ε-聚赖氨酸在牛胚胎玻璃化冷冻中的保护作用

通过研究ε-聚赖氨酸(ε-PL)对牛胚胎玻璃化冷冻的影响,探讨ε-PL在牛胚胎玻璃化冷冻中的保护作用,为优化牛胚胎玻璃化冷冻技术提供依据。单独以ε-PL作为冷冻保护剂,其质量浓度为20、35、50g/L,分别进行胚胎冷冻,结果均不能取得成活胚胎,说明ε-PL不能单独作为冷冻保护剂使用。在传统玻璃化冷冻剂中分别添加质量浓度为10、20、30g/L的ε-PL进行胚胎冷冻,结果发现添加ε-PL之后的冷冻保护液具有更好的保护效果,且ε-PL质量浓度为20g/L时效果最好,囊胚解冻孵化率可达42.37%。进一步探索了用该冷冻保护剂,缓冲时间分别为5、7.5、10min进行胚胎冷冻的效果,结果发现缓冲时间为7.5 min取得最高孵化率,孵化率为46.58%。结果表明,ε-PL对牛胚胎玻璃化冷冻具有一定的保护作用,且适当延长缓冲时间可取得更好的冷冻效果。     

昆明小白鼠卵巢玻璃化冷冻的研究

为了探讨小鼠卵巢组织玻璃化冷冻时适宜的平衡时间和冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)的适宜浓度,试验采用不同平衡时间(10 min、15 min、20 min)及不同浓度(15%、20%、25%)的DMSO作为冷冻保护剂对2月龄昆明小白鼠的卵巢组织进行处理,处理后的卵巢组织采用玻璃化冷冻法进行冷冻,用解剖法采集冷冻解冻后的卵巢卵母细胞,通过对卵母细胞染色及体外成熟培养判定卵巢的冷冻效果。结果表明:以平衡时间为20 min的试验组小鼠卵巢冷冻效果较好,其卵母细胞存活率为65.0%,卵母细胞成熟率为27.4%;DMSO浓度则以20.0%为宜,冷冻解冻后卵巢内卵母细胞染色后存活率为66.7%,体外培养后卵母细胞成熟率为38.3%。     

不同冷冻方法对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

通过采用程序降温法(试验1:分步法10%甘油;试验2:直接法1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖)和玻璃化法(试验3:20%甘油+0.3M蔗糖+0.3M木糖+3%聚乙二醇+20%乙二醇)对牛体外受精胚胎进行冷冻保存及解冻后进行孵化培养试验,用囊胚孵化率对各方法进行了比较。结果表明,10%甘油组、1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖组及玻璃化组胚胎存活率分别为85%、82.5%、90%;囊胚孵化率分别为50%、55%和80%(P<0.05)。体外受精胚用玻璃化法保存显著优于程序降温法,可获得较高的胚胎存活率(90%)和囊胚孵化率(80%)。     

不同冷冻方法对水牛体外生产胚胎冷冻效果的研究

本研究采用不同来源的体外生产胚胎(屠宰场卵巢IVF胚胎,OPU-IVF胚胎,SCNT胚胎),系统研究了不同冷冻方法对水牛体外生产胚胎冷冻效果的影响,以完善水牛体外生产胚胎冷冻方法,进一步提高胚胎冷冻效果。试验选用6～7日龄囊胚分别用不同的冷冻液和不同冷冻方法进行胚胎冷冻。玻璃化冷冻液分别为40%EG、25%EG+25%DMSO和20%EG+20%DMSO+0.5 mol/L蔗糖;程序化冷冻液分别为10%甘油和0.05 mol/L海藻糖+1.8 mol/L EG+0.4%BSA。结果表明:(1)在玻璃化冷冻中,无论何种胚胎不同冷冻液的冷冻效果有明显的差异,但均以20%EG+20%DMSO+0.5 mol/L蔗糖作为冷冻液的冷冻效果最好,并且高于程序化冷冻的存活率;而对于程序化冷冻,用10%甘油作为冷冻液,屠宰场卵巢IVF胚胎的冷冻后存活率略高于用0.05 mol/L海藻糖+1.8 mol/L EG+0.4%BSA的冷冻后存活率,但差异不显著(P>0.05)。(2)VF胚胎利用程序化冷冻胚胎解冻后,在0～24 h内有76.5%胚胎复活,高于玻璃化冷冻的复苏率(48.9%)(P<0.05);而与此相反,在24～48 h内,玻璃化冷冻胚胎的复苏率(42.6%)则高于程序化冷冻(23.5%)(P<0.05)。综上所述,各种来源的水牛体外生产胚胎均可进行冷冻保存,应用玻璃化冷冻的效果好于程序化冷冻,且以20%EG+20%DMSO+0.5 mol/L蔗糖作为冷冻液进行玻璃化冷冻效果最好,但程序化冷冻后的胚胎复苏速度明显快于玻璃化冷冻的速度。     

水牛徒手克隆胚胎培养及冷冻条件的优化

本试验利用微滴、微穴和平板培养系统对徒手克隆(hand-made clone,HMC)重组胚进行体外培养;采用了40% EG(ethylene glycol,EG)、25% EG＋25% DMSO(dimethylsulphoxide,DMSO) 和20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖作为玻璃化冷冻液对HMC囊胚进行了超低温冷冻;并且比较了HMC与传统核移植的胚胎生产效率及囊胚冷冻存活率。结果表明,微穴系统的卵裂率要显著高于平板系统(P<0.05),极显著高于微滴系统(P<0.01);且微穴系统的囊胚率(40.0%)极显著高于平板(19.8%)和微滴系统(8.3%)(P<0.01)。采用20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖作为冷冻保护剂时HMC囊胚存活率极显著高于40% EG(P<0.01);HMC重组胚的融合率和囊胚率均高于传统核移植法(P<0.05;P<0.01),而HMC囊胚的冷冻存活率与传统核移植生产的囊胚没有显著差异。以上结果说明水牛HMC可以替代传统核移植法生产克隆胚胎,微穴体系最适合水牛HMC胚胎的体外培养,且采用20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖对HMC囊胚进行玻璃化冷冻可以取得良好的冷冻效果。     

玻璃化冷冻牛体外受精胚胎不同解冻方法试验研究

用添加5％犊牛血清(FCS)的TCM-199进行卵母细胞成熟,BO液进行体外受精后,在5％犊牛血清的CR1aa液进行体外培养获得牛体外受精胚胎。经玻璃化冷冻保存,解冻后分别用分步脱出保护剂和一步脱出冷冻保护剂后,进行孵化试验,解冻后透明带完整率为100％,解冻后分步脱出保护剂和一步脱出保护剂存活率分别为90％(36／40)、50％(20／40);囊胚孵化率分别为80.6％(29／36)、35％(7／20);48小时存活率分别为52.8％(19／36)、20％(4／20);两者间差异极显著(P<0.01)。用含20％和5％犊牛血清(FCS)的TCM-199培养孵化,分步法脱出保护剂,培养囊胚孵化率分别为83.3％(15／18)、77.8％(14／18);48小时存活率分别为55.6％(10／18)、50.0％(9／18)。两者差异不显著(P>0.05)。用含20％和5％犊牛血清(FCS)的TCM-199培养,一步法脱出保护剂囊胚孵化率分别为40％、30％,两者差异不显著(P>0.05)。48小时存活率相同,为20％。本试验结果表明,玻璃化冷冻胚胎,分步法添加保护剂,解冻后分步脱出保护剂可以获得较高的存活率和囊胚孵化率。     

应用1.8mol/L乙二醇+蔗糖冷冻保存奶牛胚胎

以 1 .8 mol/L乙二醇 0 .1 mol/L蔗糖 2 0 ?S-m PBS和 1 .8mol/L乙二醇 0 .0 5mol/L蔗糖 2 0 ?S-m PBS对奶牛胚胎进行了冷冻保存试验 ,并与以 1 .4 mol/L丙三醇 2 0 ?S-m PBS常规冷冻保存奶牛胚胎效果进行了比较。冷冻程序为 -7℃平衡 5min后植冰 ,平衡 1 0 min,然后以 0 .3℃ /min的速率降至 -3 3℃ ,直接浸入液氮中保存。胚胎解冻后的培养结果 ,3组之间的胚胎存活率 ,分别为 80 .0 %( 1 6/2 0 )、90 .5%( 1 9/2 1 )、90 .0 %( 1 8/2 0 ) ,差异不显著 ( P>0 .0 5) ;胚胎的囊胚孵化率 ,1 .8mol/L乙二醇 0 .0 5mol/L蔗糖组达 81 .0 %( 1 7/2 1 ) ,极显著高于 1 .8mol/L乙二醇 0 .1 mol/L蔗糖组的 3 0 .0 %( 6/2 0 )和 1 .4mol/L丙三醇组的 2 5.0 %( 5/2 0 ) ( P<0 .0 1 )。 1 .8mol/L乙二醇 0 .0 5mol/L蔗糖组冷冻的 A级胚胎和 B级胚胎之间的存活率差异不显著 ( P>0 .0 5) ,但是 A级胚胎的囊胚孵化率 ( 1 0 0 %,1 1 /1 1 )显著高于 B级胚胎( 60 %,6/1 0 ) ( P<0 .0 5)。另外 ,胚胎解冻后透明带断裂对其发育率无影响 ;冷冻前胚胎在 1 .8mol/L乙二醇 0 .0 5mol/L蔗糖液中平衡 1 0 min和平衡 2 0 min,冷冻解冻后培养发育率差异不显著 ( P>0 .0 5)。试验结果表明 ,应用 1 .8mol/L乙二醇 0 .0     

山羊胚胎冷冻保存技术研究

本研究探讨了不同抗冻保护剂、不同冷冻方法、玻璃化液(EFS40)中添加FCS和BSA,以及冷冻前细胞松驰素B处理对山羊胚胎冷冻保存效果的影响。结果表明,山羊胚胎常规冷冻时以1.5 mol/L EG为抗冻保护剂的保护效果最好,解冻后胚胎发育率为70.59%,孵化率为58.82%;玻璃化冷冻细管法和OPS法以EFS40为保护液的冷冻效果较好,其解冻后胚胎的发育率分别为67.57%和52.94%;EFS40中添加BSA的冷冻保护效果显著地高于不添加其他成分的EFS40;山羊胚胎冷冻前用细胞松驰素B处理,能提高冷冻保存的效果。     

小鼠囊胚和扩张囊胚玻璃化冷冻保存的研究

以6M甘油+6.5%PVP(V1)和8MEG+7%PVP(V2)为玻璃化溶液,采用细管法和OPS一步法对小鼠囊胚进行冷冻.结果表明:胚胎在玻璃化溶液中平衡20S显著高于平衡60S后的存活率(P＜0.05);蔗糖四步法解冻后的发育率与蔗糖三步法冷冻解冻后的发育率差异不显著(P＞0.05);用OPS三步法冷冻后(V2)的小鼠囊胚的体外发育率显著高于细管法和OPS一步法冷冻后的发育率(P＜0.01);在OPS三步法冷冻过程中,平衡时间对胚胎冷冻后的发育率有一定的影响.     

小鼠囊胚和扩张囊胚玻璃化冷冻保存的研究

以6M甘油+6.5%PVP(V1)和8MEG+7%PVP(V2)为玻璃化溶液,采用细管法和OPS一步法对小鼠囊胚进行冷冻。结果表明:胚胎在玻璃化溶液中平衡20S显著高于平衡60S后的存活率(P<0.05);蔗糖四步法解冻后的发育率与蔗糖三步法冷冻解冻后的发育率差异不显著(P>0.0 5);用OPS三步法冷冻后(V2)的小鼠囊胚的体外发育率显著高于细管法和OPS一步法冷冻后的发育率(P<0.01);在OPS三步法冷冻过程中,平衡时间对胚胎冷冻后的发育率有一定的影响。     

影响奶牛体外受精胚胎培养效果的胚胎因素

对胚胎因素影响奶牛体外受精胚胎培养效果进行了研究。结果发现,在胚胎因素中,胚胎类型(冻胚和鲜胚)与胚胎发育阶段对胚胎培养效果没有显著影响(P>0.05);冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响极显著(P<0.01);冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著(P<0.05),解冻后A级胚胎存活率(80%,128/160)、囊胚孵化率(58.75%,94/160)显著高于B级胚胎存活率(59.38%,95/160)和囊胚孵化率(37.5%,60/160)(P<0.05);解冻水浴温度(20℃、30℃)对培养效果有极显著影响(P<0.01)。     

猪孤雌激活4-细胞胚胎玻璃化冷冻保存效果的研究

本实验旨在研究猪孤雌激活4-细胞胚胎的冷冻保存效果。胚胎采用Cryotop法进行玻璃化冷冻保存,解冻后分析其存活率、胞内活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)水平、囊胚发育率及囊胚质量。结果表明:冷冻胚胎体外恢复2 h的存活率与新鲜胚胎无明显差异(100%vs.96.8%,P0.05),但当其培养时间达到24 h时,存活率显著下降至88.3%(P0.05)。另外,玻璃化冷冻导致胚胎内ROS水平显著升高(P0.05),GSH水平显著下降(P0.05)。与新鲜胚胎相比,冷冻胚胎获得的囊胚发育率明显降低(59.8%vs.26.4%,P0.05),但囊胚的凋亡细胞率、内细胞团数、滋养层细胞数及总细胞数均无明显差异(P0.05)。结果显示,玻璃化冷冻猪孤雌激活4-细胞胚胎导致其存活、氧化还原能力和囊胚发育下降,但仍能获得较高质量的囊胚。     

F1代和ICR小鼠体外、体内受精后8-细胞胚胎玻璃化冷冻的比较

探讨了F1代(♀ICR×♂BALB/C6J)和ICR小鼠体外受精及体内受精两种不同来源获得的8-细胞胚胎玻璃化冷冻效果。不同来源的小鼠胚胎在预热到37℃1MDMSO溶液中处理后,转移到冷冻管中5min然后加入DAP213,并在0℃平衡5min后冷冻。体外受精及体内受精两种方法获得的F1代小鼠8-细胞胚胎解冻后的存活率分别为92.5%和93.33%;ICR代小鼠8-细胞胚胎解冻后的存活率分别为65.83%和67.50%。同一品系体外受精与体内受精来源的8-细胞胚胎冷冻复苏后胚胎存活率差异不显著(P>0.05),但不同品系体外受精及体内受精来源的8-细胞胚胎复苏率差异均显著(P<0.05),表明8-细胞胚胎冷冻复苏率的高低与胚胎获得的方法无关,但与品系的不同有关。     

小鼠2-细胞胚胎细管法和OPS法玻璃化冷冻保存技术的研究

本试验在室温 (2 0℃和 2 5℃ )条件下 ,利用不同浓度的玻璃化溶液 (EFS和EDFS) ,对小鼠 2 细胞胚胎进行细管法和OPS法玻璃化冷冻保存。在 2 0℃室温条件下 ,用EFS4 0平衡 1min细管一步法冷冻 ,解冻后囊胚发育率仅为35 .0 % ,和新鲜 2 细胞体外培养的对照组 (6 5 .0 % )的差异极显著 (P <0 .0 1)。当 2 细胞胚胎在 10 %EG +10 %D溶液中预处理 5min ,再移入EDFS中平衡 30s二步法冷冻保存 ,解冻后囊胚发育率达 4 7.8%～ 4 8.8% ;当室温升至2 5℃时 ,二步法冷冻保存后 2 细胞的囊胚发育率达到 5 2 .2 % ,与对照组无显著差异 (P >0 .0 5 )。改用OPS二步法EFS30冷冻组保存后的 2 细胞胚胎的囊胚发育率高达 6 2 .2 % ,为试验中的最佳组。用最佳细管法和OPS法冷冻组解冻后培养至囊胚移植给受体母鼠均获得产仔     

冷冻管法保存兔胚胎的研究

为建立兔的胚胎库,探索一种效果稳定可靠、方法简捷的冷冻方法,试验选择冷冻管法一步式玻璃化冷冻保存兔胚胎,比较了不同冲胚时间对兔胚胎冷冻保存效果的影响.配种后65 h冲胚保存效果好于60 h和55 h,复苏胚胎囊胚孵化率依次为:63.1%、62.5%和60.7%,差异不显著.不同预处理对冷冻效果的试验中,胚胎在4℃预处理4 min保存效果最好,囊胚孵化率为71.5%.在4℃下2 min的保存效果(21.6%)低于同组的其它处理,差异显著(P＜0.05).室温1 min的保存效果略高于前者(31.0%),但显著低于同组其它处理(P＜0.01).优化冷冻过程以后,比较两品系的冷冻效果,青紫兰兔(Chinchilla Rabbit,CR)有效供体的平均胚胎数高于新西兰兔(New Zealand White Rabbit, NZWR),42.4±8.8 vs 38.9±5.5 枚/只,但差异不显著(P＞0.05).胚胎移植后,新西兰兔6只受体1只死亡,5只妊娠,产活子38只,青紫兰受体5只有4只妊娠,共产活子28只.胚胎活子效率28.8%和25.9%(NZWR和CR),差异不显著.显示冷冻管一步法玻璃化冷冻保存兔胚的方法可以保存兔胚并获得子兔.     

水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存

以水牛MII期的卵母细胞为材料,利用玻璃化冷冻液EDS33(16.5%EG+16.5%DMSO+sucrose)对水牛MII期的卵母细胞进行两步法(玻璃毛细管(GMP)和拉细的开口塑料细管(OPS))玻璃化冷冻保存,即卵母细胞首先放入预平衡液(7.5%EG+7.5%DMSO+sucrose)中平衡3 min,再移入玻璃化冷冻液中30 s后装管直接投入液氮.解冻是在蔗糖浓度逐渐降低的解冻液中进行的.解冻后存活的卵母细胞孤雌激活,通过囊胚发育率作为评定卵母细胞冷冻效果的指标.结果发现,GMP和OPS法冷冻保存的水牛卵母细胞解冻后的存活率(分别为96.80%和97.41%)与对照组卵母细胞的存活率(100%)3者之间差异均不显著(P>0.05).GMP法和OPS法冷冻的水牛卵母细胞激活后的胚胎分裂率和囊胚发育率2者均明显低于对照组(分别为30.58%和28.32% vs50.94%,10.81%和9.38% vs 29.63%,P<0.05),而这2种方法冷冻的水牛卵母细胞激活后的分裂率和囊胚发育率差异均不显著(P>0.05).这表明GMP和OPS玻璃化冷冻方法可以用于水牛卵母细胞的冷冻,并且玻璃化冷冻的卵母细胞能继续分裂并发育到囊胚.     

牛胚胎玻璃化超快速冷冻一步法移植试验

应用 30 %乙二醇 0 .3mol/ L 蔗糖 - m- PBS液 (VS1)、30 %乙二醇 0 .3m ol/ L 蔗糖 5 %葡聚糖 (T- 5 0 0 ) - m-PBS液 (VS2 )、30 %乙二醇 0 .3mol/ L蔗糖 10 %葡聚糖 (T- 5 0 0 ) - m- PBS液 (VS3)玻璃化超快速冷冻奶牛胚胎 ,一步法移植。结果显示 ,VS1、VS2、VS3组玻璃化超快速冷冻奶牛胚胎解冻后的形态正常率分别为 10 0 % (2 0 / 2 0 )、95 %(19/ 2 0 )和 5 5 .6 % (5 / 9) ;培养存活率分别为 70 % (14 / 2 0 )、75 % (15 / 2 0 )和 2 2 .2 % (2 / 9) ;囊胚孵化率分别为 0、2 0 % (4/2 0 )和 0。VS1、VS2组玻璃化冷冻奶牛胚胎解冻后的形态正常率极显著地高于 VS3组 (P<0 .0 1) ;VS1、VS2组玻璃化冷冻奶牛胚胎解冻后的培养存活率分别显著 (P<0 .0 5 )和极显著 (P<0 .0 1)地高于 VS3组。 VS1组冷冻的胚胎经一步法移植了 5头 (1枚 /头 ) ,未获得妊娠 (0 / 5 ) ;VS2组冷冻的胚胎用一步法移植了 10头 (1枚 /头 ) ,结果获得 2头妊娠(2 / 10 ) ,并产下 2头正常犊牛。     

昆明小鼠成熟卵母细胞冷冻保存方案的优化与改进

5-6周龄雌性昆明小鼠的成熟卵母细胞,在不同前处理液(10% EG或10% EG 10% DMSO)中平衡5 min,然后在冷冻溶液(EFS30、EFS40、EDFS30或EDFS40)中平衡30 s后进行开放式拉长麦管法(OPS,open pulled straw)和固体表面冷冻法(SSV,solid-surface vitrification)玻璃化冷冻保存研究.试验结果表明:玻璃化冷冻中,多种抗冻保护剂组合使用的效果优于使用单一抗冻保护剂,而且EDFS冷冻液冷冻保存小鼠卵母细胞的效果好于EFS,尤其是EDFS30;SSV法冷冻保存小鼠成熟卵母细胞效果优于OPS法.     

OPS玻璃化冷冻对小鼠四倍体胚胎体外发育的影响

为探究开放式拉长细管(OPS)玻璃化冷冻对四倍体胚胎发育的影响,本实验利用2-细胞胚胎电融合法制备四倍体胚胎,再对四倍体胚胎进行OPS玻璃化冷冻,分别观察记录二倍体胚胎、四倍体胚胎以及冷冻解冻后四倍体胚胎的发育情况。结果表明:2-细胞胚胎电融合效率为96.1%;二倍体胚胎组与电融合后四倍体胚胎组的囊胚率和孵化囊胚率差异不显著;冷冻解冻后四倍体胚胎的囊胚率(100%)与四倍体新鲜组(93.3%)差异不显著,其孵化囊胚率(72.3%)较新鲜组(64.9%)显著增高(P<0.05);四倍体冷冻解冻组的囊胚细胞数(31.96)与新鲜组(32.54)无显著差异;冷冻解冻后的四倍体早期囊胚进行体外培养时其发育速度比对照组更快。可见,冷冻对小鼠四倍体胚胎的囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响,但孵化囊胚率显著提高,且OPS玻璃化冷冻后使四倍体胚胎的发育速度更快。     

小鼠卵母细胞和胚胎不同冷冻方法的比较研究

探讨程序化冷冻与玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞及二细胞期胚胎的复苏率及其发育潜能的影响。通过小鼠的卵母细胞与早期胚胎的不同冷冻方法的比较,为后续阿旺绵羊的胚胎冷冻保存提供参考。采用程序化冷冻与玻璃化冷冻技术,分别冷冻小鼠GV期卵母细胞及二细胞期胚胎,复苏后培养,比较不同冷冻处理后的复苏率、成熟率与囊胚率。小鼠GV期卵母细胞程序化冷冻复苏率(48.00%±5.29%)显著低于玻璃化冷冻复苏率(65.00%±5.00%),有统计学差异(P=0.0147<0.05);而程序化冷冻后复苏卵母细胞的发育成熟率略高于玻璃化冷冻组,但无统计学意义。小鼠二细胞期胚胎程序化冷冻组复苏率(76.00%±2.00%)显著高于玻璃化冷冻组复苏率(70.00%±2.00%),有统计学差异(P=0.0213<0.05);冷冻后复苏胚胎发育的囊胚率程序化冷冻略低于玻璃化冷冻及对照组,但无统计学意义。