水稻氮素利用效率相关性状的动态QTL分析

为探讨水稻不同生育时期氮素利用效率的变化动态及遗传机制,以籼稻品种Dasanbye、粳稻品种TR22183及其杂交衍生的166个重组自交系(RILs)群体为材料,对控制水稻氮素利用效率主要性状基因位点(QTL)变化动态进行分析。结果表明,在水稻4个生育时期检测到10个非条件QTL和6个条件QTL,分布在除第1、4、5、6、9号染色体以外的7条染色体上,但没有1个性状能在分析的4个时期都被检测到;氮素吸收总量在最高分蘖期检测到2个非条件QTL,联合变异解释率为15.61%;氮素含量分别在抽穗后15 d和成熟期检测到2个非条件QTLs,变异解释率分别为10.50%、7.93%;干物质产量只在抽穗后15 d检测到1个非条件QTL,变异解释率为6.58%;氮素干物质生理利用效率分别在抽穗后15 d和成熟期检测到5个非条件QTLs,联合变异解释率分别为26.87%、14.73%;控制最高分蘖期至抽穗期后15 d氮素吸收总量的条件QTL有1个;控制抽穗期后25 d至成熟期氮素含量的条件QTL有1个,氮素吸收总量的条件QTLs有2个,氮素干物质生理利用效率的条件QTLs有2个。     

不同发育时期大豆籽粒干物质积累的QTL动态分析

【目的】在不同发育时期,探索影响大豆籽粒干物质积累QTL的加性效应、上位性效应和环境互作效应及其对大豆籽粒干物质积累的影响,可加深大豆育种工作者对产量形成的理解和加速育种进程。【方法】以美国大豆品种Charleston为母本,东农594为父本及二者杂交所得F5所衍生的143个F5:9、F5:10和F5:11重组自交系为研究材料,研究不同发育时期控制大豆籽粒干物质积累的QTL及其遗传效应对大豆籽粒干物质积累的影响。【结果】在不同发育时期检测到与大豆籽粒干物质积累相关的13个加性QTL和14对上位性QTL,其中8个加性QTL和8对上位性QTL存在与环境互作效应。另外,在本研究中仅有加性QTLdmaC2_2能够在6个发育时期都被检测到,而其它加性QTL和14对上位性QTL只能在某个或某些时期被检测到。【结论】在6个不同的发育时期,加性QTL数目、加性QTL能够解释的表型变异呈现"S"型曲线变化,与大豆籽粒干物质重的表现型变化相似,而上位性QTL能够解释的表型变异相对稳定且较小。从效应值上看,加性效应在籽粒发育开始(30d发育时期)较大,从40d发育时期开始降低,在70d发育时期降至最低,在籽粒发育结束时(80d发育时期)略有上升;上位性效应从30d发育时期到70d发育时期一直上升,在籽粒发育结束时(80d发育时期)略有下降;QTL×环境互作效应在6个发育时期均显著地影响大豆籽粒干物质的积累。从连锁群的位置上看,在6个不同的发育时期控制大豆籽粒干物质积累的加性QTL主要集中在C2连锁群(从OPK14_70到satt134区间,即QTLdmaC2_1、dmaC2_2、dmaC2_3所对应的区间),特别是发育初期(30d发育时期);从40d发育时期到籽粒发育结束时(80d发育时期),控制大豆籽粒干物质积累的加性QTL的连锁群位置变化较多,表现为发育时期的选择性。在6个不同的发育时期中,除50d发育时期以外,控制大豆籽粒干物质积累的上位性QTL主要集中在C2连锁群(从OPK14_70到satt202区间,即QTLdmaC2_1所对应的区间)和D1b连锁群(从satt537到sat_135区间,即QTLdmaD1b_1所对应的区间)之间。     

小麦籽粒淀粉积累动态的条件和非条件QTL定位

 【目的】阐明影响小麦籽粒淀粉基因/QTL的时空表达和动态变化情况,为运用条件QTL更好地揭示小麦籽粒淀粉动态积累的基因表达提供参考。【方法】本研究以小麦品种花培3号和豫麦57构建的168个双单倍体（doubled haploid, DH）群体为材料,在6个不同的环境下种植,分别在花后12 d、17 d、22 d、27 d和32 d取样,对小麦籽粒淀粉含量（GSC）积累的条件和非条件QTL进行分析。【结果】在籽粒灌浆的5个时期,一共检测到7个非条件QTL和4个条件QTL,没有一个条件QTL能在测定的5个时期都有效应。7个非条件QTL分别分布在2A、3A、3B、4A、5D染色体上,其中QGsc4A在整个灌浆过程都能表达,5个时期的表型变异贡献率分别为13.57%、16.57%、21.96%、22.53%、22.90%。4个条件QTL中,QGsc4A在花后12 d、17 d、32 d均能检测到,总贡献率为21.80%,对籽粒淀粉积累的净增长量起主要作用。其它非条件QTL和条件QTL只在一个或几个阶段出现且效应值较小,花后27 d没有检测到条件QTL。【结论】控制GSC积累的数量性状基因以一定的时空方式表达,小麦籽粒淀粉积累的QTL动态分析,可以了解小麦籽粒淀粉积累的遗传规律及其对小麦籽粒发育的影响,为小麦产量和品质形成的分子基础的深入研究提供参考。     

重穗型水稻品种物质积累及转运特性研究

为研究重穗型杂交水稻的物质积累及转运特性,以冈优188、菲优188、蓉18优188、金优188、福伊188、川绿优188、成丰优188等生产上广泛应用的所有乐恢188系列重穗型水稻品种为试材,以Ⅱ优838作对照,研究重穗型水稻品种干物质积累、转运与产量的关系。结果表明:乐恢188系列重穗型水稻品种之间在产量性状和物质积累方面具有显著差异,该系列组合穗大粒多,平均穗长25.33 cm,平均穗着粒数205.80粒,平均产量达10.39 t/hm~2,较对照高13.44%,差异均达显著水平;乐恢188系列品种不同生育时期营养器官干物质的积累量和抽穗后穗的干物质量均显著高于对照品种,孕穗后各生育时期营养器官干物质积累量分别较对照高31.40%、14.11%、23.52%、14.79%,抽穗和成熟期穗干重分别较对照高38.31%和19.38%。相关性分析表明,该系列品种营养生长期的物质积累与产量显著正相关,影响乐恢188系列重穗型水稻品种产量的主要因子是灌浆期穗重,因此生产上在注重前期田管的同时,必须加强后期肥水管理,保证灌浆充足。     

利用水、旱稻DH系定位产量性状的QTL及其环境互作分析

 为研究水、旱栽培条件对水稻产量及其构成因素QTL表达的影响，以粳型陆稻IRAT109和粳型水稻越富杂交的116个株系的DH群体为材料，利用已构建的水稻分子连锁图（其中94个RFLP标记和71个SSR标记），在水田、旱田栽培条件下，定位了千粒重、结实率、有效穗数、穗粒数及单株产量等性状的QTL。结果表明，水田条件共检测到11个加性QTL和13对上位性QTL，旱田条件下检测到18个加性QTL和17对上位性QTL，其中控制千粒重的2个加性QTL和1对上位性QTL及控制有效穗数的1个加性QTL在水田、旱田条件下都检测到。 检测到11个控制产量性状QTL区域存在一因多效或紧密连锁,其中3个区域也是控制根系性状QTL的热点区。 发现8个加性QTL和8对上位性QTL对表型变异贡献率（以下简称贡献率）大于10％（其中4个加性QTL和5对上位性QTL为旱田条件下检测到），这些高贡献率QTL特别是旱田条件下的高贡献率QTL对旱稻产量性状分子育种具有一定的指导作用。     

小麦籽粒蛋白质含量的动态QTL定位

 【目的】检测灌浆过程中控制小麦籽粒蛋白质含量（GPC）的条件及非条件QTL,阐明不同时期及不同时段内QTL的表达方式,揭示籽粒蛋白质积累的分子遗传机理。【方法】以花培3号×豫麦57的168个双单倍体（doubled haploid,DH）群体为材料,于6个不同的环境下种植,在籽粒灌浆的5个时期取样,对小麦GPC进行动态QTL分析。【结果】共检测到影响GPC的9个非条件QTL和10个条件QTL。QGpc3A为整个灌浆过程都能表达的非条件QTL,其余条件和非条件QTL只在几个或单独一个时期表达。花后12 d,控制GPC的基因表达活跃,非条件QTL和条件QTL总共能解释表型变异贡献率的42.62%;花后22 d,条件QTL和非条件QTL总共可解释表型变异的贡献率较低,仅为17.43%,GPC降到“低谷”。 QGpc4A-1对GPC前期积累有重要意义,QGpc1D和QGpc4A-2对GPC灌浆中后期积累有重要意义。【结论】GPC呈现出“高-低-高”的变化规律,控制GPC的基因在灌浆过程中以一定的时空方式表达。     

基于X-ray透射成像的稻穗米粒粒型及谷粒饱满度测量

稻穗是水稻产量、干物质积累的最终表现,稻穗米粒粒型和谷粒饱满度对水稻遗传育种及功能基因解析具有重要意义。传统稻穗米粒粒型测量需要经过脱粒、脱壳步骤,不仅过程繁琐而且可能有损伤、可靠性差,而谷粒饱满度测量主要通过水沉法或风选法,无法实现定量测量。为了实现在不脱粒、不脱壳情况下无损观测稻穗内部米粒,提出一种测量稻穗米粒粒型和谷粒饱满度的新方法。采用X-ray透射成像方式获取稻穗射线吸收图,然后采用自动阈值分割、分水岭、图像标记等算法得到单颗米粒标记图像;再采用椭圆检测、边缘提取计算得到米粒的粒长、粒宽、粒面积。对100株稻穗图像做测试,结果表明粒长、粒宽平均测量误差MAPE分别为2.14%、3.45%。同时采用K-means和高斯混合模型聚类（GMM）算法识别出米粒对应的谷粒区域,基于二者面积的比值得到稻穗谷粒饱满度的定量测量结果,基于该结果可以准确识别稻穗中的实粒和瘪粒,为稻穗复杂性状测量研究提供了一种新的有效途径。     

基于高密度遗传图谱的水稻穗长QTL定位与分析

【目的】深入挖掘与穗长相关的新基因，为水稻穗长调控的遗传机理研究及分子育种提供依据。【方法】以2个优良亲本‘ZP37’和‘R8605’及其杂交衍生的208个高世代重组自交系(Recombinant inbred lines,RILs)为作图群体，利用全基因组重测序高密度连锁图谱对3个不同环境下的穗长数量性状座位(Quantitative trait locus,QTL)进行定位，同时分析它们的聚合效应。【结果】共检测到11个穗长QTL，分别分布在第3、4、7、8、9和12号染色体上，其似然函数比对数值(Log of odds,LOD)介于3.07～12.87之间，贡献率在2.17%～10.94%之间，有7个QTL是新位点，其余4个QTL位点与已报道的穗长基因和QTL位置重叠或相近。在2个不同环境下重复检测到4个稳定的QTL位点；对聚合了不同数量穗长QTL株系的分析结果表明，穗长QTL表现出累加效应，QTL数量的增加能显著增加水稻穗长。【结论】本研究结果为水稻穗长QTL的克隆和功能解析奠定坚实的基础，为水稻高产育种提供理论依据和遗传资源。     

利用F_2群体定位水稻谷粒长宽比QTL

以粳稻南粳35和籼稻N22杂交得到的F2群体为研究对象,通过构建遗传连锁图谱,对控制水稻谷粒长宽比的QTL进行定位。谷粒长宽比在F2群体中呈近似的正态分布,表现为数量性状特征;利用Win QTLcart2.5软件共检测到3个控制谷粒长宽比的QTL,分别位于第3、4和5染色体上,单个QTL对表型的贡献率介于4.97%~58.06%,加性效应值介于0.05~0.20,除q LWR-4外,谷粒长宽比增效基因均来自长粒型水稻品种N22,其中q LWR-5对谷粒长宽比表型贡献率最大;基因作用方式表现为超显性、显性和部分显性;此外,利用QTLNetwork2.0软件没有检测到上位性QTL。     

水稻穗颈维管束及产量相关性状的QTL分析

采用2个偏粳品种“光三”／C418的重组自交系群体，构建SSR标记的连锁图谱，并以此对水稻穗颈维管束数和产量相关性状进行了QTL(Quantitative Trait Loci)分析。在第1，5，8和11染色体上检测到4个控制穗颈大维管束数的QTL。在第5，9和10染色体上检测到3个控制穗颈小维管束数的QTL；共检测到产量及8个与产量相关性状的30个QTL。通过分析穗颈维管束数与穗一、二次枝梗数，穗一、二次枝梗粒数，穗粒数，结实率，单株产量QTL在染色体上的分布及连锁关系，表明穗颈维管束是影响产量的重要解剖结构；通过增加穗颈大、小维管束数可望增加水稻“库”的容量。保证“流”的畅通。     

高产粳稻沈农265产量相关性状的QTL分析

利用沈农265/丽江新团黑谷的176个F2 3家系群体构建包含90个SSR标记的连锁图谱,并对穗长、每穗颖花数、每穗实粒数、着粒密度、结实率、有效穗数和千粒重等7个产量相关性状进行QTL分析。结果表明,共检测到15个控制产量性状的QTL,分布在第3、4、6、8、9以及第12染色体上。包括3个控制穗长的QTL;3个控制每穗颖花数的QTL;1个控制每穗实粒数的QTL;2个控制着粒密度的QTL;2个控制结实率的QTL;3个控制千粒重的QTL以及1个控制有效穗数的QTL。其中,主效QTL有4个,分别是qPL9,qSPP4-1,qSD9和qRG12。这些QTL将为水稻分子设计育种提供"元件",同时为阐明水稻产量相关性状分子机制提供基础信息。     

氮素高效吸收型粳稻品种物质生产与分配的基本特征研究

[目的]明确氮素高效吸收型粳稻品种物质生产与分配的特点及影响粳稻品种氮素吸收的主要物质生产因素,以期为粳稻品种氮素高效吸收利用的遗传改良提供参考依据。[方法]2008～2009年,在群体水培条件下,以国内外不同年代育成的94个常规粳稻品种为供试材料,测定植株各器官干物重和含氮率、产量等,采用组内最小平方和的动态聚类方法将供试品种按吸氮量的大小从低到高依次分为A、B、C、D、E、F 6类,研究不同氮素吸收型粳稻品种物质生产与分配的差异。[结果]供试品种间吸氮量的差异很大。氮素高效吸收型粳稻品种平均产量极显著高于氮素低效吸收型品种;氮素高效吸收型粳稻品种各生育阶段群体及单穗干物质生产量大,根干重、茎鞘叶干重、穗干重也显著大于氮素低效吸收型品种,但经济系数无明显差异;成熟期群体干物质生产量对总吸氮量的作用大于经济系数的作用;抽穗前物质生产量、抽穗后物质生产量对成熟期物质生产量均有重要的作用,前者略大于后者;单穗干物质生产量对群体干物质生产量的作用大于单位面积穗数的作用,抽穗前更明显;提高抽穗前后茎鞘叶干重和成熟期穗干重有利于成熟期干物质生产量提高。[结论]促进单穗干物质生产量尤其是抽穗前单穗干物质生产量,促进抽穗前后茎鞘叶干重和抽穗后穗干重的提高可显著提高氮高效吸收型品种成熟期群体物质生产量。     

水稻产量性状杂种优势的QTL定位

 【目的】利用QTL定位方法检测水稻产量性状杂种优势QTL,并解释杂种优势产生的可能分子机理。【方法】利用重组自交系与亲本协青早B构建BC1杂种群体,通过两地重复试验,以中亲优势考察6个产量性状的杂种优势表型,利用Windows QTL Cartographer 2.5的复合区间作图法检测其QTL。【结果】多数产量性状均表现出较强的杂种优势。在两地试验中,共检测到20个产量性状杂种优势QTL,分布在水稻第2、3、6、7、8、10等6条染色体上,包括3个控制单株产量杂种优势的QTL、2个控制单株穗数杂种优势的QTL、6个控制每穗总粒数杂种优势的QTL、4个控制每穗实粒数杂种优势的QTL、4个控制结实率杂种优势的QTL和1个控制千粒重杂种优势的QTL。单个QTL对群体性状表型变异的贡献率为4.90%—12.85%。【结论】检测到控制6个产量性状杂种优势的20个QTL,其中qHNP-3、qHTNSP-7、qHNFGP-7、qHSF-7、qHTGWT-3 5个QTL在两地试验中稳定表达;检测到的20个杂种优势QTL中,有13个与在RIL群体中检测到的QTL重叠,重叠率达65%,因此,认为来自纯系的产量性状加性效应对杂种优势产生具有重要贡献。     

野生稻渗入系苗期耐铝QTL定位分析(英文)

本研究以元江普通野生稻与优良栽培稻亲本特青配制的野生稻染色体片段代换系为材料,在幼苗生长阶段,利用室内、室外株高、干重抑制率的表型数据检测与耐铝相关的QTL,分别检测到11、18、14和5个与耐铝相关的QTL,分布于不同的染色体上,室内、室外株高抑制率的表型数据检测结果表明,位于第8染色体RM38附近和第12染色体RM277附近贡献率较大,分别为12%和11%,分析是主效QTL。室内、室外干重抑制率的表型数据检测到的最大QTL的贡献率分别只有9%和8%,未检测到主效QTL。重复检测到的QTL分布于第7、8、9、11和12染色体上。第8染色体上有2个QTL,其中RM310附近的QTL被三次重复检测到,其余的被检测到二次,分析这些QTL是稳定的QTL。     

氮肥对不同穗型水稻产量及干物质积累与分配的影响

选用典型的直立穗型水稻品种沈农265和半直立穗型水稻品种辽粳294为试材,通过田间试验研究氮肥对不同穗型水稻产量和干物质积累与分配的影响。结果表明,当氮肥施用量较低时,半直立穗型辽粳294的产量高于直立穗型沈农265,而高氮条件下的结果则相反。抽穗至收获阶段直立穗型沈农265的干物质积累量高于半直立穗型辽粳294,而在分蘖至抽穗阶段的结果则相反。增施氮肥可以提高水稻干物质的最大累积速率,使干物质最大累积速率及快速累积速率出现时间提前。与半直立穗型辽粳294相比,直立穗型沈农265的干物质最大累积速率小,最大累积速率出现时间及快速累积速率起止时间较迟。     

QTL Mapping and Epistasis Analysis for Yield Traits in an RIL Population of Rice (Oryza sativa L.)

A genetic linkage map consisting of 168 DNA markers was constructed based on a recombinant inbred line (RIL) population derived from a cross between a high yielding indica variety, Zhong156, and a low yielding indica variety, Gumei2. The markers on the linkage map were distributed on all 12 chromosomes and covered 1 447.9 cM of the genome. The parents and 304 RILs were grown in China National Rice Research Institute (CNRRI), Hangzhou, China, in 2001, over two seasons in a randomized block design. The statistic software of QTL Mapper 1.01 was applied to detect quantitative trait loci (QTLs) and additive by environment (AE) interactions for yield traits, including panicle length, number of panicles per plant, number of spikelets per panicle, number of filled grains per panicle, fertility and kilo-grain weight. A total of 30QTLs with significant additive effects located on all chromosomes, except chromosomes 5 and 9, and two QTLs with significant AE interactions, were detected. Thirty-one interactions of QTLs showing significant additive by additive epistatic effects for yield traits were also detected. Genetic contributions were generally lower for QTLs showing epistatic effects compared with QTLs showing additive effects. No significant interactions between epistasis and environment were detected.     

水稻第6染色体短臂产量性状QTL簇的分解

【目的】将水稻第6染色体短臂上产量性状QTL分解到更小的区间中。【方法】从珍汕97B/密阳46重组自交系群体筛选到针对第6染色体短臂RM587-RM19784区间的剩余杂合体,衍生了一个由221个株系组成的F2:3群体,种植于海南和浙江两地,考察每株穗数、每穗实粒数、每穗总粒数、千粒重、结实率和单株产量,建立SSR标记连锁图,应用Windows QTL Cartographer 2.5检测QTL。【结果】在所分析的6个性状中,除穗数外在第6染色体短臂上的目标区间均检测到QTL,分别座落于目标区域中3个以上的不同区间中,单个QTL对群体性状表型变异的贡献率为6.3%～35.2%;控制产量构成因子的QTL基本以加性作用为主,但3个单株产量QTL的显性度分别为1.65、0.84和0.42。【结论】目标区间存在3个以上的产量性状QTL,且同一区间控制不同性状的QTL、不同区间控制同一个性状的QTL在遗传作用模式、效应方向和效应大小上存在一定差异。     

水稻耐盐性和耐碱性相关性状的QTL定位及环境互作分析

【目的】探索水稻在盐和碱胁迫下产量相关性状的变化规律,寻找耐盐碱主效QTL,并分析QTL加性、上位性与环境互作效应。揭示单株有效穗数、结实率、千粒重和单株穗重在盐、碱胁迫下的遗传机制,为水稻耐盐碱性分子标记辅助育种提供理论依据。【方法】以东农425和长白10号杂交得到的重组自交系为材料,构建包含120个SSR标记的遗传连锁图。以浓度6 ds·m-1的Na Cl水溶液,pH9.0的Na2CO3水溶液进行全生育期处理,正常水灌溉为对照。对2014年和2015年盐、碱胁迫和自然条件下水稻的单株有效穗数、结实率、千粒重和单株穗重分别采用2种作图方法同时定位研究,即完备区间作图法进行加性QTL定位和混合线性模型的复合区间作图法进行加性、上位性QTL与环境互作联合分析。【结果】2014年和2015年碱胁迫条件下与盐胁迫条件下各性状表型值相比,耐碱相关性状降低较明显,表明水稻对碱胁迫更为敏感,碱胁迫更大程度地限制了高产和稳产。并且2年的碱胁迫条件下各性状与盐胁迫条件下各性状均未表现出显著相关性。水稻在耐盐性和耐碱性上可能存在遗传机制上的差异。运用ICIM共检测到61个水稻耐盐碱相关性状加性效应QTL,分布在第1、2、3、4、5、6、7、8、10、11和12染色体上。运用MCIM在6个环境下进行加性及环境互作效应的联合定位分析,共检测到17个加性QTL存在环境互作效应,分布在第1、3、5、7、8、9、11和12染色体上。其中,运用ICIM同时在自然条件和盐胁迫条件下2年重复检测到q PN1-1,仅在碱胁迫下2年重复检测到q PN11-2,同时在盐胁迫和碱胁迫条件下2年重复检测到q PN3-3,在盐胁迫与自然条件比值下2年重复检测到q RPN1-1,仅在自然条件下2年重复检测到q GW7和同时在盐、碱胁迫和自然条件下2年重复检测到q PW11均被MCIM检测到。q PW11是1个新的耐盐碱QTL,其贡献率为7.94%—20.13%。运用MCIM对水稻耐盐碱相关性状在6个环境下进行上位性与环境互作效应分析,共检测到13对上位性QTL与环境发生互作效应。检测到2对有关单株有效穗数的上位性QTL与环境互作,检测到2对胁迫与自然条件比值下单株有效穗数的上位性QTL与环境互作;检测到2对有关结实率的上位性QTL与环境互作,检测到2对胁迫与自然条件比值下结实率的上位性QTL与环境互作;检测到1对有关千粒重的上位性QTL与环境互作,检测到1对胁迫与自然条件比值下千粒重的上位性QTL与环境互作;检测到3对有关单株穗重的上位性QTL与环境互作。【结论】盐胁迫和碱胁迫都能影响水稻的产量相关性状,但二者是性质有所差别的2种胁迫,碱胁迫破坏更强,降低产量更明显。     

Dissection of QTLs for Yield Traits on the Short Arm of Rice Chromosome 6

This study was undertaken to dissect quantitative trait loci （QTLs） controlling yield traits on the short arm of rice chromosome 6. A residual heterozygous line that carries a heterozygous segment extending from RM587 to RM19784 on the short arm of rice chromosome 6 was selected from an F7 population of the indica rice cross Zhenshan 97B/Milyang 46. An F2：3 population consisting of 221 lines was derived and grown in two trial sites. Six yield traits including number of panicles per plant, number of filled grains per panicle, total number of spikelets per panicle, spikelet fertility, 1 000-grain weight, and grain yield per plant were measured. An SSR marker linkage map was constructed and employed to determine QTLs for yield traits with Windows QTL Cartographer 2.5. QTLs were detected in the target interval for all the traits analyzed except NP, with phenotypic variance explained by a single QTL ranging between 6.3% and 35.2%. Most of the QTLs for yield components acted as additive QTLs, while the three QTLs for grain yield had dominance degrees of 1.65, 0.84, and -0.42, respectively. It was indicated that three or more QTLs for yield traits were located in the target region. The genetic action mode, the direction of the QTL effect, and the magnitude of the QTL effect varied among different QTLs for a given trait, and among QTLs for different traits that were located in the same interval.