TSA诱导橡胶树次生乳管分化过程qRT-PCR内参基因的筛选

橡胶树乳管分化过程中差异表达基因的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是进行基因表达分析的常用技术手段,合适内参基因的选择是准确进行基因表达定量的前提。以组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A, TSA）诱导橡胶树次生乳管分化的实验系统,采用qRT-PCR技术分析TSA处理橡胶树萌条及对照内层树皮中22个候选内参基因的表达情况。结果显示：TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,稳定性最高的3个基因分别为UBC3、UBC4和eIF1Aa,而稳定性最差的3个基因分别为ROC3、PTP、CYP2。以UBC3、Actin和ROC3基因为内参,分析组蛋白去乙酰化酶基因HDA1和HDA2在TSA处理下树皮中表达量相对于对照的变化,结果初步证实TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,UBC3是最佳的内参基因,ROC3不适合作为内参基因。     

铝胁迫下橡胶苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选

铝毒是热带地区酸性土壤上抑制作物生长的主要因素,但目前关于铝活化后对橡胶树生长和产胶的影响及橡胶树耐铝机制的研究很少。为了筛选出橡胶树在铝毒胁迫下稳定表达的内参基因用于实时荧光定量PCR分析,本研究选择了Actin、Actin7、18S rRNA、40S rRNA、YLS8、UBC2、UBC4、GAPDH、FP和ADF等10种常见的基因作为候选内参基因,通过qRT-PCR检测,利用内参基因评价软件geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct算法以及综合评价软件RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评估。综合评价结果表明,铝胁迫后表达稳定性排名前3的内参基因依次分别为UBC4、40S rRNA和FP。进一步选取UBC4、40S rRNA、FP基因和UBC4+40S rRNA+FP基因组合以及稳定性较差的GAPDH基因作为内参基因对橡胶树铝诱导苹果酸分泌转运蛋白基因HbALMT-1和HbALMT-2进行相对表达分析,结果显示2个目的基因相对于3个内参基因及其组合均显示出一致的表达水平,而稳定性较差的内参基因GAPDH未能准确地对目的基因的表达量进行校正。综上所述,筛选出UBC4、40S rRNA和FP基因以及UBC4+40S rRNA+FP基因组合可作为铝毒胁迫不同天数下表达最稳定的内参基因,可用于铝毒胁迫下橡胶树相关基因的表达分析。     

形成层活动对机械伤害诱导巴西橡胶树次生乳管分化的影响

为了进一步优化机械伤害诱导次生乳管分化的实验系统,采用实验形态学的方法,分析了形成层的季节性活动、新梢和顶芽的发育状态以及伤害程度对机械伤害诱导巴西橡胶树萌条次生乳管分化的影响。结果表明,橡胶树萌条的形成层活动具有明显的休眠期和活动高峰期。在形成层活动的高峰期,小面积的机械伤害容易诱导淡绿期和稳定期萌条分化次生乳管,而且稳定期萌条次生乳管分化程度显著大于淡绿期萌条。但在形成层活动的休眠期,小面积的机械伤害不能诱导萌条的次生乳管分化。新梢和顶芽发育状态对机械伤害诱导次生乳管分化程度的影响都与形成层的季节性活动密切相关。大面积的机械伤害抑制次生乳管分化,可能与伤害部位的形成层细胞分裂活性受抑制有关。     

澳洲坚果实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

澳洲坚果是重要的热区经济作物,目前国内外尚无关于澳洲坚果实时荧光定量PCR分析内参基因的报道。选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析准确性的先决条件。为筛选澳洲坚果实时定量PCR最适内参基因,以澳洲坚果的根、茎、叶、果皮、果仁为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对18S rRNA,Actin,CYP,EF1a,EF1b,GAPDH,MDH,TUBa,TUBb,UBQ,UBC等11个常用的内参基因在澳洲坚果不同组织中的表达稳定性进行了分析。geNorm软件分析的最适内参基因数目为2,最稳定内参组合为MDH和EF1b,TUBa基因的稳定性最差。BestKeeper分析结果认为,MDH基因表达最稳定,EF1b次之,与geNorm结果一致。NormFinder软件稳定性分析显示,GAPDH最稳定,其次是CYP基因;TUBa基因表达最不稳定。ΔCt算法结果表明,18S基因表达最稳定,其次是GAPDH基因,MDH和EF1b排第3和第4。RefFinder综合排序为：MDH>18S>GADPH>EF1b>CYP>UBC>EF1a>Actin>TUBb>UBQ> TUBa。因此,MDH基因在澳洲坚果不同组织中表达最稳定,初步确认可以作为实时荧光定量PCR分析的校正内参基因,在澳洲坚果的基因表达模式分析中具有重要意义。     

巴西橡胶树次生乳管分化能力的早期评价方法研究

天然橡胶产量是通过测量割胶收集从次生乳管中流出的胶乳而得到,具有连续收获和累进计产的特点,这也是目前橡胶树的产量构成性状难于剖析和橡胶树产量育种周期长且效率低的主要原因。橡胶树次生乳管分化能力是决定橡胶产量的关键因子之一,通过对幼树的次生乳管分化能力进行早期预测对于缩短橡胶树产量育种周期具有重要意义。本研究采用实验形态学技术,以不同树龄和不同次生乳管分化能力的橡胶树种质为材料,系统地分析机械伤害、割胶和茉莉酸类物质处理对其次生乳管分化能力的影响。研究发现,割胶处理相同种质的二年生幼树与八年生成龄未开割树,得到次生乳管分化能力的效应是一致的,所以使用二年生幼树就可以较好地区分出橡胶树种质间的次生乳管分化能力差异。因此,割胶处理二年生幼树的方法可以作为橡胶树次生乳管分化能力的早期评价的有效方法。这些研究结果不仅丰富了橡胶树产胶潜力的早期预测技术,而且为产胶潜力相关分子标记研发打下良好基础。     

巴西橡胶树次生乳管分化能力早期预测的相关基因初步研究

目前通过常规的试割测产进行橡胶树产量育种的方法,周期长且效率低,亟须改进。橡胶树次生乳管分化能 力是决定橡胶产量的关键因子之一,因此,次生乳管分化能力的早期预测对缩短橡胶树产量育种周期具有重要意义。 本研究采用分子生物学技术,割胶处理不同次生乳管分化能力等级的橡胶树种质的杂交后代,对水囊皮组织中的茉莉 酸生物合成关键酶基因、茉莉酸途径关键环节基因和橡胶生物合成关键酶基因等 20 个基因的表达模式进行分析,并将 基因表达与橡胶树种质次生乳管分化能力等级进行相关性分析。结果发现：茉莉酸生物合成关键酶基因 HbAOCa 和橡 胶生物学合成关键酶基因 HbHevb7 在割胶处理后上调表达,且与橡胶树种质的次生乳管分化能力等级相关性较好。该 方法可用于区分橡胶树种质间次生乳管分化能力的差异。研究结果不仅可以夯实橡胶树种质的乳管分化能力的早期预 测方法,而且可为开发次生乳管分化能力的相关分子标记提供理论基础。     

外源JA的移动对巴西橡胶树萌条次生乳管分化的诱导效应

利用碘-溴染色法结合石蜡切片技术,研究移动的JA(Jasmonic Acid,茉莉酸)对橡胶树萌条次生乳管分化的诱导效应。结果表明:在自然条件下,第一和第二叶蓬均无次生乳管分化,但第一叶蓬经0.07%JA处理,40 d后在施用部位、施用部位上下5 cm、10 cm处及远离施用部位的下一叶蓬均有次生乳管分化,该乳管细胞大小相近,离形成层区的远近相似,可见这些乳管是同期被诱导出来的,外源JA的移动是施用部位之外的茎皮分化次生乳管的原因。同一萌条的不同叶蓬同时施加JA比单叶蓬施加JA更易诱导次生乳管,表明移动的JA诱导乳管分化具有叠加效应和剂量效应。本研究为茉莉酸的信号传导及诱导橡胶树乳管分化机制的深入研究奠定基础。     

巴西橡胶树初生乳管分化与苗生长的关系

利用巴西橡胶树无性系热研７－３３－９７苗圃芽接幼树为材料,采用光学显微镜技术和电子显微镜技术研究了初生乳管分化与茎叶发育的关系。研究结果表明,苗端最初的乳管的分化和原形成束的分化相伴发生,这些乳管出现在原形成束附近,束的近轴一侧。但是当维管形成层形成时,束间形成层在初生乳管的近轴一侧产生,因而随着次生形成层的活动,初生乳管被定位于次生韧皮部远轴一侧。茎和叶中的初生乳管系统和初生维管系统一样连接成一个整体。最初形成的初生乳管是有节连续乳管,随后这些乳管侧壁向各个方向发生侵入生长,互相连接成为一个不规则的立体网状结构。在一个叶蓬生长过程中,茎和叶柄横切面上初生乳管的数目的芽萌动至叶古铜期期间迅速增加,到叶淡绿期增长基本停止。在差不多经历一个生长季的茎部,才产生次生乳管。当次生乳管出现时,初生乳管由于茎的次生加粗而被     

橡胶树‘热研7-33-97’死皮相关研究的qRT-PCR内参基因筛选

在橡胶树死皮以及死皮康复相关研究中,为获得可靠的基因表达结果,筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究以‘热研7-33-97’健康树、三级死皮树和死皮康复树为试验材料,收集其中的胶乳,采用qRT-PCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper三种内参筛选软件,综合分析了20个候选内参基因在不同胶乳样品中的表达情况。结果表明：eif2、ACT7a、UBC2b在健康树中较稳定;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三级死皮树中较稳定;UBC2b、eif2和ROC3在三级死皮恢复树中较稳定。选择胶乳代谢相关基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3对候选的内参基因进行验证,筛选出本研究中适合的一组稳定可靠的内参基因是eif2和UBC2b,其中ejf2是最佳内参基因,18S不适合作为本研究的内参基因。     

橡胶树1981’IRRDB野生种质预割诱导次生乳管分化的比较分析

巴西橡胶树树干树皮中的次生乳管是天然橡胶合成和贮存的主要组织,次生乳管列的多少与胶乳产量密切正相关。割胶是天然橡胶生产中的核心环节,是当前获得天然橡胶的唯一途径,而割胶伤害能诱导次生乳管分化。采用碘-溴染色方法和石蜡切片技术,观察预割前后1981’IRRDB野生种质成龄树的树皮结构,对不同种质预割前后黄皮层和水囊皮区域的乳管列进行统计,并分析新分化的次生乳管列。研究结果表明,选取的85份8年生野生种质在自然条件下的乳管分化能力普遍较弱,黄皮层和水囊皮中成列的次生乳管数量均较少,2个部位合计乳管列数普遍低于8列。预割后不同种质水囊皮中次生乳管列数普遍增多,但黄皮层尚无明显变化。根据伤害诱导分化新的次生乳管列数的多少,将预割诱导乳管分化的能力由低到高分为1、2、3级,分别对应于新分化乳管列数为少于2列、2~3列(含2列)、3~4列（含3列）。在85份种质中,对应1级57份、2级23份、3级5份的种质,所占比例分别为67.06%、27.06%、5.88%,可见,诱导分化次生乳管能力强的种质占比较低,大部分种质为1、2级乳管分化,3级分化能力的种质极少。被诱导新分化次生乳管的能力与种质在自然条件下的分化能力有关,尤其是高乳管分化能力的种质通常在自然条件下也有较强的分化乳管的能力。通过预割判断乳管分化能力不仅为野生种质鉴定和评价奠定基础,也为橡胶树高产育种以及早熟、晚熟品种的早期预测提供有效指标。     

季节、采胶和外源茉莉酸对成龄橡胶树乳管分化的影响

橡胶树树干树皮中的乳管列数目与橡胶产量密切相关。为了建立成龄橡胶树乳管分化的调控技术,笔者采用实验形态学的手段,研究季节、采胶和外源茉莉酸对成龄橡胶树乳管分化的影响。结果表明,在海南岛自然条件下,乳管分化开始于6~7月份,在11月~翌年的5月没有乳管分化;割胶包括正式割胶前的预割能显著提高橡胶树形成层分化乳管的能力,其影响的范围相当大;外施茉莉酸对未开割树和割胶树的乳管分化都有促进作用。这些知识对于发展高效合理的采胶技术可能具有指导意义。     

天然橡胶生物合成相关基因表达与橡胶产量的相关性

胶乳被认为是橡胶树的一种与伤害应答相关联的保护物质。割胶可以显著促进橡胶生物合成,且此促进作用与激活乳管细胞中橡胶生物合成相关基因的表达相关,但相关性大小尚不清楚。本文通过qPCR分析了正常割胶条件下,6个橡胶生物合成相关基因HbHRT2、HbSRPP、HbREF、HbHMGR1、HbHRT1、HbGAPDH在5个橡胶树魏克汉种质和5个1981°IRRDB种质胶乳中的表达情况。结果显示：这6个基因在魏克汉种质中的表达水平显著高于1981°IRRDB种质,分别是后者的1.05~14.62、0.97~4.26、1.46~12.56、0.83~2.99、0.43~7.54、1.92~11.31倍,平均值是后者的7.54、2.55、5.69、1.71、2.71、4.91倍。相关性分析表明,这些基因的表达与橡胶树干胶产量呈正相关,其中,HbREF和HbGAPDH的表达水平与干胶产量之间的相关性最高,有望作为橡胶树产量育种的分子指标。     

橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞的组织化学和分子生物学研究

橡胶树乳管分化研究主要以树皮为研究材料。本研究通过组织化学染色法、尼罗红荧光染色法、免疫组织化学法和分子生物学方法证实橡胶树叶柄来源的愈伤组织中存在乳管细胞。乳管细胞在叶柄愈伤组织中随机分布,分布模式类似橡胶树初生乳管;叶柄愈伤组织乳管细胞在发育早期时橡胶粒子较少,在发育后期时充满橡胶粒子。RT-PCR扩增出叶柄愈伤组织乳管细胞的橡胶延伸因子(REF)、小橡胶粒子蛋白(SRPP)、橡胶凝集素(hevein)和橡胶转移酶(CPT)等胶乳特异基因的转录本,经比对它们序列与所报道的橡胶树树干胶乳中表达的基因序列一致,表明橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞拥有树皮乳管细胞相似的功能,为叶柄愈伤组织作为一种新型的研究乳管分化的模式提供了科学依据。     

蓖麻miR396基因家族及其靶基因GRF生物信息学分析及鉴定

MiR396-GRF在调控植物的生长发育和生物胁迫及非生物胁迫过程中发挥着重要作用,目前关于蓖麻miR396和GRF的研究还很少.本研究中利用BLASTP和Pfam在蓖麻基因组中鉴定到4个miR396和11个GRF成员.分析发现,RcGRFs转录因子蛋白长度在318-619aa之间,理论等电点在5.54-9.34之间,...