利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数

[目的]探讨SYBR Green实时定量PCR技术应用于检测转基因植物外源基因拷贝数的可行性。[方法]使用SYBR Green实时定量PCR技术,以转CYCD3;1的拟南芥为材料,通过CYCD3;1基因与单拷贝内参基因以及转基因株系中的CYCD3;1基因与野生型植株的比较来确定外源基因的拷贝数。[结果]该法计算所得外源基因拷贝数与传统高准确性的Southern blot法结果相符。[结论]使用该法检测外源基因拷贝数简单易行,可操作性强。     

转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考.[方法]采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法.[结果]构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高.在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0.[结论]建立的转基因烟草中外源基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析.     

TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR法检测 转基因植物外源基因拷贝数的差异分析

探讨TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR 2种方法检测转基因植物外源基因的拷贝数方法的差异。以12株T0转基因水稻为材料,分别用TaqMan与SYBR Green实时定量PCR法检测其拷贝数,然后用SAS 9.1软件对2种方法的结果进行t检验分析。通过SAS对2组数据的t检验分析,在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green与TaqMan探针法的结果接近,差异不显著;当内参基因与目的基因扩增效率差异明显时,SYBR Green与TaqMan探针法差异显著。在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green法测定转基因植物外源基因的拷贝数时结果接近TaqMan探针法。     

实时定量PCR检测转基因绵羊拷贝数

[目的]利用高通量、快速、灵敏的实时荧光定量PCR法,检测转类胰岛素样生长因子1-红色荧光蛋白基因(insulin-like growth factor 1-red fluorescent protein,IGF1-RFP)绵羊中外源基因的拷贝数.[方法]以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为绵羊的内源参照基因,梯度稀释法.[结果]分别获得RFP和GAPDH基因的Q值与起始模板数的相关性标准曲线,R2分别为0.999和0.999,相关性高.通过比较目的基因RFP和GAPDH起始模板数,得到外源基因在转基因绵羊中的拷贝数.编号0152、0216、0217、0218的转基因绵羊拷贝数分别为3、1、1、1.[结论]以IGF-Ⅰ转基因细毛羊为研究对象,针对外源基因序列和内源参照基因序列设计特异性引物,利用实时荧光定量PCR法对IGF-Ⅰ转基因细毛羊外源基因的拷贝数进行检测,并且准确检测外源基因的拷贝数.     

TaqMan定量PCR检测水稻中外源基因含量

[目的]采用TaqMan定量PCR技术检测水稻中外源基因含量。[方法]采用TaqMan定量PCR技术以编码磷脂酶D基因PLD为内标准基因,检测转基因水稻中外源TT51-1的含量。利用DNA梯度稀释法分别求内标准基因PLD和TT51-1的C_t值与拷贝数对数值的标准曲线方程,并将得到的C_t值代入标准曲线方程求取样品中外源基因的拷贝数。[结果]内标准基因PLD标准曲线方程为y=-3.403x+39.939,R~2=0.993;TT51-1基因标准曲线方程为y=-3.35x+37.37,R~2=0.991,转基因含量为1.21%,不确定度为0.45。[结论]TaqMan定量PCR技术可以用于确定转基因作物外源基因含量。     

抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测研究

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNA SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术，扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因。绘制2种基因扩增的循环数一拷贝数标准曲线图，根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量；并作重现性和熔解曲线分析。结果表明，lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好，R^2值分别达到0．9997和0．9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示，实测值与实际值接近，相对偏差5％～11％。SYBR Green I实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。     

SYBR Green I实时荧光PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明：应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2（±0.5）。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。     

SYBR~ Green I实时荧光PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5)。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。     

SYBR(R) Green Ⅰ实时荧光PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR(R)Green Ⅰ实时PCR方法.同时针对油菜FatA基因设计出内源基因.结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR(R)Green Ⅰ染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5).SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法.     

Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数

[目的]采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源nos终止子基因的拷贝数。[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的Ct值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数。[结果]内参照基因标准曲线方程为y=-3.422x＋35.201,R2=0.998;外源基因标准曲线方程为y=-3.348x＋34.890,R2=0.999。nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝。[结论]该研究为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据。     

SYBR Green实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数

采用SYBR Green I real-time PCR方法检测转基因大豆中外源基因35S边界基因的拷贝数,以大豆凝集素基因(Lectin)作为内参照基因,以转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,初始浓度为0.43μg·μL-1,进行5倍梯度稀释得到内参照基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线:y=-2.9915x...     

转基因小麦B73-6-1外源基因拷贝数的确定

为了确定转基因小麦B73-6-1中外源基因HMW-GS的拷贝数,以期为HMW-GS基因的整合位点和遗传表达研究奠定基础,构建了含有外源基因HMW-GS的标准品,并以wx012基因作为内源参照,通过实时荧光定量PCR方法,进行了3次重复试验。结果表明,在3组试验中得到的HMW-GS基因分子数分别为8.62×1018、4.34×1018、1.10×1018个,wx012基因分子数分别为6.27×1017、3.14×1017、7.84×1017个,经计算HMW-GS基因拷贝数分别为13.75、13.84、14.01个,由此确定转基因小麦B73-6-1中HMW-GS外源基因的拷贝数为14个。     

转基因拷贝数对农艺性状的影响

[目的]研究转基因拷贝数对转化植株农艺性状的影响。[方法]以农杆菌介导的遗传转化法获得的水稻转基因植株为材料,观察其株高、分蘖、扬花、籽粒形状及饱满度、抗虫性等。同时获取PCR为阳性的单株叶片进行Southern杂交,检测转入基因的拷贝数,研究转基因拷贝数对转化植株农艺性状的影响。[结果]T0代转基因植株的农艺性状有较多改变,如白化、矮化、分蘖少及种子畸型等。转基因植株的转基因拷贝数影响其农艺性状,拷贝数越多农艺性状改变越大,目标基因越容易受到抑制而不表达。在T0代表现感虫的转化植株其T1代也表现感虫。[结论]转基因植物商品化时,应选择单拷贝的转化植株。     

马铃薯T-DNA插入拷贝数的检测及对农艺性状的影响研究

以转基因马铃薯株系为材料,采用Real-time PCR方法,以SYBR Green I为荧光染料,以马铃薯块茎贮藏蛋白基因(Patatin)作为内参基因,以植物表达载体上的潮霉素抗性基因(HPT)为筛选标记基因,建立目的基因CT值与起始模版的相关性标准曲线,通过实时荧光定量PCR分别获得每个样品中内参基因和外源基因的CT值,根据Pfaffl法计算获得了T-DNA在转基因马铃薯中的拷贝数,且与Southern blot方法进行了比较,并结合田间农艺性状,分析了外源基因拷贝数马铃薯株高及薯块产量的影响。结果表明,内参基因和外源基因标准曲线的相关系数分别为R2=0.996、R2=0.995和R2=0.990。在所测的23株转基因株系中,12株为单拷贝插入,6株为双拷贝,5株为多拷贝。Real-time PCR比Southern blot方法结果更准确、操作更简便快捷、成本更低。且插入拷贝数的多少与马铃薯田间农艺性状变化有一定的关系,发现2拷贝以上的T-DNA插入较容易引起部分性状的改变。     

鸡IL-6、IL-17和IFN-γ实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立针对鸡白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）和γ干扰素（IFN-γ）的实时荧光定量PCR检测方法,为细胞因子的定量检测及病毒致病机制的研究奠定基础.[方法]根据GenBank已发表的鸡IL-6、IL-17、IFN-γ和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因保守序列,设计并合成4对相应的特异性引物,以鸡胚成纤维细胞的cDNA为模板构建重组质粒,对退火温度、引物浓度等SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应条件进行优化,建立各基因的标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性试验.[结果]GAPDH、IL-6、IL-17和IFN-γ的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增效率分别是98.2％、99.2％、102.0％和100.8％,相应的标准误差为0.00666、0.00813、0.00365和0.00458.特异性试验结果显示各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰,敏感性试验结果表明各基因的检测下限均为100拷贝,重复性试验结果表明组内变异系数均小于2.00％.[结论]建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、特异性强等特点,为快速检测和定量鸡源IL-6、IL-17和IFN-γ的表达水平提供了技术平台.     

实时荧光定量PCR鉴定小麦矮腥黑穗菌技术研究

 【目的】建立荧光定量PCR体系以准确灵敏的鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)【方法】根据筛选的TCK独有差异基因片段（1 322 bp）设计特异性引物对CQUTCK4/CQUTCK5和TaqMan 探针CQUP1,建立SYBR GreenⅠ荧光染料法和TaqMan水解探针法定量PCR检测体系,并对体系进行优化。【结果】建立的两套定量PCR检测体系的检测下限相当,可达到0.1fg,对应的拷贝数为2.31×104个,检测灵敏度比常规PCR高2～3个数量级,均可成功鉴别出TCK与小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries (DC)Tul,TCT),并可快速准确检测小麦矮腥黑穗菌冬孢子和检测罹病小麦植株体内的侵染菌丝体。【结论】建立的2种定量PCR检测技术可运用于小麦矮腥黑穗病的早期诊断。     

转基因番茄植株Mi1.2表达水平的Real Time PCR检测体系的建立

[目的]为转基因番茄植株的高通量筛选奠定基础。[方法]利用CTAB法提取番茄叶片总RNA进行Real Time PCR扩增,分析转Mi1.2基因的番茄植株表达水平的检测体系。[结果]提取RNA的A260/A280为1.78~1.88,RNA无明显降解。在严谨扩增条件下,引物SYBR2的扩增效率高于SYBR1。Mg2+的适宜浓度为2.0 mg/L。Real Time PCR扩增产物具有良好的特异性,熔解曲线特异峰出现在84.5℃附近,在熔解曲线略低于83℃附近有极微弱的非特异峰。因此在定量反应中信号检测步骤应放在84℃。以4种不同模板分子数条件下扩增曲线Ct值得到的回归方程为Y=-3.78×log(copynumber)+39.50,相关系数为0.998。[结论]该试验获得的Real Time PCR体系可用于转基因植株表达水平的检测。     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。