甘蓝锌指蛋白转录因子BoC2H2的克隆、定位与表达分析

C2H2型锌指蛋白是植物中最重要的转录调节子之一, 主要调控植物的生长发育和胁迫应答反应。本研究通过分析自交不亲和甘蓝未授粉, 自花授粉15、30和60 min, 异花授粉15、30和60 min柱头转录组数据, 筛选到一个自花授粉诱导上调表达的C2H2型锌指蛋白基因, 命名为BoC2H2。BoC2H2开放阅读框756 bp, 编码251个氨基酸残基, 蛋白分子量为26.7 kDa, 等电点为4.62, 是一种亲水性蛋白, 不含信号肽和跨膜域, 含有C2H2型锌指蛋白家族高度保守的ZnF_C2H2结构域。BoC2H2起始密码子上游2000 bp的核苷酸序列中含有光响应、昼夜节律、茉莉酸响应、防御和应激反应等多种顺式作用元件。通过原生质体亚细胞定位和瞬时浸染烟草, 发现BoC2H2蛋白在细胞核和细胞质中表达。BoC2H2在下胚轴、叶片和花中均有表达, 柱头中的表达量随发育时间而变化, 开花当天后表达量降低。荧光定量PCR结果显示, BoC2H2在自花授粉和异花授粉0~60 min的表达量变化趋势与转录组分析结果基本一致。综上所述, 甘蓝BoC2H2属于C2H2型锌指蛋白家族, 可能参与了柱头响应花粉刺激的分子过程, 这有利于揭示BoC2H2在甘蓝自交不亲和过程中的作用机制, 为研究C2H2型转录因子在甘蓝自交不亲和过程中的调控机制提供依据。     

对作物授粉方式概念与内涵的分析

通过对国内外有代表性的生物学、植物学、遗传学、育种学、种子学等相关学科教材及专著对作物授粉方式的论述的比较和研究，发现至今对作物自花授粉和异花授粉的概念与内涵不仅缺乏一个统一的认识，而且还存在明显的矛盾之处。本文分别从单花、单株、品种、基因型、遗传特性和天然异交率的角度，在对自花授粉与异花授粉的不同之处进行剖析的基础上，对自花授粉和异花授粉的概念作出了新定义，并对自花授粉和异花授粉的具体内涵作出了新界定：以同一朵花内传粉为主且天然异交率低于4％的授粉方式为自花授粉（包括同一花朵内花粉传粉、同一植株上的花朵传粉、同一品种内进行传粉或同一基因型内传粉等），以不同花之间传粉为主且天然异交率高于50％的授粉方式为异花授粉（包括不同品种个体间传粉、同一品种不同基因型个体间传粉、自交不亲和性和雄性不育性）。     

黔甘系列甘蓝自交不亲和系优质丰产繁种技术

由于目前国内外甘蓝杂交种绝大多数均是利用自交不亲和系杂交而得,自交不亲和系留种十分困难,主要靠人工蕾期授粉,费工费时、成本高,且自交多代易导致生活力衰退、种子产量低、籽粒不饱满等,向来是制约甘蓝育种和大面积制种的问题。因此要提高甘蓝杂交种制种产量,必先进行甘蓝自交不亲和系繁种技术研究。本课题组历经3年试验摸萦,以自育品种黔甘系列甘蓝自交不亲和系a2-13、g47-4、E4-2等为试材,通过进行不同处理对克服甘蓝自交不亲和性的效果试验、根外追肥对提高甘蓝自交不亲和系结实效果试验、不同授粉方式对甘蓝自交不亲和系种子产量和…     

盐硼溶液克服甘蓝自交不亲和性研究

采用不同浓度的盐硼溶液处理甘蓝自交不亲和系开花当天的柱头,处理后的不同时间自交授粉,同时对盐硼溶液处理后的柱头进行了荧光观察.结果表明:5%NaCl+0.3%的硼酸溶液处理效果最好,处理后的花期亲和指数平均可达4.5以上;处理效果与处理后授粉的时间有密切关系,处理后半小时左右授粉效果最好,处理时间超过1 h自交亲和指数下降;通过荧光显微观察,经5%NaCl+0.3%的硼酸溶液处理的柱头自交授粉后其表面乳突细胞中胼胝质含量呈明显减少趋势,部分乳突细胞受损,花粉大多数能萌发,花粉管生长正常.     

大白菜自交不亲和系选育注意事项

大白菜是异花授粉作物,在大白菜自然群体中,产生自交不亲和性.自交不亲和系的选育实际上就是从杂合的群体中选出具有自交不亲和性较强的纯核自交系.为了确保自交不亲和系在生产上应用时达到95%以上的杂交率,在自交不亲和系的选育时应注意以下问题.     

甘蓝自交不亲和相关基因BoPUB9的克隆及表达分析

自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是指植株的雌蕊对自身花粉和异体花粉进行识别从而抑制自身花粉萌发的特性, PUB (Plant U-Box)蛋白在植物抗逆及信号转导过程中起着重要的作用。本研究通过分析甘蓝自花授粉0～60min的柱头转录组数据,筛选到1个受自花授粉诱导上调表达的PUB蛋白编码基因BoPUB9。BoPUB9 cDNA序列长度为1368 bp, gDNA序列全长1720 bp,含有1个臂重复结构域和1个U-box结构域。荧光定量PCR结果显示, BoPUB9基因在甘蓝的不同组织中均有表达,在萼片中的表达量最高,花瓣、雄蕊、柱头表达量次之,在花粉花蕾中表达量相对较低,同GUS染色结果保持一致。BoPUB9基因在自花授粉0～30 min内快速上调表达, 15 min后为异花授粉后表达量的20多倍,在30min后达到差异最大,自花授粉后的表达量为异花授粉的40多倍。亚细胞定位结果显示,BoPUB9蛋白在细胞核和细胞质中均有表达,且BoPUB9蛋白在大肠杆菌中被成功诱导表达,相对分子质量为51 kD,与预测结果一致。酵母双杂交与poll-down结果显示...     

禾本科植物自交不亲和基因定位进展

植物的自交不亲和性普遍存在于禾本科植物中,这是植物在长期进化过程中形成的防止自交退化,且有利于异花授粉、保持遗传多样性的一种生殖隔离机制。并且植物的自交不亲和机制多种多样,调控其性状的基因数量也不等。目前,许多实验已经证明禾本科植物的自交不亲和性属于S-Z型双因子自交不亲和系统,该类型的自交不亲和系统受到2个不连锁的复等位基因座S和Z的控制。本研究介绍了禾本科植物双因子S-Z型自交不亲和系统的起源,并且归纳了多年来对黑麦、天蓝虉草、球茎大麦和黑麦草等禾本植物自交不亲和调控基因的研究进展。还对禾本科植物S-Z双因子自交不亲和系统提出质疑。最终提出通过克服长雄野生稻的自交不亲和性来构建自交不亲和群体,从而用于精细的图位克隆。     

淫羊藿植物种内杂交和自交亲和性研究

对原产贵州、四川的15个种、38个居群淫羊藿属植物进行种内杂交、自交结实率统计分析研究.结果显示,该属所有的种类自交结实率普遍较低,最低为0％,最高为22.2％,与种内杂交结实率存在着明显的差异.说明大多数淫羊藿种内自交不亲和,是异花授粉植物,有性繁殖方式可能以风媒授粉为主.     

甘蓝型油菜中自交不亲和位点CAPS分子标记的建立和不同S等位基因的鉴定

自交不亲和性是植物的自然机制，它可以防止自交，促进异交。甘蓝（Brassica oleracea）和白菜型油菜（B．campestris）具有这种自我识别的机制，但是它们的双二倍体后代甘蓝型油菜（B．napus）丧失了这种特性而为自交亲和的。自交不亲和性被成功地用作甘蓝杂交育种的授粉控制机制。自交不亲和性可以通过回交引入甘蓝型油菜中，或者通过其祖先——甘蓝和白菜型油菜杂交进行人工合成而引入甘蓝型油菜中。然而，自然条件下，油菜品种也偶尔会发生自交不亲和。Rudloff等从油菜育种材料中筛选到自交不亲和植株。     

自花授粉诱导的甘蓝功能基因BoSPI的克隆与表达分析

自交不亲和性是甘蓝在长期进化过程中形成的防止自交衰败、促进杂交优势的一种复杂而完善的遗传机制。克隆自交不亲和性相关基因对甘蓝自交不亲和性的深入研究和利用有重要意义。本研究通过挖掘0~60 min自花和异花授粉的甘蓝柱头转录组数据, 筛选到一个受自花授粉诱导上调表达的基因, 命名为BoSPI。BoSPI开放阅读框534 bp, 编码177个氨基酸, 理论等电点为4.21, 不包含信号肽和跨膜区, 含有4个保守的EF-hand结构域。BoSPI基因起始密码子上游2000 bp的核苷酸序列中含有真菌诱导响应、代谢调节以及器官形成等应答元件。BoSPI基因在大肠杆菌中可诱导表达为17 kD的蛋白。BoSPI在柱头中表达量最高, 在花瓣、萼片、叶片、雄蕊表达量较低。BoSPI蛋白被定位在细胞膜和细胞质。自花授粉30 min后对BoSPI基因的诱导表达显著增强。表明BoSPI参与了柱头响应自花花粉刺激的分子过程, 可能是实现甘蓝自交不亲和性相关的某种新功能基因。     

甘蓝SCR识别与结合SRK胞外域核心编码区DNA序列的酵母双杂交检测

SCR是芸薹属自交不亲和性的雄性决定因子。为研究SCR与SRK之间相互作用的核心区段,通过构建结球甘蓝的包含系列不同长度的SCR的cDNA序列的pGBKT7融合载体,利用酵母双杂交系统检测SCR与SRK之间的相互作用。结果显示,构建的载体均未出现自激活现象,所获得SCR全长与其相对应SRK胞外域具有相互作用,且相互作用核心编码区位于SCR编码基因的第97~186 bp处。实验结果还显示,此单倍型的SCR信号肽剪切位点及相邻的几个氨基酸残基对相互作用实验结果有干扰作用。以上结论为包括甘蓝在内的芸薹属自交不亲和机制的研究提供了新的实验依据。     

利用酵母双杂交法检测甘蓝SCR与SRK之间的相互作用

为深入研究甘蓝S位点受体激酶(SRK)和S位点富含半胱氨酸蛋白(SCR)间相互识别的分子机理,以具有典型自交不亲和性的甘蓝D3为材料,利用巢式PCR分别扩增SRK胞外域(eSRK)和SCR,通过酵母双杂交检测二者之间的相互作用。并利用同源重组技术将eSRK与GAL4报告基因DNA活化域融合(pGADT7eSRK)以及SCR与GAL4报告基因DNA结合域融合(pGBKT7SCR)。两种重组质粒分别转化酵母Y187和Y2HGold后未出现自激活现象。融合的二倍体酵母(pGADT7eSRK× pGBKT7SCR)能在选择性固体培养基(SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA)上生长,并且菌落呈蓝色。结果表明, eSRK与SCR蛋白能够相互结合, 为深入研究二者作用位点成功建立了一个技术平台。     

甘蓝自交不亲和基因MLPK与SSP的FISH定位

利用FISH技术, 对自交不亲和基因MLPK与SSP在甘蓝有丝分裂前中期染色体、减数分裂早粗线期染色体以及伸长DNA纤维等3种分辨率水平的靶DNA载体上进行物理定位。结果表明, 在有丝分裂前中期, MLPK探针信号位于一对近中着丝粒同源染色体的短臂中部, 距着丝粒的百分距离约为53.41±3.16;SSP探针信号位于一对具有随体的近端着丝粒同源染色体的长臂端部, 距着丝粒的百分距离约为78.36±4.26。综合3种载体上的FISH结果表明, MLPK与SSP在甘蓝染色体组中可能都只有一个同源序列座位, 具有在单倍体基因组中的单拷贝性。重复FISH杂交表明, MLPK与5S rDNA位于同一对染色体。依据Armstrong的核型分析标准, 初步判断MLPK与SSP分别位于甘蓝的2号和7号染色体, 与S位点不存在连锁关系。另从比较基因组学角度对定位结果进行了讨论。     

甘蓝自交不亲和信号转导元件ARC1与EXO70A1的相互作用

从甘蓝型油菜与羽衣甘蓝柱头中克隆出ARC1与EXO70A1基因的编码区, 序列分析显示推导的甘蓝型油菜ARC1比羽衣甘蓝ARC1少编码2个氨基酸, ARC1蛋白在羽衣甘蓝与甘蓝型油菜中存在45个氨基酸的差异, 其序列相似度与一致性分别达到95.9%和93.9%; 推导的EXO70A1在两种植物中仅有6个氨基酸的差异, 其序列相似度与一致性分别达到99.4%和98.9%; EXO70A1蛋白在种内和物种间都保持着高度的保守性, 其保守的程度高于ARC1。应用酵母双杂交系统检测两种蛋白质的相互作用, 发现: 在二倍体酵母细胞中, 全长的ARC1与EXO70A1之间存在较强的相互作用, 能激活4个报告基因(ADE2、HIS3、AUR1-C和MEL1)的表达; 去除C-端(包括臂重复区) 316个氨基酸残基后的ARC1_N与EXO70A1之间表现出较弱的相互作用, 只能激活3个报告基因(ADE2、AUR1-C和MEL1)的表达, 表明ARC1的臂重复区可能并不位于ARC1与EXO70A1的互作界面的核心区段, ARC1的N-端结构域对ARC1-EXO70A1互作起关键作用; 同时发现不同ARC1-EXO70A1组合的互作强度相当, 其可能原因是ARC1和EXO70A1在甘蓝与甘蓝型油菜中存在的这些序列差异并未影响ARC1- EXO70A1互作界面的构象。     

甘蓝多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白BoPGIP基因的克隆及序列分析

PGIP是一种特异性结合和抑制真菌内切PG活性的细胞壁结合蛋白,在植物分子抗病育种中占有十分重要的地位。甘蓝PGIP基因的克隆和序列分析,将为进一步通过转基因技术培育抗病甘蓝新品种奠定基础。本研究通过同源序列克隆法,根据GenBank已登录的青花菜BoPGIP1(Accession: JF325875)基因全长序列设计基因特异性引物,利用PCR扩增技术从甘蓝中克隆基因,利用生物信息学的方法对其编码蛋白的结构和功能进行了预测。将获得的PGIP基因命名为BoPGIP。该基因DNA全长为1065 bp,包含1个内含子和2个外显子。外显子全长975 bp,编码342个氨基酸,分子量为36.2 kD,等电点是6.26。该基因属于PGIP基因家族,具有典型的LRR结构域;功能位点分析显示编码蛋白序列中包括4个N-糖基化位点(65~68,106~109,130~133,254~257),1个蛋白激酶C磷酸化位点(189~191),5个酪蛋白激酶II磷酸化位点(73~76,78~81,151~154,182~185,304~307)和4个N-豆蔻酰化位点(157~162,188~193,236~241,273~278);N末端具有一明显跨膜区域和一个典型信号肽序列;二级结构中包含31.79%helix,13.89sheet和54.32%loop,二级结构以无规则卷曲为主。通过对所克隆的甘蓝BoPGIP基因分析可知,该基因属于PGIP基因家族的新成员,基因的克隆及序列分析为进一步验证甘蓝BoPGIP的功能奠定了基础。     

甘蓝自交不亲和信号传导中SRK底物ARC1蛋白编码序列的克隆与分析

以甘蓝自交不亲和系20010197的植株为材料，提取幼苗中的gDNA及花蕾期的柱头、子房、花瓣、叶片、根的mRNA，并对mRNA进行反转录合成cDNA，然后以gDNA与cDNA为模板扩增ARC1蛋白编码序列。结果表明只在gDNA与花期柱头mRNA的反转录cDNA中扩增出产物，而在其他组织中无任何产物。这可能说明甘蓝ARC1蛋白编码序列是在柱头特异性表     

结球甘蓝类钙调素蛋白基因BoCML39的克隆与表达分析

类钙调素蛋白作为钙调素蛋白的家族之一,调控植物生长发育、激素调控、病原菌防御及各种胁迫。本研究以结球甘蓝为试验材料,通过克隆获得BoCML39基因,其开放阅读框(ORF)为510 bp,编码169个氨基酸,不含内含子。预测BoCML39蛋白分子量为19.25 k D,等电点为4.35,为亲水蛋白,含有4个EF-hand结构域;系统发育树表明结球甘蓝BoCML39蛋白与白菜CML39蛋白处于同一进化枝,与油菜CML39蛋白、甘蓝CML39蛋白的亲缘关系近;三级结构预测发现该蛋白包含9个α-螺旋结构、5个β-转角、2个β-折叠、7个无规则卷曲和4个似小球状的钙离子结构。qPCR表明干旱(PEG6000,150 g/L)、盐(NaCl,200 mmol/L)、低温(4℃)、高温(37℃)、过氧化氢(H2O2,30 mmol/L)、脱落酸(ABA,100μmol/L)、水杨酸(SA,2 mmol/L)、茉莉酸甲酯(MeJA,100μmol/L)不同处理条件均能上调结球甘蓝叶和根中BoCML39的表达。研究结果初步证实BoCML39基因响应逆境胁迫(PEG6000,Na Cl,4℃,37℃)、活性氧(H2O2)和激素(ABA,SA,MeJA)调控,为Bo CML39参与植物逆境、活性氧和激素调控信号途径及其功能研究提供科学依据。     

甘蓝型油菜热激蛋白HSP70基因家族的鉴定和分析

热休克蛋白也称热激蛋白(heat shock protein, HSP),是植物在受到生长环境中不利的生长因子胁迫时产生的一种用于抗逆的防御蛋白,其中在生物体中分布最普遍的一种热激蛋白是热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70)。为全面、深入地了解芸薹属HSP70基因家族的信息,本研究对芸薹属的3个物种(白菜,甘蓝和甘蓝型油菜)进行了生物信息学分析,首先在BRAD数据库中对芸薹属的3个物种进行HSP70基因数目的鉴定,分别在白菜和甘蓝中鉴定出了2个HSP70,在甘蓝型油菜中鉴定出了4个HSP70。将鉴定出来的这8个HSP70基因进行生物信息学分析(系统发生关系,基因结构,保守基序,染色体定位和同源性等),结果显示,芸薹属HSP70基因结构相似,在核酸和蛋白水平均具有高度保守性,进化过程中基本种之间以及天然杂交种与基本种之间均保持着极高的同源性,进化树以及其他生物信息学分析结果还表明甘蓝型油菜的HSP70位点与白菜、甘蓝的HSP70位点符合"禹氏三角"理论,但是根据3个物种的HSP70基因数量及对应关系等分析结果可推测白菜、甘蓝、甘蓝型油菜3个物种的HSP70位点与三倍化理论不完全一致,此结果可反映芸薹属的这3个物种在进化过程中其HSP70基因在数量或结构上发生过变化,致使其不满足三倍化学说。     

甘蓝自交不亲和信号传导元件ARC1的体外表达及其与SRK相互作用验证

在甘蓝自交不亲和信号传导中ARC1和上游因子SRK之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用,以甘蓝E1为材料,采用RT-PCR技术扩增ARC1的编码序列, 构建ARC1原核表达质粒pET43.1a-ARC1,转化宿主菌大肠杆菌BL21,通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。利用免疫共沉淀原理及pET43.1a-ARC1融合蛋白序列中的6×His标签与Ni⁺结合的特点建立了体外检测蛋白质相互作用的新方法, 并用该方法对ARC1与SRK的相互作用进行了检测。结果表明,在体外ARC1能与SRK相互作用并形成复合体,这为深入分析ARC1与SRK相互作用机理以及探讨ARC1与下游传导元件的相互作用提供了理论和技术基础。