鹅细小病毒YBLJ株VP3基因的真核表达

为了研究鹅细小病毒(GPV)YBLJ株VP3基因的生物学特性,根据已克隆的GPV YBH株VP3基因序列(GenBank:JN836326),设计并合成一对特异性引物,经PCR扩增、克隆、转化、酶切与亚克隆,构建真核表达载体pcDNA-VP3,将鉴定正确的质粒转染至Vero细胞,经RT-PCR检测VP3基因转录水平,通过间接免疫荧光试验(IFA)观察VP3基因表达水平.结果显示,克隆的VP3基因全长约1 605 bp;构建了真核表达载体pcDNA-VP3,经RT-PCR对转染细胞总RNA扩增得到特异性目的片段,IFA检测显示VP3基因在Vero细胞中获得了稳定表达.本研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础.     

猫泛白细胞减少症病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

根据猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)GT-2株VP2蛋白全长基因序列设计1对特异性引物,以GT-2毒株为模板,PCR扩增VP2基因片段(去除终止密码子);与转座载体pFastBacI连接,构建重组质粒pFastBac-VP2,并进行测序鉴定;鉴定正确后,转化到含有辅助质粒的大肠杆菌DH10Bac中,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中;经蓝白斑筛选后获得重组Bacmid-VP2,转染Sf9昆虫细胞。电镜负染结果表明:重组Bacmid-VP2在昆虫细胞中包装,形成了大量的杆状病毒粒子;VP2蛋白得到表达并形成了FPV病毒样颗粒。直接免疫荧光试验证明,FPV VP2蛋白在重组杆状病毒中获得了表达。利用双抗体夹心ELISA法检测病毒样颗粒的表达量,表明目的基因在昆虫细胞中获得了较高水平的表达。将表达蛋白作抗原免疫小鼠,经抗体测定证明表达的重组蛋白能诱导机体产生特异性免疫应答。     

鹅细小病毒主要结构蛋白基因的扩增、克隆与原核表达载体的构建

根据已发表的鹅细不病毒（GPV）核苷酸序列设计并合成了1对引物,对GPV主要结构蛋白VP2和VP3基因进行扩增。所获得的PCR产物与预期片段大小相符,约1.8kb。将该片段直接与真核表达pCR3.1T载体连接,转化人感受态大肠杆菌TOP10F＇中增值。在对所提质粒进行快速鉴定、PCR扩增以及BamH I酶切线性化初步鉴定的基础上,经限制性内切酶Sca I 和EcoR V分别酶切进行正反向鉴定,获得了3个正向插入的克隆（PVPA）和2个反向插入的克隆（PVPB）。将正向插入的克隆PVPA1与原核表达载体pET-28b（ ）分别用BamH I和Xho I双酶切后,回收目的片段进行定向连接,并转化入感受态大肠杆菌DH5a中。对所获得的重组质粒分别经Sca I、EcoR V、BamH I/Xho I酶切,证实含有目的基因,且基因插入方向正确,成功地构建了含有GPV主要结构蛋白基因的原核表达载体,为高效原核表达以及研制更为有效的基因工程疫苗打下了基础。     

新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达及重组病毒的免疫原性

将新城疫病毒（四平株）F基因插入到pFastBac Ⅰ质粒中，构建了重组质粒pFF。pFF转化大肠杆菌DH10Bac后，F基因在助手质粒（helper plasmid)提供转座酶的情况下，通过转座进入Bacmid，构建了重组Bacmid(re-Bacmid)。在含有X－gal/IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上，筛选白色菌落后，提取re-Bacmid转染Sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内，re-Bacmid经复制、表达、装配、形成重组杆状病毒，并表达F蛋白。经SDS－PAGE和Western-blot分析，表达的F蛋白的分子大小为63000，并证明在昆虫细胞内表达的蛋白能部分糖基化。表达的F蛋白约占细胞总蛋白的10％。动物试验证明，约建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性。     

猪O型口蹄疫病毒样颗粒的构建及鉴定

为开发猪O型口蹄疫病毒（FMDV）病毒样颗粒（VLPs）基因工程亚单位疫苗,试验参考GenBank中登录的FMDV毒株基因序列（登录号：JN998085）,设计针对VP1、VP2、VP3和VP4 4个基因片段的特异性引物,以O型FMDV O/MYA98/XJ/2010毒株的cDNA序列为模板,对目的基因进行PCR扩增;将获得的VP3、VP1和VP4、VP2基因片段分别插入2个杆状病毒供体质粒（pFastBacDual）的p10和pH双元启动子中,构建pFBD-VP3-VP1和pFBD-VP4-VP2 2个重组转座质粒;将验证正确的2个重组转座质粒分别转化含有穿梭载体（Bacmid）的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得2个重组杆粒rBacmid-VP3-VP1和rBacmid-VP4-VP2,经验证正确后,对其进行扩增和提取,将其分别转染Sf9贴壁昆虫细胞,构建2个重组杆状病毒rvAc-VP3-VP1和rvAc-VP4-VP2;2个重组杆状病毒共同感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞,利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内对4个基因进行表达,目的蛋白通过间接免疫荧光试验（IFA）、SDS-PAGE、Western blotting及透射电镜（EM）进行检测。结果显示,本研究成功构建2株分别表达FMDV VP1、VP2、VP3和VP4 4个结构蛋白的重组杆状病毒;特异性抗体检测发现,4个蛋白VP1~VP4均成功表达,且具有良好的特异性反应;4个蛋白在Sf9昆虫细胞内能够完成自我组装,形成与天然病毒结构相似的VLPs,直径大小在25~30 nm。本研究利用共感染表达方式在Sf9昆虫细胞内成功制备出FMDV病毒颗粒,为开发高效安全的FMDV基因工程亚单位疫苗开辟了一条新思路。     

新城疫病毒SX-1株F基因定点突变及真核表达研究

根据已发表的分离自麻鸡的新城疫病毒SX-1株F基因序列,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物,引物中含有突变位点.应用重叠PCR延伸法,分3次PCR扩增F基因,从而得到突变后的F基因,命名为F基因,使改造后的F基因编码的氨基酸裂解位点为112GlyArg-Gin-Gly-Arg-Leu117.在EeoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点将F基因与转座载体pFastBac Ⅰ连接,获得重组质粒,并进行PCR、酶切鉴定,核苷酸序列测定正确的pFastBac-F'质粒转化到DH10Bac宿主茵,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中,经筛选获得的重组Bacmid F'质粒转染Sf-9昆虫细胞,并进行表达检测,表达产物间接免疫荧光试验阳性,经SDS-PAGE、Western-blotting检测显示,获得分子量约63 ku的蛋白特异条带,说明F'重组蛋白表达成功.     

鹅星状病毒、鹅细小病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断鹅星状病毒(GoAstV)和鹅细小病毒(GPV),根据GoAstV和GPV基因序列保守区域设计了两对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测这两种病毒的PCR诊断方法.该方法能够特异性扩增出两种病毒的相应片段,而对鹅副粘病毒(GPMV)、鹅流感病毒(GAIV)、鹅腺病毒(GA...     

鹅细小病毒NS2基因以及VP1与VP3非重叠序列基因的真核表达

采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒（GPV）的检测抗原，利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VPl与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP（1-3），分别转染sf9细胞，得到重组病毒，分别表达出了54ku的NS2融合蛋白和24ku的VP（1-3）融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实，表达产物具有特异性；间接免疫荧光试验证实，重组蛋白在细胞中获得了表达。     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

鹅细小病毒JLDA株主要结构蛋白VP3基因的克隆及序列分析比较

以分离得到的鹅细小病毒JLDA株基因组DNA为模扳，根据GPVB株的基因序列设计一对扩增GPV VP3基因的特异引物，利用PCR技术，从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段，与pMD18 T simple vector连接，转化到感受态大肠杆菌DH5α中，提取重组质粒经PCR鉴定后，对插入片段进行序列测定及分析。分析结果：JLDA病毒株的VP3基因全长1605bp，编码534个氨基酸。与国内外已经发表的鹅细小病毒Goose parvovirus virulent B strain，completegenome（vp3）、GDFSH株、QTH株、Gooseparvovirus capsid protein VP3 gene-YZ、SY株、GD-01株、SCH株和DY株的核苷酸、氨基酸序列同源性在90．90％～98．10％之间，表明这9个毒株之间同源性很高，有共同的保守序列，为开发新型基因疫苗提供依据。     

我国鹅的遗传资源与鹅业生产

我国是世界养鹅历史最早的国家之一，也是世界上饲养数量最多的国家之一，饲养量与出栏量约占世界90％左右。据历史考证，在3000多年前，我国就开始驯化养鹅，从古到今，由于我国人民一直就有养鹅、爱鹅、吃鹅的习惯，再加上我国幅员辽阔，各地自然生态条件复杂多样，不同时期的经济文化背景不同，对鹅的选择和利用目的不同，就逐步形成了20余种具有不同外貌特征、     

小鹅瘟与鹅几种常见病的鉴别诊断

小鹅瘟(Goose parvovirus,GP)又称得舍氏(Derzsy)病、小鹅病毒性肠炎、鹅细小病毒感染等,是由小鹅瘟病毒引起的一种急性或亚急性的败血性传染病.本病多发生于2～30 日龄内的雏鹅,特别是以10日龄时发病率和死亡率最高,其发病率和病死率随雏鹅日龄增大而降低.病鹅表现为食欲减退甚至废绝、精神不振、嗜睡,两腿麻痹或痉挛;肛门向外突出,周围被毛潮湿并沾有污染物,排出灰白色或者淡黄色稀粪便,常混有气泡.     

Physiology of the growing and adult goose

Total protein, albumin, globulin and NPN of serum were determined, at approximately 4‐week intervals, in the growing phase and the first reproductive cycle of the goose. Levels of serum albumin and globulin, and therefore total protein, increased with age from 1–20 weeks. Non‐protein nitrogen declined through this period. In the adult phase, males had fairly constant values of serum albumin and globulin while females showed significant increases in these serum constituents. These increases were associated with egg production. Sex differences in non‐protein nitrogen did not occur in adult geese.     

Physiology of the growing and adult goose

The packed cell volume, haemoglobin concentration, erythrocyte sedimentation rate and specific gravity and percentage water of whole blood and plasma were determined at 4‐week intervals in male and female Pilgrim goslings from 1 to 20 weeks of age and in adult geese at 4‐ to 5‐week intervals from 34 to 59 weeks of age.

All parameters studied increased during the growing period except erythrocyte sedimentation rate which declined. There were no significant sex differences at any time during this period.

The packed cell volume of adult males remained relatively constant from 34 to 50 weeks while that of the females declined. After 50 weeks the female level began to rise in contrast to a decline in the males so that the values were about the same for both sexes at 59 weeks. Differences between sexes were highly significant between 43 and 50 weeks.

Changes in haemoglobin content and whole blood specific gravity were positively correlated with changes in packed cell volume while changes in erythrocyte sedimentation rate were negatively correlated.

Plasma specific gravity of adult males remained relatively constant whereas that of females decreased prior to commencement of egg production at 43 weeks, then increased significantly and remained significantly above the male level for the remainder of the adult period.     

板蓝根多糖抗小鹅瘟病毒的作用

在鹅胚内用板蓝根多糖(IRPS)作直接杀毒和阻断感染试验,对鹅胚尿囊液中小鹅瘟病毒(GPV)含量、鹅胚存活时间、存活率、病变和免疫组化进行测定。结果显示,40μg/胚IRPS阻断感染组,GPV接种后72h ELISA检测为阳性的尿囊液最高稀释倍数23;鹅胚平均存活时间192h;存活率6/6;胚体肉眼观察未见病变;切片镜检可见肝、肾轻度淤血和细胞变性,心、脑轻度淤血和水肿;免疫组化显示肝、肾内GPV表达抗原为弱阳性,心、脑内为阴性。而攻毒对照组尿囊液GPV阳性的最高稀释倍数28;鹅胚存活时间138h;存活率0/6;胚体严重萎缩、出血、水肿,各组织细胞碎裂、坏死,组织内GPV表达抗原全为强阳性。两者比较,各指标具有极显著差异。这表明在鹅胚内IR-PS具有极强的阻断GPV感染、增殖和保护胚体组织器官免受其损伤的作用。     

原位PCR检测雏鹅体内鹅细小病毒方法的建立及其应用

通过建立能对石蜡切片中鹅细小病毒(GPV)核酸进行定位的原位PCR方法,为GPV在鹅体内的定位、致病机理研究等提供有效的试验手段.根据GPV的VP3基因序列设计PCR引物和寡核苷酸探针,以GPV感染鹅肝脏和空肠组织石蜡标本制作切片,经蛋白酶K消化、原位PCR扩增和碱性磷酸酶标记的寡核苷酸探针原位杂交,建立了检测石蜡标本中GPV的间接原位PCR方法并应用于自然感染GPV高免血清紧急免疫后鹅肝脏和空肠组织临床病料检测.结果显示间接原位PCR对人工感染GPV死亡鹅肝脏和空肠的石蜡标本检测结果为阳性,而鹅病毒性肝炎、鹅多杀性巴氏杆菌病、鹅沙门菌病和鹅大肠杆菌病死亡鹅肝脏的石蜡标本检测结果为阴性;间接原位PCR对自然感染GPV高免血清紧急免疫后第6天的鹅肝脏和空肠组织检测20个样本中,空肠组织有8个呈阳性,肝脏组织有4个阳性结果均为阳性,阳性细胞有空肠上皮细胞、肝窦上皮细胞等.     

鹅的饲养管理技术

鹅是草食水禽 ,以放牧、饲喂青绿多汁饲料为主 ,结合补料和科学饲养管理以提高经济效益已被越来越多的养鹅户所采用。为此 ,笔者将鹅的饲养管理技术作一叙述。1　雏鹅饲养管理1 1　育雏前的准备接雏前首先要选好鹅舍的场地 ,要选择在有水源、草源丰富、草质良好的地方 ,鹅舍坐北朝南为好。对育雏室内外进行彻底的清扫消毒 ,堵死鼠洞、蛇洞。保证育雏室干燥、通风、光线好。墙壁可用 2 0 %的石灰水粉刷 ,地面、天花板用 2 0 %的漂白粉溶液或0 1 %的消毒王溶液喷洒消毒 ,喷洒后关闭门窗 2 4ｈ ,然后打开门窗 ,使空气流通 ,自然干燥。或者采…     

浅谈鹅流感防制

1 新出现鹅的传染病1.1发生情况:自1878年意大利鸡爆发A型禽流感之后,于1956年捷克斯洛伐克和英国学者从鸭中分离到流感病毒。自1956年至九十年代初近四十年中高致病力禽流感大爆发,有1959年的苏格兰(H5N1),1967年的英国(H7N3),1975年的澳大利亚(H7N7),1979年的英国(H5N2),1983年的冰岛(H5N8)和美国(H5N2),1985年的美国(H7N7)和1991年的冰岛(H5N1)8次。九十年代以来,澳大利亚(H7N3和H7N7),巴基斯坦(H7N3),墨西哥(H5N2)和意大利(H7N1)等国家发生高致病力的禽流感。每次大爆发流行对鸡和火鸡养殖业,均造成很大的经济损失。在高…