米象GST基因的表达及其对磷化氢的应答

分析米象代谢解毒相关基因谷胱甘肽硫转移酶(GST)的表达,获得米象基因遗传信息,进而从本质上全面揭示米象的磷化氢抗性。米象敏感品系经磷化氢不同浓度熏蒸和不同时间熏蒸处理,2个基因经LC_(30)浓度磷化氢熏蒸的相对表达量显著高于其他2个浓度;4个GSTs基因经LC_(50)浓度磷化氢熏蒸的相对表达量显著高于对照组和LC_(30)、LC_(10)处理组;3个基因相对表达量均显著低于对照组。7个GSTs基因随着熏蒸时间的增加,相对表达量逐渐升高。米象GSTs基因在不同发育阶段的相对表达模式中,SoGSTd1基因在四龄幼虫阶段的相对表达量最高;SoGSTe1基因在成虫阶段的相对表达量最高;SoGSTe2和SoGSTe5基因在四龄幼虫阶段的相对表达量最大,SoGSTe6基的相对表达量在三龄幼虫阶段最大。米象13个GSTs基因在不同组织部位的相对表达模式中。米象13个GSTs基因中的11个在中肠、脂肪体或马氏管中的相对表达量均显著高于头部和表皮中的表达量。     

表皮蛋白基因TcCP14.6和TcLCPA3A参与介导赤拟谷盗对磷化氢的抗性形成

【目的】 表皮蛋白是昆虫表皮重要的结构物质,大量研究已经证实表皮蛋白基因参与介导昆虫抗药性形成。以赤拟谷盗（Tribolium castaneum）为研究对象,解析表皮蛋白基因TcCP14.6（cuticle protein CP14.6）和TcLCPA3A（larval cuticle protein A3A）在昆虫磷化氢抗性形成过程中的作用。【方法】 采用联合国粮农组织（FAO）推荐的磷化氢熏蒸方法对采自5个省份赤拟谷盗的磷化氢抗性水平进行测定。基于赤拟谷盗基因组数据获得TcCP14.6和TcLCPA3A的cDNA序列,利用在线生物信息学分析软件预测其编码的氨基酸序列、信号肽和保守结构域。分别提取赤拟谷盗不同组织（头、胸、腹的表皮、翅、足、肠道、马氏管和脂肪体）、不同磷化氢抗性水平以及磷化氢胁迫后试虫的总RNA。以TcRPS和TcRPL为内参基因,运用RT-qPCR技术分析TcCP14.6和TcLCPA3A在赤拟谷盗不同组织、不同磷化氢抗性水平和药剂胁迫下的表达模式。最后,通过RNA干扰技术结合生物测定方法分析TcCP14.6和TcLCPA3A与赤拟谷盗磷化氢抗性的关系。【结果】 生物测定结果表明,江苏（JS,RR=1.7）和云南（YN,RR=3.0）种群对磷化氢保持敏感,湖南种群（HN,RR=20.2）表现为中等抗性,四川（SC,RR=395.4）和广东（GD, RR=862.7）种群表现为极高抗。序列分析结果表明TcCP14.6和TcLCPA3A蛋白均包含信号肽和保守的几丁质结合域。RT-qPCR结果显示,TcCP14.6和TcLCPA3A均在赤拟谷盗表皮组织中高表达,而在内部器官（脂肪体、肠道、马氏管）中的表达量相对较低。此外,TcCP14.6表达量随磷化氢抗性水平的增加呈上调趋势,而TcLCPA3A表达量则呈下降趋势;赤拟谷盗经磷化氢熏蒸处理6 h,TcCP14.6和TcLCPA3A的表达量分别呈现上调和下调趋势。注射dsRNA分别干扰抗性（GD）和敏感（YN）种群两个基因的表达后再用LC₃₀的磷化氢浓度处理试虫。与对照相比,TcCP14.6基因沉默后赤拟谷盗的死亡率显著升高,而TcLCPA3A基因沉默后试虫死亡率显著下降。【结论】 表皮蛋白基因TcCP14.6和TcLCPA3A参与介导赤拟谷盗对磷化氢的抗性。     

百脉根谷胱甘肽硫转移酶基因的载体构建与检测

[目的]探讨百脉根谷胱甘肽硫转移酶基因（LcGST）的作用。[方法]通过DNA重组技术将LcGST与中间表达载体pGN连接。[结果]成功构建了植物表达载体pGN-LcGST。[结论]pGN-LcGST载体的获得为进一步研究其在异源植物中的功能奠定了基础。     

大黑鳃金龟消化与解毒相关基因的组织表达研究

[目的]明确大黑鳃金龟幼虫消化酶和解毒相关基因在不同组织中的表达情况,筛选中肠特异表达基因。[方法]利用RT-PCR方法对大黑鳃金龟幼虫中肠消化酶(胰蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶)基因和解毒相关基因(细胞色素P450、谷胱甘肽S-转移酶、酯酶)在不同组织中的表达进行分析。[结果]所调查的大黑鳃金龟的6个谷胱甘肽S-转移酶在中肠中都有表达,有3个基因在中肠中特异性表达。细胞色素P450家族中CYP 6A20和CYP 4C1 2个基因在中肠中特异表达,3个氨肽酶基因(APN1、APN2和AP2)只在中肠中表达。[结论]大部分大黑鳃金龟的消化酶和解毒酶基因在中肠中表达量最高。     

铝毒胁迫下大豆ALMT和MATE基因的特异性表达

[目的]从转录水平揭示ALMT和MATE基因在大豆耐铝中的作用,为遗传改良获得抗性种质提供依据。[方法]对2个大豆品种进行Al处理,取胁迫后6 h(短期)、2 d(中期)和12 d(长期)的根尖提取RNA,采用qRT-PCR检测耐铝相关基因的时空表达。[结果]以MTP和UBC2为内参时,ALMT基因在铝处理2 d后的BX10中表达量与对照相比变化最大,在BD2中处理12 d后的表达量最大;当使用不同的内参校准时,MATE在同一个品种中的表达量存在差异,且在同一品种处理的3个时间点的变化趋势也不一致。[结论]不同的内参基因进行校准时,基因的表达量不同,使用2个或2个以上的内参基因进行校正能够提高结果的准确性,基因的表达变化为研究植物耐铝机制提供理论基础。     

烟草的TMV侵染耐受性与谷胱甘肽代谢途径的关系

为了深入了解烟草对烟草花叶病毒(TMV)的抗性机制,以耐受TMV感染品种豫烟8号和具有相同遗传背景对花叶病敏感的品种NC89为材料,通过对高通量测序获得的转录组数据进行生物信息学分析发现,二者接种TMV后的差异表达基因富集通路中共同存在谷胱甘肽代谢途径,且耐受性品种豫烟8号中该途径有增强的趋势。采用荧光定量PCR和分光光度法检测了两品种接种TMV前后谷胱甘肽代谢途径中关键酶谷胱甘肽S转移酶(GST)基因表达水平、酶活性以及谷胱甘肽(GSH)含量的变化。结果表明,接种TMV后两品种中GST基因表达水平升高,GST酶活性增强,GSH含量升高,耐受性品种豫烟8号增幅更明显。通过硫元素的丰缺试验研究了接种TMV对GST基因及与TMV侵染耐受性相关基因表达水平的影响,结果显示,+S和-S处理中两品种接种病毒后这些基因的表达趋势一致,-S处理的表达量低于+S处理。GST、PR1-a、HSP90和Catalase-3这些抗病相关基因都呈上调表达,其中豫烟8号接种后的表达量均高于NC89;而Psb A和PhotosystemⅡ10 k Da polypeptide 2个涉及光合作用的基因均呈现下调表达,但是接种后豫烟8号的下调幅度小于NC89。以上表明,在耐受TMV感染的品种中,谷胱甘肽代谢增强对细胞环境的氧化还原平衡有一定的促进作用,使光系统Ⅱ中的关键成分D1蛋白基因Psb A的表达相对稳定,从而减轻光合系统的破坏程度。     

水稻C24-甾醇甲基转移酶基因OsSMT2的生物信息学分析

[目的]为水稻C-24甾醇甲基转移酶基因OsSMT2的进一步研究提供理论参考。[方法]以水稻OsSMT2基因为研究对象,通过生物信息学分析方法,对OsSMT2蛋白质的理化性质、结构特点、共表达基因的富集、启动子的顺式作用元件及表达模式等进行分析。[结果]水稻OsSMT2基因CDS全长1092 bp,编码1个含363个氨基酸的蛋白质,该蛋白质具有甲基转移酶结构域和甾醇甲基转移酶C末端结构域;OsSMT2蛋白质不含信号肽,存在1个跨膜结构域;OsSMT2基因的共表达基因主要富集到DNA的复制过程和次生代谢物的生物合成等途径中,可能参与植物的抗寒和抗旱过程;OsSMT2基因在萌发种子中的表达量最高,在叶片的表达量最低。[结论]水稻OsSMT2基因主要在萌发的种子、胚根、胚芽中高表达,参与水稻DNA复制和细胞分裂的主要过程,可作为水稻抗寒和抗旱育种的候选基因。     

柽柳ThGSTT1基因的抗旱耐盐表达分析

[目的]研究柽柳ThGSTT1基因的抗旱耐盐表达.[方法]通过对柽柳7个转录组分析,克隆获得一条谷胱甘肽转移酶基因,通过Blast比对及进化分析其结构,并采用qPCR分析基因的抗旱耐盐表达.[结果]该基因为谷胱甘肽Theta家族基因,因此命名为ThGSTT1基因;该基因编码的蛋白氨基酸残基数为231,分子量为26.1 kDa,理论等电点为7.14.表达谱分析显示,ThGSTT1在柽柳根和叶中的表达不同,具有一定的组织表达特异性.qPCR分析结果表明,盐胁迫明显诱导了ThGSTT1基因的表达,叶中胁迫7d表达量为对照的7.48倍,根中胁迫9d时最大.PEG胁迫下ThGSTT1基因的表达明显受抑制,根中胁迫第3天的表达仅为对照的23.7％,而叶中胁迫第5d表达量最低,为对照的12.7％.[结论]谷胱甘肽转移酶是一种重要的抗逆保护酶类,进行抗旱耐盐表达分析具有重要意义.     

转GhGST基因的棉花植株的获得

谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)受黄萎病菌诱导表达,对黄萎病具有抗性。为明确该基因在棉花中抗黄萎病功能,本研究在前期工作基础上,以陆地棉Coker312为受体,利用农杆菌介导的茎尖转化法对GhGST基因进行遗传转化,共获得132株卡那霉素抗性植株,利用PCR检测以及胶回收测序进一步确定了11株稳定的转基因阳性棉植株。转基因植株的获得为后续GhGST基因功能研究及棉花新品种培育提供了基础材料。     

硫酰氟在仓储害虫防治中的应用研究

[目的]研究硫酰氟对贮烟害虫的熏杀效果。[方法]设置4个试验仓间,每个仓间均设置上中下3个浓度检测点。熏蒸过程前期每2h检查一次,共检查11次。[结果]硫酰氟熏蒸防治烟草害虫的研究表明,硫酰氟整仓熏蒸22h后,仓问设置的3个浓度监测点的浓度基本一致;均能达到对烟草甲成虫100％的杀灭效果。[结论]为进一步推广应用提供相关依据。     

水稻VDAC3蛋白的可溶性外源表达及纯化

[目的]获得外源表达的可溶性水稻VDAC3蛋白.[方法]将osvdac3基因克隆到含有GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体中,转化入BL21表达菌株,经IPTG诱导,并使用SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物,通过Glutathione Resin亲和层析系统纯化获得较纯的目的蛋白.[结果]试验成功构建了pGEX-4T-1-osvdac3原核表达载体并转化大肠杆菌.通过SDS-PAGE和Western Blot试验证实56 kD处的蛋白条带是具有可溶性表达的VDAC3蛋白.[结论]经Glutathione Resin亲和层析系统纯化得到可溶性带GST标签的VDAC3蛋白.该研究结果为水稻VDAC蛋白的功能研究进一步奠定了基础.     

棉花抗低温生理指标和分子标记鉴定体系研究

[目的]研究低温胁迫下棉花生理生化指标,筛选确定棉花抗低温的特异分子标记引物.[方法]通过对30份农艺性状优良、抗低温程度不同的棉花材料在室内进行24 h 3℃低温胁迫处理,测定胁迫前后7项生理生化指标;从Genbank中调出与抗低温相关的基因片段,利用生物软件Oligo6.0处理并设计引物,筛选出与棉花抗低温基因序列相关分子标记的特异引物.[结果]建立与棉花抗低温相关生理生化鉴定指标3项,开发了与棉花抗低温相关的特异分子标记2对,筛选出抗低温材料5份.[结论]建立了棉花抗低温生理生化指标与特异引物分子标记相结合的鉴定体系.     

全基因组范围葡萄热休克转录因子的鉴定与分析

[目的]从全基因组范围鉴定葡萄热休克转录因子基因家族,并对其基因结构、蛋白结构、基因启动子、基因在进化中受到的选择压力以及其编码基因在非生物胁迫下的表达变化进行综合分析,并对葡萄热休克转录因子基因家族的密码子使用偏好性进行研究,分析影响葡萄热休克转录因子基因家族密码子使用偏好性的因素。[方法]利用葡萄基因组数据库相关数据建库结合本地BLAST法鉴定序列,利用多重序列比对,进化树构建等生物信息学方法进行分析。[结果]鉴定了20个葡萄热休克转录因子,并将其分为4个亚组。其中9个热休克转录因子基因在冷胁迫1 h下表达上调,2个在冷胁迫4 h下表达上调。在高温胁迫14 d条件下,7个热休克转录因子基因表达量下调。在高温胁迫42 d条件下,8个热休克转录因子基因表达量下调。此外发现,葡萄热休克转录因子家族各成员基因存在密码子使用偏好性。[结论]该研究为深入研究葡萄热休克转录因子的功能提供了有用的信息。     

茉莉酸甲酯诱导的小麦白粉病抗性与9个抗病相关基因表达间的关系

[目的]为了明确茉莉酸对小麦白粉病抗性的诱导作用和对抗病相关基因的激活作用,以及抗病性变化与基因表达变化之间的相关性,探索小麦抗白粉病分子机理。[方法]以田间表现不同的代表性感白粉病小麦品种＂中国春＂、＂濮麦9号＂和＂周麦18＂为材料,用茉莉酸甲酯（methyljasmonate,MeJA）处理小麦幼苗叶片进行诱导,通过离体叶段培养法接种白粉菌（Blumeria graminis f.sp.tritici,Bgt）进行抗性鉴定;用实时定量PCR技术检测叶片中PR1（PR1.1）、PR2（β,1-3葡聚糖苷酶）、PR3（几丁质酶）、PR4、PR5（类甜蛋白）、PR9（TaPERO,过氧化物酶）、PR10、TaGLP2a（类胚素蛋白）和Ta-JA2（茉莉酸甲酯诱导蛋白）基因的表达变化。[结果]MeJA处理可以显著提高＂中国春＂、＂濮麦9号＂和＂周麦18＂对白粉菌的抗性水平。诱导抗性可以从MeJA处理后12～96h检测到,24h达到峰值。虽然存在一定差异,但MeJA对3个品种中除TaGLP2a外的8个抗病相关基因的表达有显著激活作用,在处理12、24或48h后达到峰值。MeJA对PR9和PR1的诱导作用最强,可达100倍,对PR2、PR4、PR5、PR3、PR10和Ta-JA2的诱导作用强,可达10-70倍;对TaGLP2a没有明显作用。茉莉酸诱导的抗病性提高与8个抗病相关基因的表达增强呈正相关。[结论]茉莉酸诱导的抗病性增强与抗病相关基因的表达增强呈正相关,茉莉酸信号传导途径在小麦抗白粉病反应中起作用,对这一途径的调控可提高小麦的白粉病抗性。     

水稻3型金属硫蛋白基因的分离和表达研究

[目的]对从水稻幼苗中分离的2个3型金属硫蛋白基因OsMT-I-3a和OsMT-I-36的结构进行了分析,并对其表达模式进行了检测。[方法]利用Blast搜索水稻数据库,设计引物并利用RT—PCR的方法克隆OsMT-I-3基因cDNA全长。通过多重比对等方法对其基因和蛋白结构进行了分析。利用Northem杂交对这两个基因的组织表达模式和环境应答模式进行了检测。[结果]OsMT-I-3a和OsMT-I-3b分别编码62和65个氨基酸的多肽,具有典型的3型金属硫蛋白的半胱氨酸分布模式。OsMT-I-3a基因在叶片中没有检测到表达,OsMT-I-3b在叶片中高表达,且各种非生物胁迫因素会影响两种基因的表达模式。[结论]I类3型2个水稻MT基因可能参与水稻多种环境胁迫的信号通路,在水稻抗非生物胁迫过程中起作用。     

杨树HSF家族基因生物信息学与胁迫应答表达分析

  目的  探究小黑杨热激转录因子HSF在应答高温和高盐胁迫时发挥的关键作用。保守结构域和顺式作用元件预测等对杨树HSF转录因子家族基因进行生物信息学分析。本研究以小黑杨为材料,经过37 ℃高温胁迫半个月后观察其形态变化;将小黑杨在37 ℃下分别处理0、12、24、48 h,采用RT-qPCR对小黑杨组织中的PsnHSFs基因进行时空表达分析;将小黑杨于150 mmol/L NaCl胁迫分别处理0、24 h,通过RNA-seq分析PsnHSFs基因的相对表达量变化,并通过RT-qPCR进行验证。  结果  通过结构特征和系统发育比较将29个HSF转录因子家族基因分成A、B和C三个亚家族,各亚家族分别包含18、10和1个HSF基因;HSF编码的氨基酸序列长度介于209 ~ 595之间,均为亲水性蛋白;其N端具有高度保守的DBD结构域,由三个保守基序构成;HSF基因启动子序列中包含DRE core、ABRE和TC-rich等多种顺式作用元件。小黑杨经37 ℃高温处理后其株高仅为对照的76.51%,叶片呈卷曲状,叶表面粗糙,叶面积显著减小且苗干多侧枝柔软无韧性。RT-qPCR与RNA-seq结果表明,PsnHSFs被高温、高盐胁迫诱导表达。高温处理后其株高仅为对照的76.51%,叶片呈卷曲状,叶表面粗糙,叶面积显著减小且苗干多侧枝柔软无韧性。RT-qPCR与RNA-seq结果表明,PsnHSFs被高温、高盐胁迫诱导表达。家族基因以及揭示HSF参与木本植物胁迫应答的分子机制调控具有参考意义。      

干旱胁迫下早熟禾幼苗几种抗旱性指标的变化

［目的］探明干旱胁迫下早熟禾幼苗几种抗旱指标的变化规律。［方法］在干旱胁迫期间对早熟禾幼苗植株体内过氧化物酶活性、脯氨酸含量、丙二醛（MDA）含量的变化进行了研究。［结果］在干旱胁迫后期,早熟禾幼苗植株体内过氧化物酶活性、脯氨酸含量均有较高水平增加,有利于其抵抗干旱胁迫。在土壤含水量未达到5.4%前,MDA的含量无显著差异（P＞0.05）,膜伤害较小;但当土壤含水量降到5.4%时,MDA的含量显著上升。［结论］当土壤含水量降到5.4%时,膜结构遭到破坏,抗逆性下降,是导致早熟禾幼苗干旱死亡的主要原因。     

玉米转ABP9和ZmCBF3双基因植株的获得

[目的]获得转双基因的植株,研究植物逆境诱导基因ABP9和ZmCBF3的协同表达对玉米抗逆性的影响.[方法]通过农杆菌侵染的方法将ABP9和ZmCBF3基因同时转入玉米中,并对T0代植株进行分子鉴定.使用含有ABP9启动子驱动ABP9和ZmCBF3双基因载体的农杆菌侵染玉米幼穗,获得T0代种子;在田间通过对玉米苗喷洒草铵膦除草剂筛选获得具有草铵膦抗性的玉米植株.[结果]挑选10株抗性玉米苗小量提取DNA并进行PCR扩增分析,其中5个植株出现特异条带;大量提取PCR阳性玉米的DNA进行Southem杂交分析,9TQ-5号植株在与bar探针和ABP9探针杂交时均出现特异条带.[结论]9TQ-5号植株为转基因阳性植株,为后续试验提供了材料.     

月季RcLEA基因表达提高大肠杆菌对非生物胁迫耐性

[目的]研究RcLEA基因在月季品种中热诱导表达模式及RcLEA基因对多种非生物胁迫耐性。[方法]将耐热和不耐热月季品种进行38℃/3h热激处理,研究RcLEA基因在月季品种的热诱导表达模式;为验证月季RcLEA基因功能,将其转化E.coliBL21,将重组菌株BL21分别置于4、50℃及LiCl、NaCl、Na2CO3、CdCl2、H2O2胁迫下,研究重组菌株对高温、低温及非生物胁迫的响应。[结果]38℃/3h热激处理后,该基因在耐热月季品种‘曼海姆宫殿’（Schloss mannieim,SM）、‘赌城’（Lasvegas,LV）中强表达,而在不耐热品种‘新十全’（Kordes Perfecta,KP）弱表达或不表达,表明该基因与月季耐热性关系密切。重组菌株提高了对高温、低温、重金属、高盐、高pH值、氧化等非生物胁迫的耐性,表明RcLEA参与了上述非生物胁迫的响应。[结论]该研究为后续该基因导入不耐热月季品种提高月季耐热品质及其机理研究提供了思路,也为月季等园林观赏植物的耐热品种筛选提供了理论支持。