强筋小麦分子标记多重PCR体系的构建与应用

面筋强度与小麦高低分子量谷蛋白亚基种类(组合)密切相关。以12个已知亚基基因组成的品种为对照,选用基因(位点)Axnull、Bx7^OE、Dx5、Glu-A3d、Glu-B3i和Glu-B3的标记,构建多重PCR体系。以该体系检测对照的结果与已知基因型完全一致,一次PCR可同时间接检测7个与强筋有关基因(位点)Ax1/Ax2^*、Bx7^OE、Dx5、Glu-A3d、Glu-B3i和Glu-B3。对62个陕西小麦品种的检测结果表明,优质强筋亚基基因(位点)Ax1/Ax2^*、Dx5、Glu-A3d、Glu-B3i和Glu-B3的比例依次为56.5%、9.6%、33.9%、1.6%和64.4%,所有品种均不含Bx7^OE,携带0、1、2和3个及以上基因(位点)的品种分别占6.5%、33.9%、48.3%和11.3%。说明聚合多个强筋亚基基因(位点)的品种频率较低,通过优质亚基基因的聚合育种,可望改善陕西小麦品种的面筋品质。本研究所构建的强筋小麦分子标记检测的多重PCR体系检测结果稳定且可靠,可用于小麦种质资源的快速评价和强筋小麦分子辅助选育。     

小麦高分子量麦谷蛋白亚基多重PCR扩增体系的建立

小麦的加工品质与小麦高低分子量麦谷蛋白的组成和含量密切相关,特别是Glu-1位点编码的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)的组成和含量.其中与好的加工品质相关的优质亚基如1Dx5、1Ax2*和1Bx7OB(over-expression)特异的分子标记已经被建立并应用于品质改良的分子育种.本研究的目的在于通过摸索PCR反应组分和循环参数对多重PCR反应结果的影响,建立一次反应能够同时鉴定1Ax2*、1Bx7OE和1Dx5亚基的多重PCR反应体系.结果表明:反应体系中的三种亚基的引物浓度比例和反应的Tm值是多重PCR成败的关键因素,当引物浓度比例为1Dx5:1Bx7CEL:1Ax2*=0.1:0.2:0.3或1Dx5:1Bx7OE:1Ax2*=0.1:0.2:0.4,Tm=60℃时1Ax2*、1Bx7OE和1Dx5亚基的多重PCR结果最好.利用HMW-GS的多重PCR的方法可以快速高效的鉴定多个亚基,可以进行小麦品质育种的复合分子标记辅助选择.     

小麦品质性状分子标记多重PCR体系的建立

小麦高分子量谷蛋白亚基组成、1B/1R易位、籽粒硬度、直链淀粉含量和穗发芽抗性等性状与加工品质密切相关，建立相关性状的多重PCR体系在小麦品质分子育种中具有重要意义。本研究利用现有品质性状基因的分子标记，建立了适合不同品质类型品种评价和分子聚合育种的3个多重PCR体系，并用已知基因的品种（系）进行验证。多重PCR体系Ⅰ包括ω-secalin（1B/1R）、Vp1B3和Pinb-D1b基因的分子标记检测，可用于一般的品质检测；体系Ⅱ包括ω-secalin、Ax2*、Bx17和Dx5 基因的检测，可望用于强筋小麦品种的选育；体系Ⅲ包括Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1位点的检测，可用于淀粉品质或糯小麦的选育。每个体系内的引物之间不存在相互抑制作用和错配，检测品种（系）的结果可靠、重复性好，成本低。3个多重PCR体系用于小麦品质育种的亲本评价和杂交后代优质基因的聚合，将会提高优质专用小麦品种评价和选育的效率。     

新疆小麦品种高分子量谷蛋白亚基及相关品质基因的分子标记检测

高分子量麦谷蛋白亚基、1B·1R易位系、多酚氧化酶(PPO)活性及黄色素含量等基因对小麦加工品质有重要影响,准确、快速鉴定这些基因对品质改良有重要意义.本研究对新疆当地及国内外引进的321份小麦品种进行SDS-PAGE分析,利用特异性分子标记对高分子量谷蛋白亚基中的Dx5、Bx7、By8、By9亚基、1B·1R易位系、PPO和黄色素含量基因进行鉴定.进一步验证分子标记检测的可靠性和准确性,为优质小麦分子标记辅助育种提供材料和方法.SDS-PAGE分析表明,供试材料有21种亚基类型,其中Glu-A1位点有3种类型,以null为主;Glu-B1位点有10种类型,Bx7+By8和Bx7+By9亚基占主导地位;Glu-DJ位点有8种类型,Dx2+Dy12和Dx5+Dy10占主导地位.分子标记检测表明,Dx5亚基的频率为38.3%,Bx7亚基的频率为85.7%,By8亚基的频率为38.9%,Bx9亚基的频率为42.7%;特异性PCR标记扩增与SDS-PAGE鉴定结果的吻合率分别为97.2%、98.4%、93.4%和97.2%.在新疆当地品种、其他国内品种和国外品种中,1B·1R易位系材料的频率分别为22.0%、31.5%和25.0%,Psy-A1b的频率分别为9.0%、10.8%和5.4%,Ppo-A1b的频率分别为38.0%、43.8%和45.7%,Ppo-Dla的频率分别为48.0%、66.9%和40.2%.同时含Ppo-A1b和Ppo-D1a的材料有74份,占23.0%.本试验中采用的基因特异性标记重复性好、准确率高,可有效用于小麦品质分子标记辅助选择.     

311份小麦品种(系)优质麦谷蛋白亚基组成分析

为明确小麦品种(系)中优质麦谷蛋白亚基组成,筛选优质小麦品种资源,本研究以116份贵州省小麦品种(系)、195份省外小麦品种为供试材料,采用STS分子标记方法,对优质高分子量麦谷蛋白亚基Ax2^*、Bx7^oe、By8和低分子量麦谷蛋白亚基Glu-A3d、Glu-B3g进行分子检测,并利用近红外谷物品质分析仪测定311份材料的蛋白质含量,探讨了其与各个优质亚基间的相关性。结果表明:311份供试材料中,亚基Bx7oe、By8和Glu-B3g的分布频率分别为90%、78.14%和39.87%,优质亚基Ax2*和Glu-A3d分布较少,频率均为2.89%,不同优质麦谷蛋白亚基及组合对小麦蛋白质含量存在显著性影响,亚基Ax2^*和亚基组合7oe+8/A3d/B3g对蛋白质含量的贡献最大。本研究结果为改良小麦面筋质量、准确筛选优质种质资源提供依据。     

小麦育种亲本材料Dx5、Bx14亚基及1BL/1RS易位的分子检测

为给小麦优质育种的亲本选配等研究提供参考,利用优质谷蛋白Dx5、Bx14亚基及1BL/1RS易位的特异性分子标记,对本课题组近年常用的38份杂交亲本材料进行了分子检测.结果表明,在引进品种和自育品种(系)中,含Dx5亚基的材料分别占16.0％和7.7％,含Bx14亚基的材料分别占16.0％和23.1％,1BL/1RS易位材料分别占24.0％和38.5％.与引进品种相比,自育品种(系)含Dx5亚基的材料很少,而含Bx14亚基和1BL/1RS易位的材料较多.总体来看,育种亲本含Dx5、Bx14亚基的材料较少,而含1BL/1RS易位的材料相对较多.因此,今后小麦优质育种中应重视含Dx5、Bx14亚基材料的引进和利用,合理使用1BL/1RS易位材料,并加强杂种后代的分子鉴定与选择.     

1Dx5亚基特异PCR标记在小麦品质性状群体改良中的应用

利用1Dx5亚基特异PCR标记对改良品质性状的Ta1小麦轮回选择群体C₄进行了分子检测，并通过SDS-PAGE电泳对其结果的验证，以探讨群体5亚基基因型的组成及其特异PCR标记用于轮回选择的可行性。结果表明：（1）1Dx5亚基特异PCR标记在具有1Dx5亚基的单株中均扩增出450 bp的基因片段，生化标记检测也证明所有能扩增出450 bp片段的单株均含有5亚基的条带，分子标记与生化标记结果一致，而且PCR扩增结果的重复性好。说明1Dx5亚基特异PCR标记的选择准确率高，完全可用于Ta1小麦群体改良中1Dx5亚基基因型的检测；（2）构建的轮回选择群体C₄中携带1Dx5亚基的优质基因型比例高，达56.81％，且大都伴随与之连锁的10亚基出现。生化检测表明群体中同时产生5＋12稀有亚基和14＋15与5＋10的聚合体。     

小麦高分子量谷蛋白亚基功能的体外鉴定

通过SDS-PAGE方法回收纯化小麦高分子量谷蛋白亚基1Ax1、1Dx5、1Dy10、1Bx7、1By8和1By9,然后利用微量配粉方法将单个亚基分别添加到对照“京411”面粉中,经过揉混仪分析单个亚基对揉面特性的影响,进而确定各个亚基的功能特性。根据揉面时间、稳定时间等参数的变化,6个小麦高分子量谷蛋白亚基对面粉品质的影响表现为1Dy10 > 1Ax1 > 1Dx5 > 1By8 > 1Bx7 > 1By9。研究结果表明,通过揉混仪进行体外配粉检测是快速鉴定高分子量谷蛋白亚基功能的一种有效方法。     

高分子量麦谷蛋白亚基HPCE高效分离及图谱鉴定

高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)是决定小麦加工品质的重要因素。高效毛细管电泳技术(HPCE)以其用样少、速度快、精确度高等特点被越来越多地应用到分离鉴定中来。目前小麦HMW-GS的HPCE研究尚处于起步阶段, 对标准鉴定图谱的研究甚少,且已有分离体系在连续多次试验中的分离速度及分辨率仍有提升空间。本研究通过SDS-PAGE结合分子标记的方法鉴定了不同小麦品种的HMW-GS, 以“中国春”小麦为标样确立了HPCE高效分离体系, 体系条件为75 mmol L^-1 IDA+0.05% HPMC+15% ACN, pH 2.5, 电泳参数为毛细管内径25 μm, PDA检测波长200 nm, 分离电压20 kV, 运行温度30°C。通过混合进样方式对不同类型亚基进行HPCE分析, 建立了18个亚基的标准图谱, 亚基迁移顺序为1Dy12→ 1Dy10→ 1By9→ 1By8→ 1By18→ 1By16→ 1By20→ 1Bx17→ 1Bx20→ 1Bx13→ 1Bx6→ 1Bx7→ 1Ax2*→ 1Ax1→ 1Dx5→ 1Dx4→ 1Dx3→ 1Dx2,标准出峰时间依次为9.39、9.69、10.30、11.70、11.89、12.09、12.22、12.36、12.62、12.83、13.08、13.18、13.50、13.73、14.04、14.24、14.46和14.73 min, RSD<0.2%。以1Bx17为分界线, 9.39 min到12.36 min为y型亚基区域, 12.36 min到14.76 min为x型亚基区域。结合亚基迁移顺序、标准出峰时间及图谱特点可对小麦相关HMW-GS进行HPCE快速鉴定。本研究获得的分离体系及鉴定图谱可用于小麦HMW-GS定性分析和种质资源筛选。     

Glu-B1位点亚基色谱鉴定及7OE对面团强度的影响

准准确鉴定高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）及探讨其对面团特性的影响是小麦品质研究的重要内容。用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和反相高效液相色谱（RP-HPLC）对62份品种（系）的HMW-GS组成进行鉴定。结果表明，结合SDS-PAGE和RP-HPLC两种方法可以对Glu-B1位点，尤其是Glu-B1（7+8）进行有效鉴定。选用13份姊妹系为材料，使用RP-HPLC和凝胶色谱（SE-HPLC）方法，研究了Glu-B1al（7^OE+8*）以及贮藏蛋白组分含量对面团强度的影响。结果表明，Glu-B1al（7^OE+8*）可显著提高HWM-GS总量和面团强度，7OE可作为优质亚基用于强筋小麦育种。相关性分析表明，谷蛋白总量、HWM-GS、LMW-GS以及x-HMW含量与最大抗阻力呈1%显著正相关，相关系数分别为0.76、0.76、0.77和0.72。SDS-不溶性谷蛋白大聚体（UPP）占谷蛋白聚合体总量的百分比与揉面仪峰值时间、粉质仪形成时间和稳定时间以及最大抗阻呈1%或0.1%显著正相关，相关系数分别为0.77、0.90、0.89和0.87。醇溶蛋白与谷蛋白含量的比值与揉面仪峰值时间呈1%显著负相关，相关系数为－0.69；与粉质仪稳定时间和最大抗阻呈5%显著负相关，相关系数分别为－0.58和－0.64。HPLC可有效分离和量化HWM-GS，并作为小麦品质育种有效的辅助手段。     

中国和CIMMYT小麦品种Bx7亚基超量表达基因(Bx7OE)的分子检测

高分子量谷蛋白亚基Bx7的超量表达对提高小麦面筋强度有重要作用。利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和STS标记检测了163份中国和CIMMYT小麦品种(系)的高分子谷蛋白亚基Bx7超量表达基因(Bx7^OE)。结果表明,TaBAC1215C06-F517/R964标记和TaBAC1215C06-F24671/R25515标记可分别在含有Bx7^OE基因的材料中扩增出447 bp和844 bp的特异带,在不含Bx7^OE基因的材料中无相应目标带,两个STS标记的检测结果完全一致。在163份小麦品种(系)中,11份品种(系)含有Bx7^OE基因,占总数的6.7%。RP-HPLC与STS标记检测结果一致。利用这两个STS标记可以方便、快速、准确地检测Bx7^OE基因。     

Allelic variation and genetic diversity of high molecular weight glutenin subunit in Chinese endemic wheats (Triticum aestivum L.)

The high molecular weight glutenin subunit (HMW-GS) compositions of 66 Chinese endemic wheats were determined by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Ten alleles at the Glu-1 loci were detected in 50 Tibetan weedrace wheat accessions which in combination resulted in seven different HMW-GS patterns. Four HMW-GS patterns were observed among 10 Yunnan hulled wheat accessions, and two patterns in six Xingjiang rice wheat accessions. Two novel alleles (Bx7** + By8, Bx7 + By8**) and two rare alleles (Dx2 + 1Dy12*, Dx2 + null) were found in Tibetan weedrace accessions, with one of the latter (Dx2 + Dy12*) also being found in Yunnan hulled wheat. The mean indices of genetic variation at the Glu-1 loci in Yunnan hulled wheat, Tibetan weedrace wheat and Xingjiang rice wheat were 0.2232, 0.1655 and 0.0926, respectively, showing that Yunnan hulled wheat and Tibetan weedrace wheat had higher genetic variation than Xingjiang rice wheat.     

以EMS诱变创制软质小麦宁麦9号高分子量谷蛋白亚基突变体

本研究旨在创制遗传背景一致的不同高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)缺失系, 为小麦品质研究和育种提供材料。将软质小麦品种宁麦9号, 用0.4% EMS溶液处理10 000粒种子, 获得3781个M1代单株, 采用“半粒法”对每个株系进行SDS-PAGE鉴定, 从中筛选出299个(7.91%) HMW-GS突变株, 包括HMW-GS缺失和分子量突变两种类型。其中, HMW-GS缺失突变176株, 突变频率为4.65%, 缺失亚基涉及Ax1、Bx7、By8、Dx2和Dy12, 突变频率为0.24%~3.28%; 分子量突变130株, 突变频率为3.44%。将突变体的具胚端种子于温室中繁殖获得M2代, 再次鉴定各株系的HMW-GS, 并经M3代验证, 最终获得Ax1、Dx2、Bx7、By8和Dy12缺失突变体, 及Ax1+By8双缺失突变体。用高效液相色谱(HPLC)分析这些突变体的谷蛋白大聚体(GMP)和谷蛋白/醇溶蛋白(GLU/GLI)比值, 发现不同缺失突变体的GMP含量都有不同程度的降低, 尤以Bx7亚基缺失突变体中GMP含量降幅最大, 高达42%。另外, 不同缺失突变体的谷蛋白总量和GLU/GLI比值也低于对照, Ax1+By8双缺失突变体的GLU/GLI比值最小。     

Multiplex-PCR typing of high molecular weight glutenin alleles in wheat

In Australian commercial cultivars, each high molecular weight glutenin (Glu-1) homoeologous locus consists of one of two predominant alleles: Glu-A1a (subunit Ax1) or Glu-A1b (subunit Ax2*) at the GluA1 locus, Glu-B1b (Bx7 and By8 subunits) or Glu-B1i (Bx17 and By18 subunits) at the Glu-B1 locus, and Glu-D1d (Dx5 and Dy10 subunits) or Glu-D1a (Dx2 and Dy12 subunits) at the Glu-D1 locus. PCR-based assays have been developed in this study to discriminate between these common alleles at each locus. Primers specific for the Glu-A1 Ax2* gene give a single fragment of 1319 bp only in the presence of this gene. Primers targeting the Glu-B1 locus resulted in a co-dominant marker for which the Bx7 genotype produced two fragments (630 bp and 766 bp) and the Bx17 genotype a single fragment (669 bp). The third pair of primers was specific for the Dx5 gene and resulted in a single band of 478 bp. A multiplexed PCR assay was established which permitted the discrimination of the major HMW glutenins in a single PCR reaction and agarose gel assay. As the HMW glutenin composition of a wheat line is extremely important in determining the functional properties of wheat gluten, these markers are useful for the purposes of marker-assisted breeding. These markers may also be useful for the purpose of DNA-based identification of wheat varieties. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

小麦Glu-B1位点1Bx14+1By18新亚基对材料的创制及其对加工质量的影响分析

以小偃54为轮回亲本,以引进品种Prinqual为1Bx17+1By18的供体,培育高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）近等基因系,以期客观评价1Bx14、1By15、1Bx17和1By18等亚基（对）对小麦加工品质的贡献。近等基因系回交至BC₄代时发现一个1Bx17亚基不表达的重组体,该重组体经自交分离纯合后获得了携带新亚基对1Bx14+1By18且可稳定遗传的品系012912。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）、小麦SDS微量沉降值和面粉揉面仪等方法。对小偃54和012912的谷蛋白及醇溶蛋白组成、总蛋白质含量、沉降值和揉面特性等指标进行了比较,结果表明,012912（1Ax1, 1Bx14+1By18, 1Dx2+1Dy12）与其轮回亲本小偃54（1Ax1, 1Bx14+1By15, 1Dx2+1Dy12）在谷蛋白成分上的唯一差别是以1By18替换了小偃54的1By15亚基,且1By18基因的表达量比小偃54的1By15表达量提高29%;012912品系的沉降值比小偃54高2.5 mL,揉面特性比小偃54好,说明1By18基因比1By15对面团加工品质的正向效应大。