小麦TaSPP基因的克隆及表达分析

为明确磷酸蔗糖磷酸酶基因(SPP)的表达特征和生物学功能,进一步了解SPP参与蔗糖生物合成的调控机制。以小麦抗旱品种晋麦47的cDNA为模板克隆出3个位于第5同源群上的TaSPP同源基因,分别命名为TaSPP-5A、TaSPP-5B和TaSPP-5D。并利用生物信息学对小麦TaSPP的理化性质、基因结构、顺式作用元件、系统进化树和蛋白保守结构域等进行分析,通过qRT-PCR分析基因TaSPP的表达模式。结果表明,TaSPP-5A、TaSPP-5B、TaSPP-5D都包含8个外显子和7个内含子,TaSPP-5A和TaSPP-5D编码422个氨基酸,TaSPP-5B编码413个氨基酸。系统进化分析显示,小麦TaSPP基因与小麦的近缘物种在进化上处于同一分支,相似度较高。qRT-PCR表达分析结果显示,TaSPP基因在根、茎秆、旗叶、叶鞘、颖花、种子中均表达,其中在旗叶和茎秆中表达量较高;ABA、PEG-6000、NaCl和IAA胁迫均能诱导TaSPP基因的表达,表明小麦TaSPP基因可能在逆境胁迫过程中发挥重要作用。     

植物磷酸蔗糖磷酸酶家族基因鉴定及序列和进化分析

磷酸蔗糖磷酸酶(sucrose phosphate phosphatase,SPP)是蔗糖合成途径中的关键酶;二磷酸尿苷葡萄糖和6-磷酸果糖为底物,蔗糖磷酸合成酶催化生成磷酸蔗糖,磷酸蔗糖在磷酸蔗糖磷酸酶作用下水解形成蔗糖。为了系统梳理SPP在植物基因组中的状况,我们对SPP基因进行了全面的挖掘、鉴定和进化分析,并重点分析该基因在番茄中的表达。首先,针对SPP的基因序列,挖掘得到2个蛋白结构域;其次,对该基因进行全面鉴定,构建其进化树,可发现SPP是从高等植物开始登陆的;最后,将番茄CDS序列比对到各探针,从数据库中提取组织中的表达数据,表明野生型番茄的表达量较高。本研究为磷酸蔗糖磷酸酶提供了基因信息,为植物中蔗糖合成途径的作用机理及其进化机制提供了基础研究。     

辣椒蔗糖磷酸合成酶和磷酸蔗糖磷酸酶基因家族鉴定及表达

蔗糖磷酸合成酶(SPS)和磷酸蔗糖磷酸酶(SPP)是植物蔗糖合成的重要酶,在调控蔗糖合成及其积累等方面有重要作用。辣椒基因组测序的完成及转录组数据的公布为鉴定和探究辣椒SPS和SPP基因的多样性提供了机会。本研究利用生物信息学方法对辣椒SPS和SPP基因进行鉴定,并从染色体定位、系统发育关系和表达模式分析其特征。结果发现,两个辣椒共含有4个SPS和SPP基因,每个辣椒种均编码2个成员,SPS编码的氨基酸长度和分子量约是SPP的2倍,等电点范围6.12～8.16和5.96～6.26之间。染色体定位发现辣椒SPS和SPP基因均定位在不同的染色体上。系统发育树的构建来自7个物种,结果表明SPS和SPP都可以分为4个亚族。表达谱分析显示,基因呈现差异表达,其中Ca-LZSPS1和Ca-LZSPP2呈现广谱性表达;进一步研究发现,SPS和SPP基因都受到3种激素(ABA, IAA, SA)不同程度的诱导;此外,在逆境胁迫下,辣椒SPS相比SPP更容易受到环境诱导,而SPP基因则在叶中主要参与热调控机制,在根中更多的参与冷调控机制。这些结果阐明了辣椒SPS和SPP基因的表达特性,为进一步研究辣椒中蔗糖的合成与积累提供理论依据。     

小麦矮腥黑粉菌效应蛋白g10613的基因克隆与生物信息学分析

本研究重点分析小麦矮腥黑粉菌的g10613基因编码效应蛋白的生物学功能。根据小麦矮腥黑粉菌基因组测序结果，筛选出编码效应蛋白基因g10613作为主要研究对象。将效应蛋白基因g10613成功克隆，并运用多种生物信息学数据库，解析了该蛋白的理化性质、保守结构域、跨膜区、亲疏水性以及信号肽。结果表明：g10613基因全长330 bp，共编码109个氨基酸；它所编码的效应蛋白质没有明显的家族结构特征；该蛋白质中亲水的氨基酸数量更多，是偏亲水蛋白质；在跨膜区分析中，它存在一个跨膜区，处于0～23氨基酸的位置。     

梨几丁质酶基因克隆及其生物信息学分析

对克隆获得的梨几丁质酶基因Lchi1进行生物信息学分析,从而为该基因的功能鉴定提供理论基础,以期为梨的抗病育种提供基因来源。根据Genbank中已克隆得到的几丁质酶基因保守区,在梨基因组数据库中进行Blast比对,调取DNA序列,从而设计引物,以高抗腐烂病品种‘小香水’(Pyrus ussuriensis cv. Xiaoxiangshui)为研究材料,克隆获得梨几丁质酶Lchi1基因cDNA全长,并对其进行初步的生物信息学分析。梨基因组数据库中调取的DNA序列2535 bp,含有3个外显子区、2个内含子区。Lchi1基因全长1300 bp,编码322个氨基酸,其蛋白的分子式为C1607H2407N415O468S17,分子量为35573.3 Da,理论等电点为7.10。二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构具有高度保守性。Lchi1编码蛋白为可溶性胞外蛋白,存在少量的潜在磷酸化位点,属于糖苷水解酶19家族,含有N-端信号肽,但是缺乏几丁质结合区。Lchi1基因属于CLASSⅡ几丁质酶基因,与其它科属植物的几丁质酶基因相似性均较高。     

枸杞LbXEGIP1基因的克隆与生物信息学分析

内切葡聚糖酶抑制蛋白(XEGIP)在植物防御病原菌侵袭中扮演了重要角色。本研究以宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)‘宁杞1号’为试验材料,采用RACE技术从枸杞花药cDNA中成功克隆了枸杞的XEGIP1基因,命名为LbXEGIP1,GenBank登录号为MG744343。结合生物信息学方法对LbXEGIP1基因编码的蛋白质进行理化性质、信号肽、亚细胞定位、蛋白结构以及系统进化等方面的预测分析。结果表明,该基因CDS序列全长1 290 bp,编码429个氨基酸,预测蛋白分子量为47.39 kD,等电点为8.59,是一个含有一个跨膜区和信号肽区域,脂溶性的稳定蛋白,它的亚细胞定位于细胞分泌途径中。LbXEGIP1属于天冬氨酸蛋白酶A1亚家族,在其N端和C端分别具有葡聚糖酶抑制子结构域。在其二级结构中无规则卷曲所占比例最高(35.66%),其次是延伸链(30.77%)。系统进化分析表明LbXEGIP1蛋白与甜椒中的XEGIP亲缘关系最近。枸杞XEGIP1基因的克隆及生物信息学分析,为后续研究该基因的功能以及枸杞病虫害的防治方面提供了依据。     

副干酪乳杆菌prcA基因克隆及生物信息学分析

旨在了解副干酪乳杆菌prcA基因的结构和功能,探明prcA基因与副干酪乳杆菌拟群体效应相关基因—自诱导肽编码基因之间的联系。通过PCR方法对副干酪乳杆菌中prcA进行扩增,并通过生物信息学方法对该基因的核苷酸组成、蛋白质构象等方面进行预测和分析。克隆得到的prcA基因全长为416 bp,包括一个138 bp的开放阅读框,编码45个氨基酸,蛋白分子量为5326.83 Da,等电点为4.85,是一种稳定蛋白,不含跨膜区,蛋白质的二级结构以α-螺旋、不规则卷曲和延伸主链组成,亚细胞定位预测显示该蛋白主要位于细胞外;prcA基因为副干酪乳杆菌拟群体效应相关基因—自诱导肽编码基因,负责细菌素生成的调控。     

水杉泛素结合酶基因的克隆

水杉(Metasequoia glyptostroboides)是著名的杉科孑遗植物,对水杉的分子遗传研究在其资源保护和利用方面具有重要意义。本研究以水杉为实验材料,在全长转录组测序的基础上克隆了一个泛素结合酶基因(MgUC-E2),并进一步对该基因作了生物信息学分析。结果表明:MgUC-E2基因cDNA编码链全长为691 nt,可以编码长度为148个氨基酸的泛素结合酶。该酶蛋白的分子量为16 545.09 kD,等电点为7.72,平均吸水值为-0.343;含有15个磷酸化修饰位点和5个常见功能位点;在预测的二级结构中共包括5个螺旋区、4个折叠区和一些无规则卷曲区;三级结构分析的结果进一步证实MgUC-E2基因就是编码泛素结合酶。本研究结果可为水杉及其它相关物种的泛素结合酶基因的结构及功能研究提供一些参考。     

白芨蔗糖转运蛋白基因BsSUT2的克隆和表达分析

蔗糖转运蛋白(SUTs)在介导蔗糖由源到库器官的长距离运输、植物生长发育以及抵抗逆境胁迫中发挥重要作用,研究白芨蔗糖转运蛋白BsSUT2的序列信息与表达模式,为揭示其蛋白结构及基因功能提供依据。基于白芨转录组数据,采用RT-PCR技术获得白芨Bs SUT2基因CDS全长,通过生物信息学软件分析Bs SUT2编码蛋白的分子特征,并对BsSUT2进行氨基酸序列比对与系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR技术检测BsSUT2基因的组织表达模式。结果表明,克隆获得的BsSUT2基因CDS全长为1 584 bp,编码527个氨基酸。BsSUT2蛋白包含12个跨膜结构域,亚细胞定位预测表明BsSUT2蛋白定位于质膜,与铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰SUT2基因编码蛋白序列一致性高,隶属于SUT4亚族。Bs SUT2基因的表达具有组织特异性,其转录本在白芨幼苗的假鳞茎中表达量最高。推测BsSUT2基因在白芨生长发育和蔗糖的分配中发挥重要作用。本研究对白芨BsSUT2基因的序列特征与组织表达模式进行分析,为阐明Bs SUT2基因在蔗糖运输与分配、生长发育和逆境胁迫中的功能提供实验数据支持。     

小麦磷脂酶Dα的基因克隆及其编码序列的生物信息学分析

为获得更多小麦抗逆基因资源,利用RT-PCR方法克隆了磷脂酶D基因(PLD),命名为TaPLDα,并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析.结果表明,TaPLDα开放阅读框为2 394 bp,编码812个氨基酸残基,等电点5.30,分子量为92 kDa.序列分析显示,TaPLDα基因编码的氨基酸序列含有N端C2结构域及2个保守的活性中心.预测TaPLDα蛋白是一个亲水性稳定蛋白且定位于细胞质,其二级结构含28.82％的α-螺旋、20.07％的延伸链、6.03％的B-转角和45.07％的不规则卷曲.该蛋白不存在信号肽,无跨膜区.TaPLDα与水稻、玉米和拟南芥的PLDα氨基酸序列之间具有高度的保守性,进化分析显示,小麦PLDα序列与毒麦、水稻和玉米PLD序列亲缘关系密切.     

小黑麦中调控花青素合成代谢的MYC基因克隆及序列分析

为了研究蓝粒小黑麦糊粉层中控制花青素合成的关键基因BcMYC1。本研究使用PCR方法克隆小黑麦中MYC转录因子BcMYC1。结果表明,小黑麦BcMYC1基因全长1683 bp,编码的氨基酸560个,分子量61870 Da,等电点4.71,有两个属于bHLH超级因家族的保守区,该蛋白具有亲水性,二级结构以α-螺旋(39.64%)和不规则盘绕(43.93%)为主要的部分,BcMYC1蛋白质不通过跨膜区,在膜外进行作用。蛋白系统进化分析表明,小黑麦的BcMYC1基因与小麦、矮牵牛、水稻等物种MYC调节基因的亲缘关系很高。本研究关于小黑麦中调控花青素合成代谢BcMYC1基因分子遗传机理,为小黑麦的花青素的研究提供参考作用。     

转细胞凋亡抑制基因OpIAP和p35增强小麦对纹枯病的抗性

Op IAP(Orgyia pseudotsugata inhibitor of apoptosis protein)是黄杉毒蛾核型多角体病毒中编码细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)的基因,p35基因编码苜蓿斜纹夜蛾核型多角体病毒中具细胞凋亡抑制作用的35 k Da蛋白。本研究人工合成了Op IAP和p35基因,构建了同时含有Op IAP和p35表达盒的转双价基因载体p Ubi:p35-RSS1P:Myc-Op IAP,两基因分别由玉米泛素基因启动子(Ubiquitin,Ubi)和水稻蔗糖合酶-1启动子(sucrose synthase-1 promoter,RSS1P)驱动。通过基因枪介导法将该载体导入小麦品种扬麦16,获得双价转基因小麦。对T0~T2代植株,利用PCR、RT-PCR、q RT-PCR及Western blot分析,确认导入的外源Op IAP和p35基因能够在4个转双价基因小麦株系中遗传并表达。用来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌强致病株型R0301和WK207对转双价基因小麦的T1、T2代植株分别进行纹枯病抗性鉴定,结果表明,与受体扬麦16相比,双价转基因小麦的T1、T2代植株对纹枯病的抗性明显提高,说明Op IAP和p35基因的表达可以增强转基因小麦对来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌的抗性。     

甜樱桃(Prunus avium)PaGAST基因的电子克隆及生物信息学分析

为获得甜樱桃PaGAST 基因的cDNA 序列,并预测该基因编码蛋白的结构与功能,以草莓FaGAST1 基因序列为探针,通过基于NCBI数据库中表达序列标签的电子克隆技术对甜樱桃PaGAST 基 因进行克隆。利用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、疏水性和亲水性、信号肽序列、跨膜结构域、亚细胞定位及功能等方面进行分析。结果表明：甜樱桃PaGAST 基因长度为750 bp,开放阅读框长度为324 bp,编码107 个氨基酸,N末端存在信号肽序列,C末端含有保守的GASA结构域。由于PaGAST蛋白中含有的疏水性氨基酸残基较多,该蛋白具有跨膜螺旋区,是一种跨膜蛋白,且有10 个预测的蛋白激酶磷酸化位点。亚细胞定位分析表明,PaGAST蛋白分布在细胞膜外的可能性很大。功能预测显示,PaGAST 基因可能具有响应胁迫应答、信号转导和免疫应答方面的功能。进化分析显示甜樱桃PaGAST蛋白与桃的亲缘关系最近。在一定程度上为甜樱桃PaGAST 基因的克隆及功能鉴定奠定理论基础。     

大鲵虹彩病毒-LY株主要衣壳蛋白基因克隆和分子特征研究

【目的】明确大鲵虹彩病毒-LY株主要衣壳蛋白（mcp）基因分子特征和我国不同CGSIV毒株mcp 基因变异及病毒的系统进化关系。【方法】克隆了CGSIV-LY株 mcp基因,并运用生物信息学软件对获得的基因信息进行了分析。【结果】CGSIV-LY 株mcp基因全长1392bp,可编码463个氨基酸。预测蛋白质分子量为50.03ku,理论等电点是5.75,为亲水性可溶蛋白。CGSIV-LY 株mcp不含有信号肽;没有跨膜区存在;抗原表位预测显示抗原性良好;结构预测显示,存在8个潜在的N-糖基化位点,存在17个潜在的O-糖基化位点和20个潜在的磷酸化位点。CGSIV-LY 株 mcp二级结构中无β-折叠,无规则卷曲占57.66%,延伸链占31.11%,α- 螺旋占11.23%,主要以延伸链和无规则卷曲为主。氨基酸序列包含3个结构域：氨基酸N末端,氨基酸C末端和capsid_NCLDV保守区结构域,并在氨基酸序列的第414~436区存在一个低复杂度域。氨基酸序列多重比对和基于mcp氨基酸序列构建的蛙病毒属成员系统进化树分析结果显示,包括CGSIV-LY 株在内的我国出现的不同CGSIV毒株之间mcp 基因差异很小,为平行进化关系,共同聚为蛙病毒属成员独立的一支。【结论】CGSIV-LY 株 mcp为可溶性亲水蛋白,具有良好的抗原性和较为丰富的潜在糖基化位点和磷酸化位点。其蛋白二级结构以延伸链和无规则卷曲为主。我国出现的不同CGSIV毒株mcp基因差异很小,应具有基本一致的分子结构和特征。     

小麦TaPLD-2基因的克隆及功能分析

为了寻找耐盐新基因,培育耐盐新品种。本研究以23个小麦品种为材料,对TaPLD-2基因进行克隆及序列多态性分析,并对TaPLD-2基因响应盐胁迫表达模式进行了研究。结果表明,TaPLD-2基因的全长编码框为1301 bp,位于2DS染色体上,编码的蛋白定位于细胞质,为亲水蛋白,无跨膜区域,属于可溶性NAD(P)(H)氧化还原酶家族;TaPLD-2基因受盐胁迫诱导上调表达,表达量在盐胁迫24 h为对照组的1.8倍,48 h达到最高,为对照组5倍。分析表明SNP位点与相对根长、相对株高及K⁺、Na⁺含量都存在一定程度的相关性。     

苦荞FtC4H基因克隆与生物信息学分析

克隆苦荞苯丙烷类物质代谢途径中的关键酶肉桂酸-4-羟基化酶基因（FtC4H）,为进一步研究其功能奠定基础。以云荞1号和小米荞为材料,提取不同发育期果壳RNA,利用RT-PCR法克隆苦荞FtC4H基因,运用生物信息学分析FtC4H蛋白的特征,构建FtC4H蛋白系统进化树,分析其基因表达。结果表明,克隆的FtC4H基因序列包含1299bp完整的cDNA开放阅读框,编码432个氨基酸,为亲水性不稳定碱性蛋白,具有P450超家族保守域,不具有跨膜结构域,有丰富的二级结构,三级结构预测显示FtC4H与6vby.1.A的序列相似度高。系统进化分析结果表明,本研究克隆的FtC4H与已报道的苦荞其他C4H基因不同。qRT-PCR结果表明,FtC4H在小米荞的花和叶中相对表达量显著高于云荞1号。     

灌浆前期碳氮供应对冬小麦籽粒蛋白质和淀粉积累的影响

采用花后离体穗培养技术，研究蔗糖和谷氨酰胺不同浓度配比供应对冬小麦（宁麦9号）籽粒淀粉和蛋白质积累的影响。结果表明：在同样谷氨酰胺水平下，提高蔗糖供应水平能显著增加粒重，促进籽粒中淀粉积累，但降低蛋白质合成；在同样的蔗糖水平下，提高谷氨酰胺供应水平，既有利于籽粒中蛋白质积累，也促进淀粉合成。培养基中     

小麦Cyp450基因的电子克隆与生物信息学分析

为获得对小麦Cyp450基因及其编码蛋白质的理化性质与结构特性等,利用电子克隆方法克隆了一个新的小麦Cyp450基因,并对其编码的蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明,该基因全长2155 bp,编码511个氨基酸;该蛋白序列的N端存在一个显著信号肽序列,属于CypX超家族,该蛋白定位于细胞质中,属于分泌途径中的信号肽蛋白,含有多个不同的磷酸化位点;二级结构以α螺旋（占48.14%）和无规则卷曲为主（占33.86%）,存在5个不稳定区,在85-511位处形成一个较大的球形蛋白域。该蛋白与大麦、二穗短柄草、水稻和高粱的同源Cyp450蛋白相似性较高,进化距离较近。获得了一个新的小麦细胞色素P450基因,并分析了其编码蛋白质的序列特性,为进一步实验克隆和研究其功能提供了理论基础。     

香菇GPX基因克隆及其在采后贮藏中的表达分析

以香菇（Lentinula edodes)为材料,对谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GPX）进行基因的鉴定、编码序列克隆、蛋白生物信息学分析以及基因表达模式分析。结果表明：成功鉴定并克隆1个LeGPX基因,该基因开放阅读框（Open reading frame,ORF） 621 bp,所编码蛋白包含206个氨基酸残基;系统发育分析显示LeGPX蛋白与小皮伞（Marasmius fiardii）和灰色果腐菌（Moniliophthora roreri）的GPX亲缘关系较近,同源比对结果显示LeGPX蛋白包含GPX特征序列和催化位点。生物信息学分析表明：LeGPX为亲水性不稳定蛋白,蛋白分子质量22.81 kD,理论等电点8.83;二级结构以无规则卷曲为主,不含信号肽和跨膜结构。通过原核表达和纯化成功获得了LeGPX可溶性蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）显示蛋白大小符合预期。荧光定量PCR分析表明,香菇褐变发生过程中LeGPX基因表达量快速上升,并且与菌盖相比,LeGPX在香菇菌柄部位表达更为活跃。