利用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase,L-ASP）可以通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成,导致肿瘤细胞的死亡。通过杆状病毒的Bac-to-Bac方法,将大肠杆菌的asp基因在家蚕杆状病毒中表达,其活性较原核表达有明显提高,达到2800μ/mg。为利用家蚕生物反应器生产该蛋白提供了依据。     

利用家蚕杆状病毒da26基因融合表达L-天冬酰胺酶成熟肽

L-天冬酰胺酶是一种有效的抗肿瘤药物,通过利用杆状病毒表达系统表达L-天冬酰胺酶的成熟肽序列asp(s)与da26的融合蛋白,利用家蚕生物反应器大量生产该蛋白,为L-天冬酰胺酶在临床上的广泛应用打下基础。     

家蚕flightin基因的克隆

Flightin蛋白对于粗肌丝的组装和性能有着重要的作用。为调查家蚕的粗肌丝结构，通过PCR和RACE技术，我们在家蚕中获得了家蚕flightin基因的全长cDNA序列，并通过对家蚕wgs数据库的检索，获得了蚕flightin基因的结构，家蚕flightin执基因由4个外显子和3个内含子组成。家蚕flightin基因的cDNA全长为661bp，编码158个氨基酸残基。家蚕flightin蛋白与黑腹果蝇flightin蛋白的氨基酸同源性为29．67％，但存在保守区域。     

家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶基因的克隆及表达和亚细胞定位

半胱氨酸脱硫酶是一类活性依赖于磷酸吡哆醛的酶类,可催化L-半胱氨酸转化为L-丙氨酸和硫烷硫原子,为铁硫簇组装提供硫原子。基于家蚕微孢子虫基因组数据,克隆了家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶(NbNfs)基因。序列结构分析显示NbNfs含有其活性所需的保守氨基酸位点,但不具有线粒体型N端导肽;系统发育分析表明微孢子虫半胱氨酸脱硫酶与真菌线粒体型半胱氨酸脱硫酶聚为一类,属于类群Ⅰ,起源于α-变形细菌;共线性分析表明半胱氨酸脱硫酶基因在不同微孢子虫之间其基因座位保守,具有共线性。构建重组质粒pET30a(+)-NbNfs,并转化到E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达NbNfs融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化后,将融合蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,Western blotting检测NbNfs在成熟家蚕微孢子虫具有表达。胶体金免疫定位显示NbNfs主要定位于成熟家蚕微孢子虫的细胞质中。研究结果为家蚕微孢子虫铁硫簇组装途径的研究奠定了基础。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人瘦素蛋白

瘦素(leptin)蛋白由肥胖基因编码,对人体能量代谢等多种生理过程起着重要的调节作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人瘦素蛋白基因(lep)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,并转化E.coli DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-lep,然后转染家蚕BmN细胞,获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blotting方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞检测到大小约22 kD的蛋白条带,与预期的人瘦素蛋白分子质量相符。给家蚕5龄起蚕注射重组病毒液后的4～5 d出现发病症状,RT-PCR检测发病家蚕的血液中有lep基因转录,并通过SDS-PAGE和Western blotting检测到大小为22 kD的人瘦素蛋白的表达。研究结果表明,利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因的重组杆状病毒,并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达。     

杆状病毒GP64表面展示元件与L-天冬酰胺酶Ⅱ融合表达的初步试验

GP64是Ⅰ型杆状病毒的主要囊膜糖蛋白,利用基因重组技术在gp64中插入外源蛋白基因,二者在病毒表面融合表达活性肽或蛋白质,可以免去纯化表达产物的繁琐。L-天冬酰胺酶Ⅱ(ASP)是一种临床上广泛使用的蛋白类抗肿瘤药物,利用家蚕杆状病毒(BmNPV)GP64展示系统表面展示ASP,探讨以表面展示有ASP蛋白的出芽型病毒粒子(BV)生产抗肿瘤药物的可行性。构建重组转移载体pFast Bacdual-gp64sp-asp-gp64ctd,并转化E.coli DH10BacTM,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒DNA,将重组杆粒DNA通过脂质体转染至Bm N细胞,获得了重组病毒。重组病毒大量感染Bm N细胞后72 h,收集感染病毒的细胞培养液超速离心纯化BV。采用奈氏试剂法检测接种重组病毒的Bm N细胞内表达融合ASP的酶活力为1 788.4U/mg;Western blot检测纯化后的BV中含融合ASP蛋白,然而BV中的ASP检测不出酶活性。试验结果提示,构建的杆状病毒GP64展示系统可以将ASP转到BV上,但产物的活性保持有待进一步研究。     

利用酵母双杂交系统筛选BmNPV PE38的互作蛋白

利用酵母双杂交技术,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的PE38蛋白为诱饵,从感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白编码基因,为探讨BmNPV PE38在侵染家蚕过程中的作用提供线索。将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-Pe38转化到酵母菌Y2HGold中,并将含有感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库的Y187酵母细胞与含有pGBKT7-Pe38的酵母细胞共同培养,初筛出8个有匹配结果的候选蛋白基因,经功能搜索后筛选到2个与病毒复制有关的蛋白基因,通过测序和生物信息学分析,这2个基因编码的蛋白质可能是与BmNPV的PE38蛋白有相互作用的候选蛋白,分别为家蚕丝氨酸蛋白酶和过氧化氢酶。     

家蚕表皮蛋白基因的生物信息学分析

家蚕的表皮蛋白(cuticular protein)是家蚕重要的结构蛋白,与几丁质一同作为家蚕表皮的重要组成部分。运用生物信息学的方法对家蚕表皮蛋白进行了广泛分析。通过保守的基序检索家蚕基因组,得到163条候选的表皮蛋白序列,包括RR、Tweedle、CPF&CPFL等家族,并且发现具有确定的保守基序的表皮蛋白基因在染色体上都是以串联集群形式分布。氨基酸组成分析表明,这些表皮蛋白富含甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、组氨酸等。运用Sig-nalP server预测这部分蛋白质有85%都具有信号肽。进化分析显示,负选择是家蚕表皮蛋白基因进化的主要驱动力。采用TFSEARCH等在线服务软件分析发现,在70%含有RR基序的家蚕表皮蛋白基因的核心启动子区具有通用的TATAAA序列。     

重要外文学术期刊发表蚕学论文简介

<正>1 ZHOU Q Z,FU P,LI S S,ZHANG C J,YU Q Y,QIU C Z,ZHANG H B,ZHANG Z.A comparison of co-expression networks in silk gland reveals the causes of silk yield increase during silkworm domestication. Front Genet,2020,11:225.DOI:10.3389/fgene.2020.00225题目家蚕与野蚕丝腺共表达网络的比较分析揭示了家蚕驯化过程中丝产量增加的原因摘要长期驯化和选择性育种使家蚕的产丝量是其野生祖先野桑蚕产丝量的几倍。然而,人们对驯化过程中蚕丝产量增加的分子机制知之甚少。根据家蚕和野蚕丝腺功能分化的动态模式,重庆大学ZHOU等发现在丝腺发育的早期和中期,家蚕中的表达上调基因主要涉及与细胞分裂和生长相关的DNA整合、核酸结合和转运蛋白活性,这导致家蚕的后部丝腺(PSG)细胞(丝蛋白合成"工厂")显著多于野蚕。在丝腺发育的后期,家蚕中的表达上调基因在蛋白质加工和核糖体途径富集,表明在家蚕驯化过程中蛋白质合成效率得到了提高。虽然家蚕丝腺中的丝素蛋白合成增加,但丝胶蛋白的产量也同时减少。这反映了家蚕和野蚕处于不同的选择压力下。重要的是,发现家蚕丝蛋白基因共表达的网络比野蚕的大。此外,在家蚕中与丝蛋白基因共表达的基因比在野蚕中更多地受到人工选择。研究结果表明,在家蚕驯化过程中,蚕丝产量的增加与生物系统的改善有关,该系统不仅包括蛋白质合成"工厂"(PSG细胞)的扩大,还包括丝蛋白基因和丝生产相关基因(如生物能量、运输和核糖体途径基因)的高表达。     

利用转基因家蚕在蚕丝中表达重组人表皮生长因子

人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)具有刺激细胞增殖的强大能力,是伤口愈合的关键因子.利用转基因技术,在家蚕后部丝腺利用丝素轻链基因(fibroin light chain,FibL)启动子驱动FibL-hEGF融合蛋白的表达.借助piggyBac转座子将FibL-hEGF融合基因导入到家蚕基因组,利用荧光检测总共获得8个转基因阳性卵圈,转基因阳性率为36.36％.PCR和反向PCR检测证明外源融合基因FibL-hEGF已被成功整合到家蚕基因组中,且随机插入到家蚕染色体的5个位点.Western blotting检测表明FibL-hEGF融合蛋白在家蚕后部丝腺中表达且成功分泌到蚕茧中,进一步证实了转基因家蚕的产生.本研究中利用piggyBac转座子介导的转基因技术成功获得了转基因家蚕并得到重组hEGF蚕丝,该蚕丝可用于制造伤口敷料.     

简述家蚕丝蛋白相关基因分子结构的新进展

家蚕起源于中国,5000年来家蚕通过吐丝结茧为我国的经济发展和人民生活作出巨大贡献.通过定向选择、人工培育等手段,目前家蚕的吐丝量已经达到相当高的水平,然而,人们仍然致力于家蚕吐丝量的继续提高而努力.目前蚕业研究者把希望转移到生物技术上,希望利用现代基因工程、分子生物学技术方法,对编码蚕丝蛋白的基因及其调控序列进行改造,达到提高吐丝量的目的.     

西南大学家蚕基因重组研究取得新进展蚕宝宝首次吐出了人工合成蚕丝蛋白

<正>西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室马三垣等研究人员,在教育部长江学者特聘教授、实验室主任夏庆友教授的带领下,通过基因组编辑,对丝蛋白进行了基因重组,让家蚕吐出了人工合成丝蛋白。该研究成果于2014年10月发表在国际期刊《Scientific Reports》上。蚕体约含16425个基因,其中一个基因叫做Fib-H基因,它是丝蛋白的最主要成分,是几千年以来人类驯化和利用家蚕的主要靶标。利用锌指核酸酶技术,研究者在家蚕的生殖细胞中"剪切"掉了其     

家蚕G蛋白γ亚基BmGγ30A的克隆及其原核表达

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子,参与生物体广泛的信号转导。为了研究G蛋白在家蚕中的生理功能及其作用机理,运用生物信息学方法预测到家蚕Gγ的一段序列,通过设计特异性引物、PCR和RACE技术,克隆得到家蚕Gγ30A的序列。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段通过酶切克隆至表达载体pET-41b(+),并导入E.coli BI21宿主菌中进行诱导表达。家蚕Gγ30A重组GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子量约38 KDa处,出现特异性蛋白条带,表达方式分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达;试验结果说明我们已成功克隆到家蚕Gγ30A基因(GeneBank登录号:HQ699664),并在E.coli BL21中高效表达。     

家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库的构建和免疫相关基因的淘选

中肠是昆虫重要的免疫防御器官之一。为探究家蚕中肠的分子免疫机制,尤其是针对不同病原体的模式识别分子或结合蛋白,以家蚕5龄第3天幼虫中肠为材料,构建家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库,并分别以几丁质和脂多糖为配体,通过不同方法进行文库的生物淘选。结果共获得10个基因片段,其中在以脂多糖为配体的淘选中获得了β-1,3葡聚糖识别蛋白4,该分子是已知的模式识别受体。另外还获得了多个免疫相关候选基因,如分别编码几丁质结合蛋白、翻译控制的肿瘤蛋白、氨肽酶N、脂肪酰辅酶A结合蛋白等的几个基因。研究结果为深入开展家蚕中肠免疫功能的研究提供了重要线索。     

家蚕葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族基因BmGMCβ2的克隆及序列与表达分析

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases,GMC)家族是昆虫体内一大类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的氧化还原酶类,家蚕基因组中含有43个GMC家族基因。以家蚕5龄幼虫cDNA为模板克隆到一个家蚕GMC家族基因,命名为BmGMCβ2(GenBank登录号:JQ965926)。该基因cDNA全长1 875 bp,编码624个氨基酸,预测蛋白质分子质量为69.3 kD,pI为6.21,定位于家蚕16号染色体的nscaf3058上,编码蛋白质含GMC家族共有的ADP-bindingβ-α-β折叠结构域。系统发育分析表明该基因是家蚕GMC家族β亚家族基因成员。RT-PCR检测家蚕不同发育时期和5龄第3天幼虫不同组织中BmGMCβ2基因mRNA转录水平,以5龄盛食期最高,并且主要在表皮、脂肪体和气管中转录表达;Westernblotting分析BmGMCβ2蛋白主要在5龄第3天幼虫的脂肪体中表达。将BmGMCβ2克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21表达菌株,IPTG诱导表达BmGMCβ2融合蛋白,通过His-亲和层析得到纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究该蛋白在家蚕生长发育过程中的功能奠定了基础。     

家蚕表皮基因BmGCP2的克隆及表达谱分析

从家蚕(Bombyxmori)表皮中克隆了一个高丰度表达的基因,根据其编码的氨基酸序列特征,发现是一个富含甘氨酸的表皮蛋白,将该基因命名为BmGCP2(GenBank登录号:EU980611)。进一步对BmGCP2基因进行了组织表达谱和发育时期表达谱分析,发现该基因在家蚕表皮中特异高表达,并且这种高表达一直从家蚕的胚胎发育后期持续到蛾期,表明BmGCP2基因编码的表皮蛋白是家蚕外骨骼的重要组成成分之一。     

piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探

为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。     

苜蓿尺蠖核多角体病毒对家蚕核多角体病毒在蚕体内复制的干扰

昆虫杆状病毒具有相对狭窄的宿主域.虽然苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)两者DNA序列的同源性在95%左右,但AcMNPV不能在家蚕细胞中很好的复制,对家蚕幼虫不具有致病能力,但其基因组中个别基因可在被接种该病毒的家蚕幼虫体内表达.这些基因的表达可能对共感染的优势病毒BmNPV复制所需原料蛋白及转录因子形成竞争,进而抑制BmNPV在家蚕幼虫体内的复制表达.     

黑寡妇蜘蛛牵引丝单一多聚序列对蚕丝性能改良的研究

蚕丝性能的优劣决定了蚕丝的价值和使用领域.本研究人工设计和构建了包含蜘蛛丝MaSp1基因中的32倍type1序列(32×MT1)和红色荧光蛋白表达框的piggyBac转基因质粒pBac[DsRed-32×MT1],通过显微注射家蚕品种兰10蚕卵获得了能够稳定遗传的转基因家蚕品系pBac-32×MT1.经荧光显微镜筛选、插入位点分析、mRNA表达丰度检测以及茧壳蛋白检测,证明了转基因家蚕能够表达融合了蛛蛛丝蛋白和轻链蛋白的重组丝.扫描电镜观察显示,转基因家蚕茧壳和丝纤维表面的形态和结构与野生型蚕品种兰10相近.傅里叶转换红外光谱去卷积分析表明,转基因家蚕丝蛋白二级结构中与丝应力有关的卢折叠含量达到63.6％,而野生型品种兰10丝蛋白的β折叠含量约为20％.蚕丝机械性能测定表明,转基因家蚕蚕丝的应力、应变和韧性比野生型家蚕丝分别提升了27.7％、10.7％和45.2％.上述结果表明,在家蚕基因组中导入MaSp1基因的type1单一多聚序列能显著增强重组丝的综合力学性能.     

家蚕HSP20·8基因体外表达及荧光原位杂交研究(英文)

前期研究发现,相对于其它组织器官,有一种低分子量热激蛋白在家蚕肾型卵中高量表达,并命名为低分子量热激蛋白HSP20.8。为了进一步阐明家蚕低分子量热激蛋白HSP20.8的基因结构、表达特性及其在家蚕染色体上的分布,根据HSP20.8基因cDNA序列设计特异引物,进行了克隆、表达及荧光原位杂交研究。结果表明,该基因含有1个561碱基对的开放阅读框(open reading frame,ORF),与cDNA序列比较分析发现该基因无内含子序列。重组蛋白的分子量在20 kD左右。热激蛋白基因HSP20.8在家蚕基因组中为单拷贝基因,其位点在染色体近中部区域。