侵染凤仙花的菜豆金色花叶病毒的鉴定及基因组结构分析

在对云南省西双版纳州进行病毒病害调查时发现1株疑似菜豆金色花叶病毒属病毒侵染的凤仙花植株，其症状表现为叶片皱缩和花叶。利用菜豆金色花叶病毒属病毒简并引物进行PCR扩增、克隆和分析，获得YN6198-28和YN6198-31两条菜豆金色花叶病毒属病毒的DNA-A全长序列，长度均为2 763 bp，编码6个开放阅读框，其中YN6198-28核苷酸序列与越南丁香黄脉病毒（Ludwigia yellow vein Vietnam virus,LuYVVNV）相似性为94.90%，表明该分离物是LuYVVNV1个分离物。重组分析发现，YN6198-28是种间重组病毒，其主要亲本为丁香黄脉病毒（Ludwigia yellow vein virus,LuYVV），次要亲本为中国胜红蓟黄脉病毒（Ageratum yellow vein China virus,AYVCNV）。     

PaLCuCNV和TYLCCNV复合侵染引起更严重的番茄黄化曲叶病

 从四川攀枝花市田间采集36份表现严重矮化、黄化和曲叶症状的番茄病株样本,利用双生病毒简并引物PA/PB从所有样本中均扩增得到约500 bp的片段,经全序列测定及分析,检测出中国番木瓜曲叶病毒（Papaya leaf curl China virus,PaLCuCNV）和中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）,这两种双生病毒的复合侵染率达97.2%。系统进化分析表明,这两种双生病毒分别与已报道的PaLCuCNV河南番茄分离物（PaLCuCNV-[HeNZMI]）及TYLCCNV云南元谋烟草分离物（TYLCCNV-[Y295]）的核苷酸序列相似性最高,分别为99.1%和97.9%。检测发现,所有分离物均伴随有卫星DNA β分子,全序列测定表明所得9个DNA β分子均为TYLCCNV的卫星TYLCCNB,且与其四川番茄分离物（TYLCCNB-[SC65]）的核苷酸序列相似性最高,为87.7% ~ 94.5%。本文首次报道PaLCuCNV与TYLCCNV/TYLCCNB病害复合体复合侵染番茄引起更严重的番茄黄化曲叶病。     

侵染番茄的苎麻花叶病毒分子特征及其基因序列分析

为明确侵染贵州番茄的菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)病毒种类及其变异分化情况,将采自贵州省关岭县的番茄病毒病样品提取DNA,用Begomovirus通用引物BegoAFor1/BegoARev1进行PCR检测,并用J4F/J4R引物扩增并克隆该分离物的DNA-A全长序列,用RaMV-B-F/RaMV-B-...     

北京番茄黄化曲叶病毒病的发生及分子检测

<正>番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curlvirus,TYLCV)为菜豆金色花叶病毒属(Begomoviruses)的一种双生病毒,由媒介昆虫烟粉虱传播(Zhang Huietal.,2009)。该病毒可以侵染茄科、豆科等多种植物,主要为害番茄、辣椒、茄子、甘蓝和黄瓜等蔬菜     

重庆南瓜病毒病病原ELISA 检测及CMV 变异分析

 利用7 种植物病毒的抗体,对采自重庆7 个区县的67 份南瓜病毒病样品进行了抗原直接包被酶联免疫吸附分析（ACP-ELISA）检测。检测结果表明,在这67 份样品中,至少59 份感染了所要检测病毒,其中,感染黄瓜花叶病毒 (Cucumber mosaic virus, CMV)、烟草花叶病毒 (Tobacco mosaic virus,TMV)、番茄花叶病毒 (Tomato mosaic virus, ToMV)、芜菁花叶病毒 (Turnip mosaic virus, TuMV)、蚕豆萎蔫病毒2 号 (Broad bean wilt virus 2, BBWV-2)、马铃薯Y 病毒 (Potato virus Y, PVY)和马铃薯X 病毒(Potato virus X, PVX) 的样品分别为80.60%、77.61%、74.63%、82.09%、76.12%、83.58%和55.22%。在检测呈阳性的59 份样品中有93.22%的样品受到2 种以上病毒的复合侵染,而受7 种病毒复合侵染的样品高达60.00%,表明在南瓜上病毒复合侵染现象相当严重。进一步对54 份受CMV 侵染的南瓜样品检测发现,CMV 亚组Ⅰ (CMVⅠ) 病毒侵染的样品有49 份,占90.74%,CMV 亚组Ⅱ (CMVⅡ) 病毒侵染的样品为11 份,占20.37%;其中6 份（11.11%）样品检测到CMVⅠ和CMVⅡ的复合侵染。以免疫捕获反转录PCR (IC-RT-PCR) 扩增了一个CMVⅠ分离物 (CMV-CQ) 近全长CP 基因并进行序列分析,结果证实其属于CMV 亚组Ⅰ型,其核苷酸序列与国内CMVⅠ型赤豆分离物 (CMV-RB) 的同源性最高,为98.1%。     

广东辣椒上首次检测到西瓜银斑驳病毒

2014 年在广东辣椒产区发现疑似番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒侵染引起的辣椒褪绿坏死环斑症状。Dot-ELISA 检测显示,该病毒分离物与番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）单克隆抗体不产生血清学反应,表明该病毒不属于TSWV。利用Tospovirus 属病毒通用引物gL3637/gL4435C进行RT-PCR 检测,可以从所有辣椒病样总RNA 中扩增出预期大小约800 bp 的目的片段。基因克隆与序列分析表明,该片段序列与西瓜银斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus,WSMoV）中国广州分离物的同源性最高,为97.5%。系统进化分析也显示,该病毒分离物与WSMoV 各分离物亲缘关系最近,并聚类在一个分支。因此,侵染广东辣椒的病毒分离物为WSMoV。     

烟草花叶病毒山西番茄分离物的全基因组序列测定及分析

为明确山西省晋中市侵染番茄的病毒种类,采用双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)技术和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)方法对感病番茄进行分子鉴定。序列测定及分析发现,具有花叶、卷曲症状的番茄为烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)所侵染。进一步克隆TMV番茄分离物(TMV-SXFQ)的全基因组序列,得到TMV-SXFQ(Gen Bank登录号为JX993906)全长为6 394 bp,含4个开放阅读框(open reading frame,ORF)。序列比对分析表明,TMV-SXFQ与烟草花叶病毒属其他分离物的同源性为86.3%~99.6%;系统进化分析表明,TMV-SXFQ与韩国分离物IM聚为一簇、亲缘关系最近。     

番茄褐色皱纹果病毒分子检测与鉴定

利用3对番茄褐色皱纹果病毒（Tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）特异性引物对云南红河、宁夏银川、北京顺义疑似病毒病样本进行RT-PCR检测，分别扩增出大小为812、842、1 053 bp的特异性条带。对扩增产物进行测序及系统进化分析，发现云南、宁夏、北京的ToBRFV分离物与约旦、意大利、荷兰的ToBRFV分离物聚在同一分支上，亲缘关系较近。致病性结果显示，接种后的番茄植株表现出与田间相同的症状，且在发病组织中检测到病毒ToBRFV。表明来自云南红河、宁夏银川、北京顺义的番茄植株均被ToBRFV侵染。     

四川省攀西地区南瓜、甜菜和辣椒部分病毒种类的ELISA检测

利用马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）和马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）的多克隆抗体,以及烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV-2）及芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）的单克隆抗体,采用抗原直接包被ELISA法对四川省攀枝花、西昌和德昌地区的南瓜、甜菜和辣椒上采集的病毒病样品进行了检测。结果表明,在87份样品中PVY的侵染最普遍,总检出率达74.71 %|CMV、TMV、TuMV、BBWV-2和PVX的总检出率分别为12.64 %、13.79 %、22.99 %、10.34 %和14.94 %。在87份样品中,仅发现TuMV、PVX及PVY的单独侵染|其余25份样品均检测到2种以上病毒的复合侵染,总检出率为34.72 %。表明攀西地区蔬菜上病毒复合侵染现象普遍,PVY是该地区蔬菜上的优势毒原。     

云南澳洲坚果苗木感染番茄斑萎病毒属病毒初报

 在云南省临沧市永德县海拔约800 m 的澳洲坚果（Macadamia sp.）种苗繁育基地发现叶片 褪绿、黄化、叶脉间呈现近似圆形或不规则褐色枯斑的植株。为了确认植株病因,采集典型病株,应用 电子显微镜负染色法、超薄切片和DAS-ELISA 进行检测,在澳洲坚果苗木病叶分离物Maca-LC 的粗汁 液和病叶超薄切片中均观察到有类似番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒粒体。该病毒粒子为球形,直径 80 ~ 85 nm。进一步应用DAS-ELISA 方法鉴定,病叶与Tospovirus 的西瓜银色斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus,WSMoV）/花生芽坏死病毒（Groundnut bud necrosis virus,GBNV）复合抗血清呈阳性反应。 通过病症典型症状、病毒形态学观察及血清学方法检测表明,侵染云南澳洲坚果种苗的病毒分离物 Maca-LC 为番茄斑萎病毒属Tospovirus 病毒。     

Papaya yellow leaf curl virus: A newly identified begomovirus infecting Carica papaya L. from the Indian Subcontinent

India is one of the world’s largest producers of papaya. Viruses, mainly begomoviruses and potyviruses, cause a significant loss in papaya production. The study described here has identified a new species of begomovirus and a new species of betasatellite infecting Carica papaya in India. The sequences of the begomovirus and betasatellite show 90.03% nucleotide sequence identity to an isolate of Radish leaf curl virus and 92.25% identity to an isolate of Tomato leaf curl betasatellite, respectively. Maximum likelihood phylogenetic tree of begomovirus sequence of isolate DP2 (KX353622) showed distant relationships with previously characterised begomoviruses. Recombination analysis proposed six recombination breakpoints in begomovirus genome with other geographical begomovirus isolates.     

我国6个省份番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染率及序列系统发育分析

于2017～2019年在我国6个省份的番茄主产区，采集疑似番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）和（或）番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）侵染的番茄样本，利用特异性引物进行RT-PCR 或PCR 扩增，将符合预期条带大小的PCR 产物测序后进行系统发育分析。结果表明，我国6 个省份番茄ToCV 和TYLCV 的复合侵染率为25.29%，其中山东省两种病毒复合侵染率最高，为46.43%。序列分析结果表明，测定的ToCV CP 基因序列与已报道的对应序列同源性在98.30% 以上，ToCV CP 基因序列没有发生明显的遗传分化；TYLCV 基因组部分序列与已报道的对应序列同源性在96.00% 以上，没有发生明显的遗传分化。     

江苏省番茄黄化曲叶病毒和褪绿病毒复合侵染的分子检测

2014年对江苏地区的番茄黄化曲叶病进行调查时发现,采自南京温室大棚的17份表现矮化,上部叶片上卷、变小、叶缘黄化,下部叶片脉间褪绿、上卷、变厚症状的番茄病株样本中除了感染烟粉虱传双生病毒外,还有一种长线形病毒,序列分析结果显示烟粉虱传双生病毒为番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV),长线形病毒为番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)。同时还对发病棚室中采集的烟粉虱进行了两种病毒的检测,结果两种病毒在烟粉虱体内都有检测到。     

重组酶聚合酶扩增技术在番茄黄化曲叶病毒检测中的应用

番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是引起番茄黄化曲叶病毒病的病原，在生产中造成严重危 害，开发快速准确的检测方法对该病害的防控具有重要意义。依据番茄黄化曲叶病毒DNA-A 基因序列，设计用于重组酶聚 合酶等温扩增（RPA）检测的特异性引物，建立了TYLCV 的重组酶聚合酶等温扩增检测方法，并分析该方法的特异性和灵 敏度。结果表明，建立的TYLCV-RPA 方法可从TYLCV 阳性的番茄样品中扩增出343 bp 的特异性条带，反应条件为37 ℃ 恒温下40 min，扩增时间短，对设备要求低，且与番茄其他病毒无交叉反应，特异性好，灵敏度可达到PCR 方法的10 倍， 适用于TYLCV 的快速检测。     

番茄黄化曲叶病及抗病育种研究概况

番茄黄化曲叶病是热带、亚热带地区最具毁灭性的番茄病毒病之一。随着保护地的发展,温室烟粉虱在北方保护地越冬、传播、危害,现已成为影响我国乃至全世界番茄生产的主要限制因素之一。从番茄黄化曲叶病毒病为害情况、病毒研究概况、抗病品种选育进展等方面进行了综合阐述。     

番茄试管苗抗TYLCV 鉴定技术研究

 为了开发番茄对番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）抗病性鉴定的新技术,设计了在番茄试管苗中接种TYLCV的试验。将对TYLCV感病的品种‘Moneymaker’、‘中蔬6号’、‘丽春’和抗病品系‘AVRDC CLN 2123 A’在试管中进行组织培养,21 ~ 25 d后切取长2.0 ~ 2.5 cm的嫩枝,将嫩枝基部在含TYLCV-[CN：SH2]侵染性克隆质粒的农杆菌EHA 105菌株的悬浮液（OD₆₀₀ 0.5）中浸润1 min接种。14 d后,感病品种试管苗开始出现TYLCV症状并且愈来愈重,28 d后TYLCV症状十分典型,56d后症状极其严重：叶片窄小、黄化、极度卷曲,植株严重矮化,停止生长或死亡;而同样接种的抗病品系试管苗却无一发病。接种的番茄试管苗经PCR检测显示,从感病品种试管苗中均能扩增到356 bp的特异片段,而在抗病品系中无此条带。这些结果显示了在试管里鉴定番茄品种或材料对TYLCV抗性的可能性。     

河南部分地区番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒复合侵染的分子鉴定

为调查河南省部分地区番茄病毒病危害情况,于2019年10月采集16份表现黄化、曲叶症状的番茄植株,利用分子生物学技术对其进行鉴定。结果表明:供试样品均被TYLCV(Tomato yellow leaf curl virus)侵染,31.75%的样品被TYLCV和ToCV(Tomato chlorosis virus)复合侵染;DNA全序列比对分析发现,供试样品中分离的TYLCV河南菌株与TYLCV-Is等地区的核苷酸序列同源性均达到94%以上,其中TYLCV-HN-AY-1分离物与TYLCV-Almeria(NC004005.1)序列相似性最高,为99.5%;对供试样品TYLCV抗病基因分子检测发现,部分番茄样品含有Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a,表明部分TYLCV株系已突破Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a的抗性。该结果对指导河南省番茄的安全生产具有重要意义。     

云南番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定

在云南省元谋县发现大量下部叶片褪绿黄化,顶叶卷曲畸形的番茄植株。将叶片采集带回实验室,采用番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）和番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）的特异性引物分别扩增得到774和400 bp的目标条带,测序比对发现其与ToCV的KR184676.1和TYLCV的FJ012359.1序列相似度均为99%,确认这两条带对应的两种病毒分别为ToCV和TYLCV,明确该番茄植株被ToCV和TYLCV复合侵染。同时发现云南地区有B型和Q型两种烟粉虱存在,且Q型的比例高于B型,二者均可携带ToCV和TYLCV。ToCV首次在云南省发现,其由沿海向内陆蔓延的过程中与TYLCV的复合侵染已蔓延至西南地区,值得高度重视和警惕。     

番茄黄化曲叶病毒的系统发育分析及多重PCR快速检测

通过对国内已报道的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的DNA-A全基因组进行序列比对分析,发现TYLCV各中国分离物具有较高的相似性。TYLCV全序列及CP序列核苷酸和氨基酸系统发育分析结果显示,我国中东部及东南沿海地区为番茄黄化曲叶以色列病毒（TYLCV-IL）各分离物所侵染,而西部和西南部内陆地区为番茄黄化曲叶中国病毒（TYLCCNV）各分离物所侵染。基因多态性分析结果表明,TYLCV在进化上具有较强的保守性,但核苷酸突变位点（Pi）在染色体上的分布却具有较高的多态性,因此针对TYLCV的严格保守区设计出3对特异性引物,建立了以多重PCR技术为基础的快速、高效、特异性检测TYLCV的方法。