奶牛乳腺上皮细胞体外培养条件优化的初步研究

从培养基、细胞接种浓度、冻存液三方面对奶牛乳腺上皮细胞体外培养条件进行了优化。采用台盼兰染色计数方法绘制细胞生长曲线,评定细胞体外生长增殖。结果表明,使用DMEM/F12培养基细胞生长状况最好,DMEM培养的细胞较DMEM/F12生长缓慢,F12其次,RPMI1640培养细胞生长最慢;以1×104的接种浓度于24孔板,细胞生长状态最好,细胞的生长周期经历了潜伏期、对数生长期、稳定期、衰亡期4个生长阶段,生长曲线符合"S"型生长规律;采用胎牛血清(90%FBS+10%DMSO)和培养基(70%培养基+20%FBS+10%DMSO)两种冻存液冻存奶牛乳腺上皮细胞,细胞复苏培养后,胎牛血清冻存的细胞生长状态和增殖速度都明显优于培养基冻存的奶牛乳腺上皮细胞,从培养的第3天开始,2组细胞数量差异显著(P0.05)。本研究结果为建立体外培养体系提供了一定参考。     

不同培养代数鹿茸生长中心细胞对IGF1刺激 的反应

【研究目的】探讨胰岛素样生长因子（IGF1）对生长60 d的梅花鹿鹿茸体外培养不同代数鹿茸生长中心细胞的影响。【方法】分离、培养生长60d的梅花鹿鹿茸生长中心细胞,将培养第2 代、5 代、8 代细胞经含有不同浓度的IGF1（0,1,3 和10 nM）作用,在培养24 h后用3H-胸腺嘧啶核苷掺入测定法检测每分钟衰变数（DPM）值。【结果】全部IGF1处理组都显著高于对照组（p<0.01）。不同浓度IGFⅠ处理组的平均值和最高值都是离体培养2 代的细胞的DPM最高（分别为31918和39818 DPM/mg蛋白）,培养5 代的细胞（分别为5455和6815 DPM/mg蛋白）已大大地下降;到了第 8代的（分别为4030和4838 DPM/mg蛋白）又有进一步的下降。【结论】IGF1能够促进鹿茸生长中心细胞分裂增殖,生长60 d鹿茸的生长中心细胞在离体培养,不同培养时期的鹿茸生长中心细胞对IGFⅠ刺激的敏感度不同。     

IGF1对生长30d鹿茸的体外培养鹿茸生长中心干细胞的影响

【研究目的】利用细胞培养技术,探讨胰岛素样生长因子（IGF1）对生长30d的鹿茸体外培养不同代数梅花鹿鹿茸生长中心干细胞（鹿茸干细胞）的影响;【方法】原代分离、培养生长30d的鹿茸的梅花鹿鹿茸干细胞．将第2代、5代、8代鹿茸干细胞经含有不同浓度的IGF1（0,1,3,和10nM）作用后,在培养24h后用3H．胸腺嘧啶核苷测定法检测每分钟衰变数（DPM）值;【结果】取材于生长30d鹿茸的干细胞,全部IGF1处理组（1,3,10nM）都显著高于对照组（0nM）（p〈0．01）。3个不同浓度IGFI处理组的平均值和最高值都是离体培养2代的细胞最低（分别为2987和3743DPM／mg蛋白）,而培养5代的细胞最高（分别为10320和12180DPM／mg蛋白）．第8代的细胞又开始下降（分别为8754和11568 DPM／mg蛋白）;【结论】IGF1能够促进鹿茸干细胞分裂增殖,生长30d鹿茸的干细胞在离体培养,不同培养时期的鹿茸干细胞对IGF1刺激的敏感度不同。     

IGF1对不同培养代数梅花鹿鹿茸间充质层细胞增殖的影响

【研究目的】通过细胞培养技术,探讨胰岛素样生长因子1（IGF1）对体外培养不同代数的梅花鹿鹿茸间充质层细胞增殖的影响。【方法】分离、培养生长90d的梅花鹿鹿茸间充质层细胞,将传代培养第2代、5代、8代细胞经含有不同浓度的IGF1（0,1,3,和10 nM）作用,培养24 h后用3H-胸腺嘧啶核苷掺入测定法检测蛋白合成放射性含量。【结果】不同浓度IGF1处理组的蛋白合成放射性含量的平均值和最高值都是离体培养2代的细胞最高（分别为32146和35973 DPM/mg）;培养5代的细胞（分别为2781和3206 DPM/mg）已明显下降;第8代时（分别为489和736 DPM/mg）又进一步下降,并且与对照组无显著的差异。【结论】不同培养时期的梅花鹿鹿茸间充质层细胞对IGF1刺激的敏感度不同,取材于生长90天鹿茸的间充质层细胞在离体培养8代后已失去了对IGF1刺激的敏感性。     

梅花鹿鹿茸间充质层与前成软骨层细胞的培养及SB-431542对其增殖的影响

分离培养梅花鹿鹿茸间充质层细胞和前成软骨层细胞,通过研究TGF-β的特异性小分子拮抗剂SB-431542对这两种细胞增殖的影响,探讨TGF-β在鹿茸间充质层细胞和前成软骨层细胞增殖与分化中的调节机制。从生长30天的梅花鹿鹿茸中分离间充质层细胞和前成软骨层细胞,进行体外培养,将传代培养第2代的间充质层细胞和前成软骨层细胞分别在含不同浓度SB-431542（0、1、3、5、8、10 μmol/L）的培养液中培养,48小时后用MTT法测定这两种细胞增殖活性的变化,用SPSS软件对其增殖的差异性进行分析。结果显示,体外培养的鹿茸间充质层细胞呈成纤维细胞样,前成软骨层细胞呈纺锤形或梭形,台盼兰染色显示细胞活性均在90%以上。经SB-431542处理的间充质层细胞的增殖活性低于对照组(P＜0.05),而前成软骨层细胞增殖活性高于对照组(P＜0.05),且3μmol/L和5μmol/L的SB-431542处理的前成软骨层细胞增殖活性明显高于对照组(P＜0.01)。试验表明,TGF-β可能在维持鹿茸间充质层细胞的快速增殖和诱导间充质细胞向软骨细胞分化等过程中起重要的作用。     

鹿茸角软骨细胞体外培养方法的建立及生长特性分析

【研究目的】建立梅花鹿鹿茸软骨细胞体外分离培养和扩增方法，观察鹿茸软骨细胞在体外培养的生物学特性，为鹿茸再生机理的研究奠定基础；【方法】体外分离培养鹿茸软骨细胞，采用组织学、MTT比色法、免疫组化等多种手段动态检测细胞生长增殖情况；【结果】核心部分，约150字鹿茸软骨细胞贴壁生长，原代细胞比传代生长速度快，原代及传代4代内的鹿茸软骨细胞均有活跃的增殖能力，软骨细胞呈三角形，多边形等多种形态，II型胶原免疫组化，甲苯胺蓝染色为阳性；【结论】体外分离培养鹿茸软骨细胞具有较强的增殖能力，传代培养4代内细胞生长旺盛并维持其生物学特性, 可满足后续实验研究要求。     

SB-431542对梅花鹿鹿茸软骨层细胞增殖的影响

通过研究转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)的特异性小分子拮抗剂SB-431542对梅花鹿鹿茸软骨层细胞增殖的影响,探讨转化生长因子β在鹿茸快速生长中的调节机制。分离培养生长30天的梅花鹿鹿茸软骨层细胞,将传代培养第2代的细胞经不同浓度的SB-431542 (0,1,3,5,8,10μM)作用,培养48小时后用MTT法测其细胞增殖的变化,并用SPSS软件分析其差异性。结果显示,SB-431542处理组细胞增殖活性都低于对照组(P＜0.05),其中浓度为8μM和10μM的SB-431542处理组与对照组相比差异非常显著(P＜0.01),随着添加SB-431542浓度的升高,对细胞的生长速度抑制更加明显,试验表明,TGF-β对维持梅花鹿鹿茸软骨层细胞的快速增殖有重要作用。     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

本试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组：85%DMEM+10%胎牛血清+5%DMSO;B组：80%DMEM+10%胎牛血清+10%DMSO;C组：75%DMEM+10%胎牛血清+15%DMSO;D组：70%DMEM+10%胎牛血清+20%DMSO;E组：85%DMEM+5%胎牛血清+10%DMSO;F组：75%DMEM+15%胎牛血清+10%DMSO;G组：70%DMEM+20%胎牛血清+10%DMSO;H组：80%DMEM+10%胎牛血清+10%甘油;I组：70%DMEM+10%胎牛血清+20%甘油;J组：60%DMEM+10%胎牛血清+30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106 /mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明：BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24 h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P>0.05);传代后B组细胞的生长状况最好。     

大白猪仔猪皮肤成纤维细胞系建立及生物学特征

为获得可用于体细胞核移植中需要的供核细胞,本试验研究了大白猪仔猪(约克夏)皮肤成纤维细胞分离、培养、传代的方法,及其体外生长特征.应用本研究方法,所培养细胞在体外的生长增殖过程呈典型的"S"型.在冷冻、复苏试验中,组织块或细胞经冷冻保存复苏后活率较冻存前有所下降,但大多数细胞仍能正常生长.通过本方法,可以获得能在体外正常传代培养的细胞系,为动物克隆研究提供了供核细胞来源.     

山羊表皮干细胞分离纯化的研究

表皮干细胞（epidermal stem cells,ESCs）干细胞特性的维持是干细胞内在属性和微环境共同作用的结果,体外长期培养ESC的关键是维稳定的微环境。实验将组织块脱出的细胞经分次消化和IV型胶原快速贴附分离出表皮干细胞,在含20%条件培养基的无血清培养液进行培养。原代细胞表现K19阳性,并且能形成PGC集落样细胞团。从表皮和真皮组织中均可得到上皮样细胞,经纯化后均表现出明显的表皮干细胞特性：呈片状生长,铺路石样形态。将两类细胞分别传至5代和8代,后代细胞β1整合素染色呈阳性。对5代和8代细胞分别进行克隆分析实验,其克隆形成率分别为18.5%和8.5%。实验证明组织块法能够得到较好的维持ESC的微环境,所分离的ESC具有干细胞特性并能稳定传代。     

梅花鹿鹿茸软骨细胞的培养及X型胶原的克隆和序列分析

X型胶原是肥大软骨细胞的标志物，据GenBank 中收录的人、鼠、牛、猪X型胶原基因的序列，进行同源性分析，在同源性高的相对保守区域设计了1对特异性引物。建立梅花鹿鹿茸软骨细胞的分离培养方法，培养鹿茸软骨细胞。提取细胞的总RNA，以总RNA为模板，用RT-PCR方法克隆了梅花鹿的X型胶原基因序列为877的片段，此片段全部位于编码区，与已报道的牛的X型胶原基因的序列比较，同源性达到96%。共有35个碱基发生变异。DNAStar 软件分析表明，二者推导的氨基酸序列同源性为95.5%。     

东北梅花鹿血液SOD纯化及部分性质的研究

为了研究生茸期梅花鹿血液中SOD纯化技术及其部分性质,为开发鹿血抗衰老资源奠定理论基础。用氯仿乙醇除血红蛋白、热变性、丙酮沉淀、DEAE层析等技术对生茸期鹿血SOD进行纯化;用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其亚基分子量。结果表明：SOD的初始比活力为12.84 U/mg,经纯化后得到SOD 0.16 mg/mL,最终比活力4122.74 U/mg,纯化倍数为321.2倍,回收率66.38%;鹿血SOD含有2个亚基,其相对分子量为17.32 KD和16.28 KD。结果提示：鹿血SOD在60℃,0.002 mmol/L的Cu2+浓度下SOD活力最高,此时所得SOD纯化效果较好。     

吉林省梅花鹿副结核病血清流行病学调查

摘 要：调查2012年吉林省梅花鹿副结核病感染现状,为吉林省今后制订梅花鹿副结核病预防控制规划提供科学依据。采集吉林省富有代表性的4个梅花鹿养殖地区的630份血清样本,用ELISA方法进行副结核病血清流行病学调查。吉林省梅花鹿血清中副结核分枝杆菌抗体检测阳性率为18.73%,其中,辽源的梅花鹿副结核病阳性率为25.00 %,为吉林省副结核病之首,而四平的梅花鹿副结核病的阳性率为11.86%,明显低于其他3个地区。通过对梅花鹿在年龄与性别方面进行统计学两两比较分析发现,仔鹿与育成鹿及成年鹿之间均存在显著差异(P<0.05),育成鹿与成年鹿二者之间没有统计学意义(P>0.05),而不同性别鹿群的副结核病阳性率差异性不显著(P>0.05)。吉林省梅花鹿副结核病流行不容乐观,提示广大饲养者及相关部门应该高度重视梅花鹿副结核病的防治工作。     

牛滋养层干细胞样细胞系的建立

为了成功建立牛滋养层干细胞样细胞系,探讨牛滋养层干细胞样细胞（Bovine Trophoblastic Stem-like Cells）体外培养条件及相关影响因素,以胎牛子宫成纤维细胞条件培养液作为培养基,胶原铺被培养皿,利用体外受精牛囊胚培养得到牛滋养层干细胞样细胞,并调整培养体系,以探讨其最适生长条件。结果表明：利用添加FBS、β-巯基乙醇、肝素以及胎牛子宫成纤维细胞条件培养液的DMEM/F12,体外培养牛囊胚,可以初步建立牛滋养层干细胞样细胞系。     

Biocompatibility of Acellular Porcine Dermis

In vitro cultured vascular endothelial cells (VEC) and mouse 3T3 fibroblasts (3T3) on the acellular dermal matrix , which were made of porcine skins. We made the cell proliferation test with MTT assay and the histological observation after cells were seeded on the acelluar dermis for 1 week with histological section. The cell growth curves showed VEC and 3T3 grew much rapidly on the acelluar dermis.The histological observation revealed VEC had formed a monolayer, some places even had formed 2 to 3 layer. The results suggest that the acelluar porcine dermal matrix have good biocompatibility , it will be widely applied.