哲罗鲑精子冷冻保存

哲罗鲑(Hucho taimen)是分布于额尔齐斯河和黑龙江等水域的冷水性珍稀鱼类,对其精子冷冻保存技术进行研究并建立精子冷冻库,对于哲罗鲑种质保存、人工繁殖发育、苗种培育及种群恢复都具有重要的意义.本研究利用生理盐水、葡萄糖、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)等配制了9种精子稀释液(MPRS,RS,Hanks,ELS,EG1,EG2,Stein,SS-2和D1S),对哲罗鲑精子在稀释液中活力、加入抗冻剂后活力和液氮中冷冻后活力进行检测,发现精子在以上稀释液中均具较高活力(73.00±2.65)％～(96.67±2.08)％,加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)后活力下降,冷冻后仅在ELS和D15中具有极低活力(1.21±0.00)％和(1.1±0.00)％.进而利用ELS对甲醇、二甲基亚砜浓度进行筛选,发现精子在4％～12％甲醇中平衡20 min后活力仍为(79.00±6.52)％～(88.80±7.89)％,冷冻后仅在6％甲醇中具有相对较高活力(18.33± 10.61)％,但与鲜精活力相比显著下降(P＜0.05).精子在4％～12％ DMSO中平衡5 min后精子活力为(43.75± 11.09)％～(81.67±2.89)％,平衡20 min后精子活力极大下降(3.25±0.30)％～(45.00±5.77)％,冷冻后精子活力极低(1.00±0.00)％～(2.75±1.50)％(P＜0.05).以D15为基础液对葡萄糖浓度进行筛选,发现当葡萄糖浓度为30％(D30)时,冷冻后精子活力相对较高(17.80±2.59)％,但与鲜精相比活力显著下降(P＜0.05).另外对精子在D15、D30、Stein和ELs4种稀释液中短期保存的效果进行比较表明,Stein中精子存活在时间最长(45 h),D30次之(15h).综上所述,分别在ELS和D30中加入6％甲醇冷冻保存哲罗鲑精子具有一定活力,本研究结果为哲罗鲑精子大量冷冻保存和精子库建立等方面研究奠定了基础.     

钝吻黄盖鲽精子冷冻保存及生理特性分析

钝吻黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)是鲆鲽鱼类中重要的天然捕捞和养殖对象,但由于生态环境变化、人工捕捞过度等因素,导致其种质资源数量降低,进行精子冷冻保存技术研究,对其种质资源保存具有重要意义.本研究以性成熟的雄性钝吻黄盖鲽为实验材料,对精子稀释液种类及成分、抗冻剂种类、激活精子海水盐度和冷冻精液授精实验等进行筛选,实验数据利用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和Student-Newman-Keuls分析.结果表明,利用MFs-3(8 g/L NaCl+0.65 g/L KCl+15 g/L Glucose)稀释液分别与20％1,2丙二醇(1,2-propylene glycol,PG)和20％乙二醇(ethylene glycol,EG)抗冻剂作为精子抗冻保存液时,冷冻效果最好,其中PG组对应的精子活力、快速运动时间和寿命分别为(95.26±0.39)％、(46.00±1.00)s和(124.33±4.04)s,EG组则为(95.15±0.41)％、(45.67±0.58)s和(124.00±3.00)s.利用盐度为10～50的人工配制的海水激活解冻后的精子,发现当盐度为30时,精子活力高达(95.07±0.69)％,与对照组相比不存在显著性差异.将PG组和EG组冷冻保存的精子解冻后分别与其卵进行授精实验,PG组受精率和孵化率为(80.08±0.68)％和(77.44±1.76)％,EG组则为(80.17±0.45)％和(77.92±1.33)％,与鲜精相比无显著性差异.利用计算机辅助精子分析系统(computer-aided sperm analysis,CASA)测定MFs-3+20％ PG和MFs-3+20％ EG冷冻保存的钝吻黄盖鲽精子的各项运动参数,结果显示,二者的曲线运动速度(curvilinear velocity,VCL)、直线运动速度(straight line velocity,VSL)、平均鞭打频率(beat cross frequency,BCF)、运动的直线性(linearity,LIN)和运动的前向性(straightness,STR)的数值差异性不显著.本研究利用MFs-3+20％ PG和MFs-3+20％ EG成功冷冻了钝吻黄盖鲽的精子,为钝吻黄盖鲽精子冷冻保存技术、人工杂交育种繁殖及种质资源库的建立奠定了基础.     

栉江珧和近江牡蛎的精子超低温冷冻保存

栉江珧(Atrina pectinata)和近江牡蛎(Crassostrea rivularis)是我国重要的海产经济贝类,建立其精子冷冻保存技术及精子冷冻库,对种质资源的保护和遗传育种具有重要意义.本研究对其精子冷冻保存过程中冷冻剂种类和浓度的选择、冷冻程序、平衡时间、保存体积、精液稀释方式、保存时间等多个影响因素进行了比较筛选,并利用显微镜直接检测和曙红Y(eosin Y)染色检测结合的方式检验精子存活率.结果表明,二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)作为抗冻剂的保存效果要明显优于甘油(glycerol,Gly),终浓度为8％～10％的二甲亚砜保存效果最好,其栉江珧和近江牡蛎精子活率均可达60％以上,而甘油保护下精子活率小于40％.精液的稀释方式采用将抗冻液等分为3份,依次与精液混合,每次间隔8 min,整个过程约30 min;此种精液稀释方式与一次性混合方式相比,精子活率可提高约30％.稀释后精液需要在4℃下平衡15～25 min,平衡样品与直接冷冻样品相比,精子活率提高约50％.精液降温程序为在样品投入液氮前,于液氮面以上15 cm处停留5 min,5 cm处停留10 min,精子活率可达60％以上;而未经此降温程序直接投入液氮中的样品精子活率接近0.与此降温程序相对应的样品冷冻体积在1.0～1.4 mL范围内为宜.冷冻180 d内复苏的精子活率由90％左右(鲜精)下降至60％左右,180 d后精子活率下降至56％左右.研究结果为栉江珧和近江牡蛎精子超低温冷冻保存、双壳类种质保护和遗传育种提供了理论和技术依据.     

额尔齐斯河江鳕精子冷冻保存研究

额尔齐斯河中蕴藏着丰富的冷水鱼类种质资源,江鳕(Lota lota)是其中之一,建立其精子冷冻保存技术和精子冷冻库,对种质资源保存具有重要意义。本研究利用无机盐、葡萄糖、蔗糖、胎牛血清等配制7种精子稀释液,以5∶1的比例稀释精液,激活后观察统计精子活力。结果显示,江鳕精子仅在SS、D15和CM中具有(13.33±2.89)%~(8.33±2.88)%活力。在此基础上配制22种梯度稀释液(SS-00~SS-10和D15-0~D15-7),以同样的方法稀释和观察精子活力。结果显示,SS-0(56.67±5.77)%、SS-2(63.33±5.77)%、SS-5(53.33±5.77)%和D15-7(63.33±5.77)%中精子活力较高,与鲜精活力(76.67±5.77)%接近(P0.05)。将二甲基亚砜(DMSO)和甲醇(MeOH)以3∶2比例配制成混合抗冻剂(DM),分别以5%~12%浓度加入到精子稀释液SS-5和D15-7中,以5∶1比例稀释精液,冷冻保存精子。结果显示,冷冻前,5%DM的SS-5和D15-7中精子活力(73.33±5.77)%与鲜精无显著差异(P0.05),当DM浓度升高到10%~12%时,精子活力接近于0;冷冻后,在DM浓度为6%的SS-5中,精子活力较高为(26.67±5.77)%(P0.05);在DM浓度为7%的D15-7中,精子活力较高为(26.67±5.77)%(P0.05)。本研究结果为额尔齐斯河江鳕精子冷冻保存提供了一定的理论和技术依据。     

公兔精液冷冻保存的研究

本研究着重对公兔精液冷冻保存所用的防冻剂的选择及其用量、精液的稀释方法、平衡时间、降温速度及解冻温度等方面进行了一系列试验研究,最后进行输精试验,以验证试验效果。公兔采精用假阴道法,采精后立即检查精液一般性状,精子活率达0.7以上始供试验用。稀释液用 Tris 缓冲液为基础液,其成份为:Tris2.52克,葡萄糖1.05克,柠檬酸1.41克,蒸馏水84毫升,卵黄16毫升。稀释液中的防冻剂以 DMSO 和甘油并用效果较好。当 DMSO 最终浓度从0增至9%时,解冻后精子活率亦随之而提高;当甘油最终浓度为1.25、2.5和3.75%时,解冻后精子活率较好,三者间无明显差异(P>0.05),最终浓度为0和5%时,冻后精子活率则比以上三者有明显的下降(P<0.05)。解冻后精子顶体完好率则随着 DMSO 或甘油浓度的增加而下降。以冻后精子活率和顶体完好率这两个因素综合衡量,DMSO 和甘油的最终浓度分别以4.5%和1.25%效果较好。稀释精液时,采用两次稀释法的冷冻效果比一次稀释法的好。但两者差异不显著(P>0.05)。平衡时间以0.5—1小时效果较好,而2小时和3小时的效果较差。冷冻精液时,在-25—-50℃间的降温速度以每分钟下降3—8℃效果较好,如超过11℃,解冻后精子活率则有下降的趋势。颗粒冻精在40—50℃进行干解冻的效果比30℃和60℃的好。输精时,母兔先静注 HCG50—100单位以诱发排卵,输精量为0.5—0.8毫升。输精母兔230头,情期受胎率73.9%,平均每窝产仔数4.4头。     

褪黑素对秦艽原生质体抗UV-B环境胁迫的作用

为探讨褪黑素对UV-B辐射后的秦艽原生质体的影响,本研究采用单细胞凝胶电泳技术检测秦艽原生质体DNA损伤程度,选取尾部DNA含量(TailDNA％)作为DNA损伤程度的分析指标.MEL以0、1、10 μmol·L-1的终浓度加入原生质体悬液中,UV-B辐射处理的辐照度为0,5 W·m-2.试验分2组:1)原生质体分别用UV-B辐射处理不同的时间(0、5、10、30、60、120 s),暗培养60 min后电泳.2)原生质体被UV-B照射40 s后,分别暗培养不同时间(0、1、2、3、4、6h),再电泳.结果显示在5～30 s的时间内,辐射时间越长,Tail DNA％越高,相同的辐射时间下,MEL浓度越高,TailDNA％越低;在1～6 h培养时间内,MEL处理的样品,TailDNA％值均低于阳性对照组,并且TailDNA％值的大小与所处理的MEL的浓度呈反比关系.由此可见褪黑素降低了UV-B辐射诱导的植物原生质体DNA损伤程度,促进DNA损伤的修复.本试验应用SCGE技术,进一步揭示了MEL在植物抗环境胁迫中所起到的促进作用.     

星斑川鲽精子冷冻保存与生理特性分析

针对星斑川鲽(Platichthys stellatus)养殖群体中雄性个体较雌性小,产精液量低,限制了人工繁殖育苗和杂交育种开展等问题,本研究以性成熟的星斑川鲽为实验材料,对精子稀释液成分、稀释液渗透压、激活海水适宜温度和冷冻精液的适宜稀释比例等进行筛选,并用冷冻精液和鲜精分别与星斑川鲽卵进行受精和孵化实验,实验结果利用SPSS软件中单因素方差分析法和Student-Newman-Keuls进行比较分析。结果表明,利用Ts-2(37.65 g/L蔗糖+10.01 g/L KHCO3+1.21 g/L Tris碱)和SFs-4(60 g/L葡萄糖+10.01 g/L KHCO3+1.21 g/L Tris碱)冷冻保存的精子活力最高,分别为(56.67±5.78)%和(66.67±5.77)%。利用计算机辅助精子分析(computer assisted sperm analysis,CASA)系统对星斑川鲽精子进行分析,测定了用Ts-2和SFs-4保存的冷冻精液中精子运动方式的各项参数。结果显示,测定的各项参数(曲线运动速度(curvilinear velocity,VCL)、直线运动速度(straight line velocity,VSL)、平均鞭打频率(beat cross frequency,BCF)、运动的直线性(linearity,LIN)和运动的前向性(straightness,STR)表明,利用SFs-4保存的精子各项运动参数明显高于Ts-2。利用蔗糖、KHCO3和Tris碱配制不同渗透压稀释液中,在渗透压为319.94 Pa时,精子活力最高,为(61.67±5.00)%,与鲜精相比无显著差异(P0.05)。利用3~18℃海水激活精子,结果显示,当激活海水温度在12℃时精子活力最高,与鲜精相比无显著性差异(P0.05),而其他温度下显著低于鲜精活力(P0.05)。将解冻后的精液稀释10~40倍,与星斑川鲽卵受精,结果显示,在稀释20倍后冷冻精液的受精率最高。本研究利用Ts-2+20%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)和SFs-4+20%DMSO对星斑川鲽精子成功进行冷冻保存,为星斑川鲽精子冷冻保存、种质库的建立和应用提供理论和技术依据。     

奶牛X性控冻精的卵胞质内精子注射研究

探讨奶牛X性控冻精的卵胞质内单精子注射(ICSI)技术的可行性及显微操作条件对奶牛X性控冻精ICSI效果的影响.结果表明,注射运动性控冻精ICSI卵的卵裂率和囊胚发育率均高于不运动组,但差异不显著(P>0.05).分别用5%、8%和10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的精子操作液处理性控冻精,进行ICSI操作,ICSI卵的卵裂率差异不显著;但PVP在5%和10%时,正常卵裂率分别是78.4%和69.1%(P<0.05),囊胚率分别是29.7%和20.4%(P<0.05).精子显微注射时,将卵母细胞的极体调整在相当于时钟6点与12点的位置时,所获ICSI卵的卵裂率差异不显著,但正常卵裂率(76.4%,66.7%)和囊胚率(28.6%,19.0%)明显提高(P<0.05).结论认为,进行奶牛X性控冻精ICSI操作时,应选用运动精子,并用含5%PVP的精子操作液进行处理,而且注射在卵母细胞极体置于6点的位置,有利于ICSI卵体外发育.     

雨生红球藻诱变后生长速率和超微结构的变化

为探讨亚硝基胍(N-methyl-N’-Nitro-N-Nitrosoguanidine,NTG)对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)生长速率及超微结构变化的影响,用不同浓度的NTG处理藻类,对藻类的生长速率、色素含量和超微结构的变化进行了研究.结果表明:即使低浓度(0.5 g·L-1)的NTG对雨生红球藻也是致死的,致死率与NTG浓度呈正相关.藻类经中等浓度(2.5g·L-1) NTG诱变后,存活藻类的增长速率K值和虾青素含量分别达到0.381 ±0.0289和2.9±0.29 mg·L-1.低浓度NTG处理藻类其叶绿素含量略有上升,但高浓度(3.5g·L-1)时叶绿素含量明显减少.低NTG浓度处理时藻类细胞结构变化不大,但高浓度处理时细胞膜、线粒体及叶绿体等均遭受不同程度的损伤.本研究可为深入理解NTG诱变藻类的生理生化机制提供借鉴.     

奶牛X性控冻精应用研究

利用SX-MOFLO精子分离设备分离奶牛XY精子,将分离后的奶牛X精子冷冻保存。探讨奶牛X性控冻精解冻后存活时间、不同方法进行人工授精的受胎率,为奶牛X性控冻精的大规模推广应用提供依据。方法与结果:(1)取不同种公牛、不同批次的X性控冻精及普通冻精解冻后倒入5 mL试管内摇匀,至37°C水浴锅中,每2 h检测一次精子活力,4 h后每小时检测一次精子活力,直至无运动精子。结果奶牛X性控冻精存活时间为5~12 h,比同种普通精子的存活时间短2~10 h。(2)应用奶牛X性控冻精人工授精的母牛的情期受胎率(59.4%=342/576)与普通冻精的情期受胎率(60.6%=129/213)相比,无显著差异(P>0.05)。奶牛X性控冻精母犊出生准确率93.3%(319/342),极显著地高于普通冻精48.8%(63/129)的母犊率(P<0.001)。且应用奶牛X性控冻精人工授精后的青年牛的情期受胎率(6 5.6%=2 4 0/3 6 6)极显著的高于经产牛的情期受胎率(4 8.6%=1 0 2/2 1 0)(P<0.001)。(3)在母牛发情结束后6~8 h左右进行人工授精,其情期受胎率为67.1%(116/173),显著地高于在母牛发情开始后8~1 2 h进行人工授精5 6.1%(2 2 6/4 0 3)的情期受胎率(P<0.0 1)。(4)在准确判断母牛卵巢上卵泡发育状态的前提下,将精液全部输至发育侧子宫角大弯处,其情期受胎率62.7%(289/461),高于母牛每侧子宫角输1/2支X性控冻精46.1%(53/115)的情期受胎率,但二者之间差异不显著(P<0.05)。研究结果表明应用奶牛X性控冻精进行人工授精,其受胎率与奶牛的经产与否、授精时间和输精部位有关。