸（棕榈酸和硬脂酸）比例（55.76%~60.27%）显著高于杂交油棕（37.2%~45.43%）,杂交油棕中不饱和脂肪酸（油酸和亚油酸）比例（51.61%~56.92%）显著高于非洲油棕（35.54%~38.64%）;鉴定了7个基因命名为：EgSAD1~EgSAD4和OeSAD1~OeSAD3;EgSAD基因编码的肽链平均为413个氨基酸,分子量为43.41~45.92 kDa,等电点为5.99~7.13,蛋白不稳定指数为44.07~53.25,总平均亲水性为-0.496~-0.405。OeSAD基因编码的肽链平均为405个氨基酸,分子量为44.94~49.39 kDa,等电点为6.05~7.14,蛋白不稳定指数为43.44~44.61,总平均亲水性为-0.554~-0.489。多序列比对分析,油棕SAD基因氨基酸序列中存在典型SAD特征的保守组氨酸富集区：EENRHG和DEKRHE。在SAD的启动子上鉴定出植物激素响应、逆境胁迫响应、光响应和逆境响应顺式作用元件。EgSADs在油棕果实成熟过程中呈上调表达趋势,EgSAD1和EgSAD2在杂交油棕中表达量显著高于非洲油棕,OeSADs在杂交油棕果实花后140 d中表达量最高,在杂交油棕的3个时期中均呈现先升高后下降的趋势,且在花后120 d的表达量显著高于花后120 d和160 d。本研究结果为进一步研究SAD调控油棕不饱和脂肪酸合成的机制奠定基础。     

芒果MiFRI1和MiFRI2基因的克隆与表达分析

FRIGIDA（FRI）是植物春化途径中影响成花的关键基因之一。本研究克隆了2个芒果FRI基因,分别命名为MiFRI1和MiFRI2。序列生物信息学分析结果显示,MiFRI1和MiFRI2基因的ORF长度分别为1752、1815 bp,编码584、605个氨基酸,蛋白质分子量为64.98、66.86 kDa。进化树分析结果显示,MiFRI1和MiFRI2分别属于FRIGIDA和FRIGIDA-like两个分支。表达模式分析结果显示,MiFRI1和MiFRI2基因在芒果的叶、茎和芽（花）中均表达。MiFRI1在芒果的营养期和成花转变期之间的各个组织中表达水平均较低,而在花芽分化后期的叶片和芽中表达水平显著升高且达到顶峰。MiFRI2的表达高峰在不同组织中出现的时间不同。2个MiFRIs基因在营养芽转向花芽发育的过程中的顶芽中表达水平均下降,但在花芽分化后期的顶芽中表达水平又再次上升,而在叶片中2个基因的表达高峰均出现在花芽分化后期,但MiFRI1的表达水平高于MiFRI2。说明MiFRIs与芒果的花发育有关,但2个基因发挥功能的程度可能存在差异。     

菠萝COL基因的克隆及响应乙烯的表达特性分析

COL（CONSTANS Like）基因不仅响应光周期调控,还参与植物器官的发育及非生物胁迫的响应。本研究克隆了4个菠萝COL（AcCOL）同源基因,预测其蛋白的结构理化性质和启动子顺式作用元件,并探究AcCOL基因在乙烯利处理后的时空表达模式。结果表明：AcCOL1、AcCOL2基因分别编码387、243个氨基酸,都含有CCT结构域,属于第Ⅳ类COL基因;AcCOL3、AcCOL4基因分别编码394、411个氨基酸,均含有1个B-box和1个CCT结构域,属于第Ⅲ类COL基因。启动子顺式作用元件预测表明4个AcCOL的启动子中均含有光响应元件、昼夜节律表达相关元件。AcCOL1和AcCOL2启动子均含有生长素响应元件和乙烯响应元件;AcCOL3和AcCOL4启动子均含有细胞分裂素响应元件。实时荧光定量PCR分析结果显示,AcCOL基因主要在叶中表达。乙烯利处理后,4个AcCOL同源基因均有不同程度上调。与各自时期的对照相比,AcCOL1和AcCOL4在茎中表达上调较多;AcCOL2和AcCOL3在叶中表达上调较多。另外,AcCOL2基因在3个组织部位中与各自时期的对照相比均有显著上调。研究表明,4个AcCOL同源基因在乙烯利处理后,表达水平均有上调;其中AcCOL2更为显著,在3个组织部位中,与另外3个基因相比表达上调更多。说明AcCOL2基因对外施的乙烯利信号更加敏感,可能在乙烯作用途径中发挥作用。     

芒果中性/碱性转化酶MiNI基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术克隆了1个编码NI基因的cDNA序列,命名为MiNI基因,并对不同来源的中性/碱性转化酶的分子特征及系统进化进行比较分析。结果表明：MiNI基因开放阅读框为2034 bp,编码677个氨基酸,相对分子量为76.6 kDa,理论等电点为6.24;生物信息学分析结果显示,NI二级结构α螺旋占38.85%,无规则卷曲占35.45%,伸展链占18.91%,β折叠占6.79%;MiNI具有glycoside hydrolase family 100结构保守域,与克里曼丁桔、龙眼、巴西橡胶树和番木瓜都具有一致的motif位点;MiNI基因编码的氨基酸序列与克里曼丁桔、龙眼氨基酸序列同源性最高;构建NI系统进化树分析表明,与芒果遗传距离最近的是克里曼丁桔,最远的是玉米和枸杞。qRT-PCR分析显示,果皮MiNI基因表达量远高于果肉;花后10~40 d,果皮MiNI基因表达量显著下降;花后40~100 d,果皮MiNI基因表达量维持在一个相对稳定水平;花后100~130 d,随着果实成熟,果皮MiNI基因表达量又显著上升;而花后10~40 d,果肉MiNI基因表达量显著下降,至果实发育后期果肉MiNI基因表达量始终处于极低水平。该研究为进一步了解MiNI基因在芒果果实蔗糖代谢过程中的作用以及从分子角度阐明芒果糖代谢机理奠定理论和技术基础。     

铁皮石斛DoAGL6基因及启动子克隆与分析

AGL6基因是MADS-box转录因子家族中的一员,是植物特有的转录调控因子,参与花器官形成,对唇瓣的形成起到关键作用。获得铁皮石斛DoAGL6基因及其启动子,并进行生物信息学分析,对DoAGL6基因启动子进行瞬时表达活性验证,可为进一步研究DoAGL6基因的功能提供参考。本研究克隆DoAGL6基因及其上游的启动子序列,利用在线软件对克隆得到的目的基因序列、启动子序列进行预测,分别构建由全长启动子和5'端缺失启动子驱动GUS的重组表达载体并瞬时转化拟南芥及铁皮石斛原球茎,探究其表达活性。结果表明,成功克隆了DoAGL6基因及其启动子,DoAGL6基因编码区长729 bp,编码243个氨基酸,编码蛋白分子式为C₁₂₁₃H₁₉₅₅N₃₅₉O₃₇₅S₁₂,预测亚细胞定位于细胞核中;保守结构域分析表明,DoAGL6具有保守的MADS-box和K-box两个结构域,属于MADS基因家族MIKC亚家族。启动子序列长度为1891 bp,顺式作用元件分析结果显示,DoAGL6基因启动子中除了核心启动元件TATA-box、CAAT-box外,还有许多其他顺式作用元件,如脱落酸响应元件（ABRE）、光反应顺式调节元件（G-Box）、茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif）、MADS-box蛋白结合位点（GArG-Box）等。成功构建融合表达载体pCAMBIA1300-A1-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A2-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A3-promoter::GUS,拟南芥和铁皮石斛原球茎瞬时转化及GUS组织化学染色结果表明,随着启动子5'端缺失片段的增长,GUS活性逐渐降低,启动子活性逐渐减弱,即全长启动子A1（-1891~1）的活性最强,5'端缺失片段A2（-1488~1）次之,A3（-784~1）活性最弱。瞬时转化后的拟南芥和铁皮石斛原球茎GUS染色均呈现蓝色,但与对照相比均较浅,说明全长启动子和2个5'端缺失启动子都具有驱动GUS的活性,但启动活性都比CaMV35S启动子的启动活性弱。     

一个花生早期胚特异性表达基因AhDGAT3启动子的克隆及功能分析

为获得在早期胚中特异性表达启动子,本研究通过基因组步移技术对AhDGAT3（GenBank: AY875644.1）的启动子进行克隆。研究结果表明,获得了AhDGAT3 起始密码子ATG上游 5´侧翼序列2181 bp,应用PLACE和plantCARE在线分析显示,AhDGAT3启动子除了含有核心调控元件TATA-box和CAAT-box之外,还有多个非生物胁迫作用元件,如茉莉酸响应元件、防御和干旱胁迫响应元件TC-rich repeats、光响应元件、干旱诱导的MYB结合位点、光响应MYB结合位点等之外,还包含种子表达相关顺式作用元件及分裂组织表达相关元件。构建重组载体pBI121-PAhDGAT3,转化拟南芥,GUS染色结果显示,该启动子能驱动下游GUS基因,仅在发育早期的心型胚期至鱼雷型胚期较短时间内的胚中特异性表达。     

龙眼HD-Zip基因家族生物信息及表达分析

为了解龙眼HD-Zip基因家族的功能,本研究基于龙眼基因组与转录组数据库,对提取的19个龙眼HD-Zip家族成员的启动子、可变剪接以及受到调控的miRNA种类进行分析;并采用实时荧光定量PCR技术,分析了在ABA处理下龙眼胚性愈伤组织（embryonic callus,EC）中HD-Zip部分成员的表达模式,以及HD-Zip部分成员在不同体胚阶段的表达模式。结果表明：龙眼HD-Zip家族除含有TATA-box和CAAT-box以外还含有大量的光响应元件、激素响应元件以及胁迫响应元件,暗示龙眼HD-Zip家族成员可能参与光反应、激素响应以及非生物胁迫的过程;龙眼HD-Zip在不同组织部位与不同体胚阶段的可变剪接方式主要以内含子保留为主;龙眼HD-Zip基因家族成员主要受到miRNA166a的调控;在外源激素ABA处理下龙眼EC中HD-Zip家族部分成员的表达模式以及部分成员在不同体胚阶段的表达模式都呈现多样化,推测龙眼HD-Zip参与龙眼不同体胚发育的调控,并且可能通过调节内源ABA的浓度进而影响胚性愈伤组织的生长发育以及形态的建成。     

水稻蛋白激酶基因启动子OsSRLp的分离及特性分析

【目的】为研究水稻中I型酪蛋白激酶基因OsSRL启动子的结构及功能,【方法】以水稻中花11基因组DNA为模板,经PCR扩增获得基因上游约1600 bp序列,命名为启动子OsSRLp。应用PLACE在线软件,分析序列中的顺式作用元件,同时构建含有GUS报告基因的植物表达载体,转化水稻。【结果】OsSRL为组成型表达,OsSRLp含有调控生殖发育、激素应答及逆境响应等多种顺式作用元件。OsSRLp驱动的GUS报告基因在根、茎中均有所表达,在小穗中表达丰度较高,而在其他组织中表达丰度较低。【结论】OsSRLp为组成型启动子,其下游调控基因OsSRL可能参与水稻发育及生殖过程。     

芒果乙烯响应转录因子MiERF113基因的克隆及表达分析

芒果（Mangnifera indica L.）是著名的热带水果,深受消费者的喜爱。我国是世界第二大芒果生产国,其中广西为全国最大的芒果产区。芒果是典型的呼吸跃变型水果,其果实在采摘后因乙烯大量释放容易软化腐烂,导致货架期短,影响产业的发展。乙烯响应转录因子（ethylene response factor, ERF）是乙烯信号通路中的关键基因,参与果实内源乙烯合成的信号转导。为了探究ERF在芒果果实采后成熟调控的作用机制,以‘台农1号’芒果为研究对象,依据前期完成的芒果转录组数据结果,筛选并克隆得到1个ERF基因（MiERF113）,利用生物信息学方法分析MiERF113的基本理化特征、保守结构域、蛋白质结构、进化关系等;利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术对MiERF113基因在芒果采后不同贮藏时期的特异性表达进行分析。结果表明：MiERF113基因的开放阅读框（ORF）长度为681 bp,编码227个氨基酸,预测蛋白质分子量为25.61 kDa,理论等电点（pI）为6.07,总平均亲水性为-0.883,有32个磷酸化位点,无跨膜螺旋结构,无信号肽。蛋白质结构域预测MiERF113蛋白仅含有1个保守的AP2结构域,且该结构域中第14和19位氨基酸分别为丙氨酸和天冬氨酸,符合ERF亚家族的典型结构特征。将芒果与拟南芥、猕猴桃、阿月浑子、苹果、柑橘和茶树的ERF氨基酸序列进行进化分析,发现MiERF113与阿月浑子ERF113的同源性较高,亲缘关系最近。利用qPCR检测MiERF113基因在芒果采后不同贮藏时间果皮和果肉部位的表达情况,结果显示,MiERF113基因在果皮和果肉中均有表达,且随着果实不断成熟其表达量在逐渐增加,在采后贮藏12 d时表达量达到最高。本研究为揭示MiERF113基因在芒果采后成熟过程中的调控作用提供理论依据。     

芒果MinMYB10基因的克隆及表达分析载体的构建

MYB（myeloblastosis）转录因子主要参与调控植物类黄酮代谢、植物生长发育等。为了研究在芒果果实中类黄酮代谢调控机制,本研究从金煌果肉中克隆得到一个MYB基因,将其命名为MinMYB10,其全长cDNA序列为1021 bp,开放阅读框为837 bp。该基因编码的蛋白有278个氨基酸残基,分子重量为31.60 ku,等电点为5.89。通过系统发育分析发现MinMYB10与拟南芥是亲缘关系较近的蛋白。本研究还构建了基因沉默载体pTRV2-MinMYB10和过表达载体 pGreenII 62-SK-MinMYB10,以期在后续研究中探明MinMYB10基因在芒果果实花青素代谢中的作用。     

龙眼MSIL全基因组鉴定及表达分析

MSIL（Muliticopy suppressor of IRA homolog1-Like）基因是WD重复蛋白的一个亚家族,在植物生长发育过程中发挥重要的作用。为了解龙眼MSIL（DlMSIL）基因家族的生物学功能,本研究基于基因组和转录组数据,采用生物信息学分析法对DlMSIL基因成员进行鉴定,并进行蛋白质结构及理化性质分析、系统发育进化树构建、启动子顺式作用元件分析、龙眼体胚阶段和不同组织器官表达情况以及GA₃处理下的定量表达分析。结果表明：DlMSIL基因家族含有6个成员属于WD40和CAF1C_H4-bd超家族,可分为3类;DlMSIL蛋白编码393~551 aa,等电点为4.68~7.62,该家族成员均不属于分泌蛋白;基因家族成员的内含子数目在4~14之间;DlMSIL启动子序列包含大量非生物胁迫响应元件及MYB结合位点,推测DlMSIL基因家族可能参与多种非生物胁迫反应;DlMSIL可能参与不同胚胎的发育过程和不同组织器官的形态建成。GA₃处理下的表达分析显示高浓度时,DlMSI1a与DlMSI1c的表达受到了一定的抑制,而DlMSI4a的表达量呈现先下降后上升再下降的趋势,推测DlMSIL可能参与激素响应途径。本研究表明,DlMSIL基因家族成员可能参与胚胎发育、激素信号通路以及非生物胁迫反应等多种生物学功能,体现了龙眼MSIL基因家族功能具有多样性。     

玉米泛素结合酶基因家族分析及低氮胁迫下亚家族UBC2的表达分析

泛素结合酶是泛素/蛋白酶体途径的重要组成部分,在蛋白质的泛素化过程中具有重要作用。本研究利用生物信息学对玉米泛素E2家族成员进行系统进化及基因结构分析。系统进化分析显示,玉米泛素结合酶基因可分为6个亚家族,各亚家族成员数目差异较大。基因数目最多的亚家族是UBC1,为22个。成员数最少的是UBC3,仅为5个。以亚家族UBC2为研究对象,发现UBC2中一共存在4对旁系同源基因,分别是ZmUBC3/ZmUBC70、ZmUBC8/ZmUBC34、ZmUBC31/ZmUBC53以及ZmUBC45/ZmUBC66。对UBC2中成员进行基因结构分析发现,互为旁系同源的基因其基因结构相似。ZmUBC45/ ZmUBC66含有外显子数量最多,为9个,而ZmUBC31/ZmUBC53外显子含量最小,仅为4个。基因基序分析结果显示,ZmUBC3/ZmUBC70含有基序数量最多（8个）,ZmUBC8/ZmUBC34与ZmUBC31/ZmUBC53基序含量最小（均为3个）。基因启动子作用元件分析显示,泛素E2基因启动子元件类型可分为光响应、激素响应和胁迫响应元件、组织表达相关元件以及周期性调控相关元件5大类。基因不同组织表达分析显示,被检测基因在玉米雌花中均有很高的表达量,在根和茎中表达量最低。低氮胁迫结果显示,所有被检测基因在低浓度NO₃ ^-处理下,其基因相对表达量在1 h降至最低,随后逐渐上升。在低浓度NH₄ ⁺处理条件下,各基因表达量逐渐降低,在24 h达到最低值。以上结果表明,泛素结合酶亚家族UBC2基因受低氮胁迫的影响其表达量发生了变化。     

西番莲水通道蛋白PePIP2基因克隆及表达分析

西番莲作为新兴的热带果树，在热带农业中具有非常重要的作用，然而干旱、高温等非生物胁迫严重影响其正常生长发育。相关研究表明水通道蛋白(AQP)能够提高植物的抗逆性，本研究以西番莲‘台农’(Passiflora edulia Sims)为实验材料，利用西番莲的基因组数据，通过同源克隆法从西番莲中克隆得到了一个水通道蛋白基因PePIP2，其开放阅读框(open reading frame,ORF)为861 bp，编码286个氨基酸。对其进行生物信息学分析，其分子式为C₁₄₁₇H₂₁₅₆N₃₆₀O₃₇₃S₈，预测分子量为30 459.37 Da，等电点为8.84，亚细胞定位于细胞膜上。启动子区域分析显示其含有参与胁迫应答的顺式作用元件。对其进行干旱、高盐、低温、高温胁迫下的表达分析，结果表明：PePIP2能够受到干旱、高温和低温胁迫的诱导表达，其中在土壤含水量为50%，在45℃高温处理4 h和0℃低温处理48 h，其表达量最高。在烟草中进行瞬时表达，在不同时间的干旱胁迫处理下，PePI...     

枇杷果实EjNADP-ME2基因及启动子克隆与表达分析

以‘解放钟’和‘白梨’果实为材料,研究基于转录组筛选出的表达量较高且在2个品种中有差异的EjNADP-ME2（Unigene0001461）基因,采用RACE和RT-PCR技术成功克隆EjNADP-ME2的cDNA全长。系统进化树分析表明,EjNADP-ME2与苹果的NADP-ME基因关系最近。生物信息学预测结果显示,EjNADP-ME2蛋白应该位于细胞质中。用染色体步移法成功克隆了EjNADP-ME2的启动子序列,序列预测该基因启动子区域含有水杨酸、茉莉酸、脱落酸响应的顺式作用元件,此外还有厌氧诱导元件、MYB和MYC参与黄化和干旱诱导的结合位点MBS。荧光定量PCR分析表明,EjNADP-ME2基因的表达量变化趋势在2个品种中大致相同,均呈现出先降低后升高又降低的趋势,且该基因在低酸品种的表达量稍低于高酸品种。相关性分析结果显示,低酸品种EjNADP-ME2基因转录水平与苹果酸含量呈显著负相关。本研究的结果为进一步探究EjNADP-ME2基因在苹果酸代谢途径中的功能奠定坚实基础。