猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中的表达

将猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列真核表达质粒,采用脂质体法转染COS-7细胞,经RT-PCR检测,转染重组质粒的COS-7细胞MSTN mRNA呈阳性,表明该重组体能够在真核细胞中完成转录过程。SDS-PAGE电泳结果有43 ku目的蛋白表达带,并用Western blotting证实了其表达的特异性,表明猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列可以在真核细胞中表达。     

牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达.提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体.     

猪MSTN前肽定点诱变载体在C2C12细胞中的表达

本研究旨在克隆通城猪含有第1个内含子的MSTN前肽基因,构建真核定点诱变载体,并通过转染C2C12细胞验证载体表达的有效性.以通城猪血液样品中提取的DNA作为模板,PCR扩增得到含第1个内含子的MSTN前肽基因,扩增产物进行克隆、测序.再将目的片段定向克隆到去除了EGFP基因的pEGFP-N1表达载体上.通过定点诱变方法将前肽编码序列第76位天冬氨酸突变为丙氨酸,获得定点诱变载体pEGFP(-)-N1-ProMstnD76A,并瞬时转染C2C12细胞.转染48 h后,通过RT-PCR和Real-time PCR方法检测目的基因的表达情况.结果表明:本研究成功克隆了通城猪含第1个内含子的MSTN前肽基因,并对该基因进行定点诱变修饰,构建了真核表达载体,转染后其前体mRNA能在C2C12细胞中进行正确剪接,目的基因mRNA表达水平较高.这为猪MSTN前肽基因在体内表达的研究奠定基础,并为制备转基因猪提供有用的分子材料.     

旋毛虫P53ES抗原基因的克隆及真核表达

应用RT-PCR方法扩增旋毛虫ES抗原P53基因,构建P53基因绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-P53,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS-7.于转染24 h后在荧光显微镜下观察到发绿色荧光的转染细胞;同时通过westen blot分析证实了P53基因表达产物的抗原性.结果表明,P53基因在COS-7细胞中表达获得了表达,而且其融合蛋白具有免疫原性.     

肌抑素对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响

本研究旨在揭示肌抑素(MSTN)与基质金属蛋白酶(MMPs)的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系:单等位基因敲除的PK3108细胞系和双等位基因敲除的L18细胞系,通过实时荧光定量PCR和Wesrern blotting分别检测PK15、PK3108和L18细胞系中MSTN、MMP-2/7/9基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与野生型猪相比,MSTN单等位基因敲除猪背膘组织转录因子C/EBPδ、MMP-2/7基因mRNA表达量均极显著下调(P0.01);细胞外基质中纤连蛋白(FN)和层连接蛋白(LN)含量均极显著增加(P0.01)。复苏的PK3108和L18细胞呈现绿色荧光。实时荧光定量PCR结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的mRNA表达量均极显著低于PK15细胞(P0.01);Western blotting结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的蛋白表达量均明显低于PK15细胞。本研究结果表明,在MSTN基因敲除的PK15细胞中,MSTN功能缺失能显著降低MMP-2/7/9的表达,且MMP-2/7/9蛋白表达降低的趋势与MSTN蛋白表达的趋势相一致。     

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列表达载体的构建及其转录水平的检测

构建猪肌生成抑制素(MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体，并对mRNA进行转录水平的检测，为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后，用PCR扩增的1．2kb目的片段与pMDl8-T载体连接，将克隆载体的质粒DNA与同样用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ限制性内切酶酶解的表达载体pET28a( )质粒定向连接，对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录，对mRNA Northern杂交进行转录水平的检测。结果，所得到的序列与所设计的序列完全一致，表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选；目的片段定向插入，阅读框架正确；RT-PCR成功地反转录得到约1．2kb的目的DNA片段，Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影，见到清晰的1．2kb特异带。     

猪H-FABP基因的克隆及真核表达载体的构建

心肌脂肪酸结合蛋白基因(H-FABP)是影响家猪肌内脂肪含量的重要候选基因之一。本研究以长白猪为实验材料,采用RT-PCR方法克隆H-FABP基因全长编码序列,并构建pEGFP-N1-H-FABP融合表达载体,通过脂质体介导转染PK15细胞,48 h后进行荧光表达检测。获得了猪H-FABP基因去终止密码子全长编码序列399 bp,成功构建pEGFP-N1-H-FABP融合表达载体,瞬时转染后在PK15细胞中顺利表达。本实验为进一步从细胞水平上解析及验证该基因的生物学功能奠定了基础。     

肌抑素对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响

本研究旨在揭示肌抑素（MSTN）与基质金属蛋白酶（MMPs）的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系：单等位基因敲除的PK3108细胞系和双等位基因敲除的L18细胞系,通过实时荧光定量PCR和Wesrern blotting分别检测PK15、PK3108和L18细胞系中MSTN、MMP-2/7/9基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与野生型猪相比,MSTN单等位基因敲除猪背膘组织转录因子C/EBPδ、MMP-2/7基因mRNA表达量均极显著下调（P < 0.01）;细胞外基质中纤连蛋白（FN）和层连接蛋白（LN）含量均极显著增加（P < 0.01）。复苏的PK3108和L18细胞呈现绿色荧光。实时荧光定量PCR结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的mRNA表达量均极显著低于PK15细胞（P < 0.01）;Western blotting结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的蛋白表达量均明显低于PK15细胞。本研究结果表明,在MSTN基因敲除的PK15细胞中,MSTN功能缺失能显著降低MMP-2/7/9的表达,且MMP-2/7/9蛋白表达降低的趋势与MSTN蛋白表达的趋势相一致。     

猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列真核表达载体的构建

从猪肌生成抑制素(MSTN)cDNA序列中设计引物。以pMD18-T-MSTN质粒为模板，PCR扩增猪MSTN成熟蛋白编码序列，该片段全长1095bp。将所得片段与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMT—mpMSTN，将其转化到大肠杆菌DH5a中，成功地筛选到阳性克隆。双酶切重组质粒pMT—mpMSTN和真核表达载体pcDNA3．1，连接目的片段与载体pcDNA3．1，转化大肠杆菌DH5a，经酶切、PCR及测序分析，表明成功地构建了真核表达质粒pcDNA3．1-mpMSTN。     

猪生长激素基因的克隆及在哺乳动物细胞中的表达

应用RT—PCR技术克隆了猪生长激素(pGH)cDNA，该基因编码蛋白的信号肽序列与已有报道的pGH基因存在2个氨基酸残基的差异，而成熟肽却无差异。将pGHcDNA定向插入真核表达载体VRl020，构建了重组真核表达质粒VpGH；利用脂质体法转染哺乳动物细胞COS7，对转染后的COS7细胞进行RT—PCR、ELlSA和免疫荧光分析，分另1在转录和翻译水平证实了目的基因在COS7细胞中得到正确转染表达。