兼抗全蚀病和白粉病小麦新种质的创制与鉴定

TaLTP5是从小麦中分离到的一个脂质转移蛋白编码基因。利用基因枪介导法将TaLTP5表达载体pA25-TaLTP5转入抗白粉病的小麦品种扬麦18 (含抗白粉病基因Pm21)中, 旨在选育兼抗全蚀病和白粉病的小麦新种质。对转基因小麦T₀~T₃代植株中引入TaLTP5基因进行分子检测和抗病性鉴定。PCR检测、Southern杂交分析结果表明, 外源TaLTP5基因已转入、整合到3个转基因小麦株系的基因组中, 并能稳定遗传; 荧光定量RT-PCR的分析以及全蚀病菌的接种与鉴定结果表明, 与受体小麦扬麦18相比, 这3个转基因小麦株系中TaLTP5表达量显著提高, 其对全蚀病的抗性也明显增强。对3个转基因株系的Pm21分子标记和白粉病抗性鉴定表明, 外源TaLTP5基因的导入没有影响受体小麦对白粉病抗性, 说明这些转基因株系为兼抗全蚀病和白粉病小麦新种质。     

抗全蚀病、根腐病的转PgPGIP1基因小麦的获得与鉴定

全蚀病和根腐病是小麦(Triticum aestivum)重要的土传真菌病害。PgPGIP1是人参(Panax ginseng)的一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白,可以抑制部分病原真菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶的活性。本研究人工合成了PgPGIP1基因,并构建PgPGIP1基因的单子叶植物表达载体pA25-PgPGIP1,通过基因枪介导法将其转入小麦品种扬麦18中。对转PgPGIP1基因的T₀至T₄代植株进行PCR、RT-PCR和Q-RT-PCR分析,并对其全蚀病和根腐病抗性进行鉴定。结果表明,PgPGIP1基因能够在4个转基因小麦株系中遗传、转录与表达。与未转基因的小麦扬麦18相比,4个转基因小麦株系对全蚀病与根腐病的抗性明显提高,说明PgPGIP1表达增强了转基因小麦对全蚀病与根腐病的抗性。     

BvGLP1过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性

类萌发素蛋白(germin-like protein, GLP)是一类含有cupins结构域的糖蛋白, 在植物基础抗性等方面起着重要作用。本研究人工合成了甜菜GLP基因BvGLP1, 并利用基因重组技术构建了受韧皮部特异表达启动子RSS1P驱动的BvGLP1基因单子叶植物表达载体pA20-RSS1P::BvGLP1。通过基因枪介导法将其转入小麦品种扬麦18中, 对转基因扬麦18的T₀至T₃代植株中BvGLP1进行了PCR、半定量RT-PCR和荧光定量QPCR检测, 并对转基因小麦进行根腐病和纹枯病抗性鉴定。结果表明, BvGLP1已转入转基因小麦扬麦18, 并能在转基因小麦中遗传、转录表达; 5个转BvGLP1基因小麦株系的根腐病抗性比受体品种扬麦18有显著提高, 说明BvGLP1过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性。     

抗纹枯病、根腐病的转SN1基因小麦的获得与鉴定

SN1是源于马铃薯的一种抗菌肽, 可以抑制多种植物病原菌的生长。小麦纹枯病(主要病原菌为禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis)和根腐病(主要病原菌为平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana)是小麦的主要土传真菌病害。本研究利用基因工程技术构建了SN1基因的单子叶植物表达载体pA25-SN1, 它受玉米泛素(ubiquitin)启动子的控制;采用基因枪法将pA25-SN1转化小麦推广品种扬麦18幼胚愈伤组织4 000块, 获得203株再生植株, 通过PCR检测出阳性植株55株, 转化率为1.38%。对转SN1基因小麦T₀~T₂代植株, 进行外源基因的PCR、Southern blot、RT-PCR、荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析和小麦纹枯病菌与根腐病菌接种及其抗病性鉴定。结果表明, 转入的SN1基因已经整合到转基因小麦的基因组中, 能够在转基因小麦中遗传、转录与表达。SN1基因的表达提高了转基因植株对小麦纹枯病和根腐病的抗性, 其抗病性可以遗传。     

过表达TaPK-R1基因增强了小麦对纹枯病的抗性和耐冻性

小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)和倒春寒是小麦生产中重要的生物和非生物胁迫因子,本研究目的是利用转基因技术改良小麦的纹枯病抗性和耐冷性。利用构建的转基因载体pAHC25-MYC-TaPK-R1,通过基因枪介导法,将小麦AGC蛋白激酶基因TaPK-R1导入春小麦品种扬麦20,获得TaPK-R1过表达的转基因小麦。对T1至T4代植株进行PCR、RT-PCR、qRT-PCR、Western blot分析,筛选到3个转基因小麦株系,外源TaPK-R1基因能够在其植物体内遗传和超量转录,并翻译成蛋白质。利用致病力不同的R. cerealis菌株R0301和WK207,分别对3个转基因株系T1至T2代和T3至T4代进行纹枯病抗性鉴定,发现TaPK-R1过量表达提高了转基因小麦的纹枯病抗性,3个转基因株系各世代的纹枯病平均病级为1.16~2.11, 病情指数为23.20~42.10,而对照扬麦20的纹枯病病级为2.55~3.60,病情指数为51.00~72.00。用?9℃低温处理三叶一心期小麦幼苗24 h,对照扬麦20的存活率为17%,3个转基因小麦株系的存活率分别为52%、79%和96%。上述结果表明,TaPK-R1过量表达能显著增强小麦对纹枯病的抗性及对冻害的耐受性, 所获得的3个转基因小麦株系可作为潜在的抗源材料。     

转细胞凋亡抑制基因OpIAP和p35增强小麦对纹枯病的抗性

Op IAP(Orgyia pseudotsugata inhibitor of apoptosis protein)是黄杉毒蛾核型多角体病毒中编码细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)的基因,p35基因编码苜蓿斜纹夜蛾核型多角体病毒中具细胞凋亡抑制作用的35 k Da蛋白。本研究人工合成了Op IAP和p35基因,构建了同时含有Op IAP和p35表达盒的转双价基因载体p Ubi:p35-RSS1P:Myc-Op IAP,两基因分别由玉米泛素基因启动子(Ubiquitin,Ubi)和水稻蔗糖合酶-1启动子(sucrose synthase-1 promoter,RSS1P)驱动。通过基因枪介导法将该载体导入小麦品种扬麦16,获得双价转基因小麦。对T0~T2代植株,利用PCR、RT-PCR、q RT-PCR及Western blot分析,确认导入的外源Op IAP和p35基因能够在4个转双价基因小麦株系中遗传并表达。用来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌强致病株型R0301和WK207对转双价基因小麦的T1、T2代植株分别进行纹枯病抗性鉴定,结果表明,与受体扬麦16相比,双价转基因小麦的T1、T2代植株对纹枯病的抗性明显提高,说明Op IAP和p35基因的表达可以增强转基因小麦对来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌的抗性。     

抗根腐病的转GmPGIP3基因小麦扬麦18的获得与鉴定

GmPGIP3是大豆的一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白, 能够特异性地抑制部分病原真菌内切多聚半乳糖醛酸活性, 从而减弱病原菌对植株的侵害。利用基因重组技术构建了GmPGIP3基因的单子叶植物表达载体pA25-GmPGIP3, 通过基因枪介导法将pA25-GmPGIP3转入小麦品种扬麦18中。对转GmPGIP3基因扬麦18的T₀至T₂代植株进行PCR、Southern杂交、半定量RT-PCR和荧光定量Q-RT-PCR分析, 并对根腐病进行抗性鉴定。结果表明, GmPGIP3已转入扬麦18, 并在转基因小麦中遗传、转录和表达;比受体材料相比, 5个GmPGIP3过表达的转基因小麦株系对根腐病的抗性有明显提高。     

转Gastrodianin基因提高小麦赤霉病和纹枯病的抗性

天麻抗真菌蛋白Gastrodianin在体外可以抑制多种病原真菌的生长。为检验转Gastrodianin基因小麦对真菌病害的抗性,采用基因枪法将由ubiquitin启动子驱动的Gastrodianin基因导入小麦品种扬麦158和Alondra, 获得14株纯合的转基因株系。外源基因的PCR检测、染色体荧光原位杂交、半定量RT-PCR分析结果表明,外源Gastrodianin基因在转基因小麦T₅代植株中已经纯合并有不同水平的表达;赤霉病和纹枯病抗性鉴定结果显示,Gastrodianin基因的表达能抑制病原菌在转基因植株中生长,从而减轻病原菌引起的病症发展,且两种病害的减轻程度与Gastrodianin基因的表达水平正相关。     

转基因抗虫小麦中sgna基因的遗传分析及抗虫性鉴定

利用基因枪介导将抗蚜虫的sgna基因导入了长江中下游地区小麦栽培品种扬麦158，得到了6棵转基因植株。PCR和RT-PCR检测分别证实了sgna基因的整合和表达。通过分析转基因植株的T1代和T2代，发现sgna基因的遗传并不符合孟德尔的遗传规律。抗蚜虫鉴定试验证明含有sgna基因的植株对蚜虫有明显的抗性，转基因植株可以显著降低蚜虫     

过量表达拟南芥NPR1基因提高小麦纹枯病的抗性

拟南芥NPR1基因是植物重要的抗病调控因子,转基因过表达该基因可以赋予植物广谱抗性.为明确该基因在小麦抗纹枯病基因工程中的应用潜力,本研究构建了由玉米ubiquitin启动子驱动的拟南芥NPR1表达载体,采用基因枪介导法导入到小麦品种扬麦12号中,获得20株转基因植株.对14个外源基因纯合株系的半定量RT-PCR和测序分析结果显示,外源拟南芥NPR1基因已经导入转基因小麦并有不同水平的表达,部分转基因株系拟南芥NPR1基因发生重排；纹枯病抗性鉴定结果表明,转基因株系中拟南芥NPR1基因的正确表达可以减轻纹枯病菌引起的病症发展,提高转基因小麦的纹枯病抗性.     

组织特异表达启动子RSS1P在转TiERF1基因小麦中的应用

从水稻叶片中克隆了一个韧皮部组织特异表达的水稻蔗糖合酶启动子(RSS1P),将RSS1P与中间偃麦草乙烯反应因子基因TiERF1相融合构成组织特异表达的TiERF1基因表达盒,取代pAHC20中Ubi::bar基因表达盒,构建成无选择标记的韧皮部组织特异表达的pA20-RSS1P::TiERF1载体。利用基因枪将pA20-RSS1P::TiERF1与pAHC20载体混合、共轰击小麦品种扬麦12的幼胚愈伤组织,获得转RSS1P::TiERF1基因小麦。对该转基因小麦T₀和T₁代植株进行PCR、PCR-Southern、半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析,证实外源RSS1P::TiERF1基因已转入受体,并且具有可遗传性;转入的RSS1P::TiERF1基因仅在根、茎、叶中表达,以根部表达量最高,在种子内不表达。纹枯病抗性鉴定和主要农艺性状考察结果表明,与受体扬麦12相比,转RSS1P::TiERF1基因小麦对纹枯病的抗性有明显提高,与转Ubi::TiERF1基因小麦的抗病性相当,而且转RSS1P::TiERF1基因小麦的农艺性状没有明显改变,说明可以利用RSS1P启动子创造更实用的转基因小麦新种质。     

转Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性

Rs-AFP2属于r-硫堇类抗菌肽,主要通过形成离子通道直接破坏细胞来杀灭病原菌。本研究通过基因枪介导法结合对目标基因的分子检测,证明已将外源Rs-AFP2基因转入小麦推广品种扬麦12中。通过逐株抗纹枯病接种鉴定、PCR、PCR-Southern blot、Southern blot和 RT-PCR/荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析,对转Rs-AFP2基因小麦T₁至T₄代植株跟踪检测。结果表明,Rs-AFP2在转基因小麦中能够稳定遗传,以单拷贝整合到小麦基因组中,遗传方式符合孟德尔遗传规律,并能在转录水平上表达。对转Rs-AFP2基因小麦的抗病性、主要农艺性状以及Rs-AFP2表达活性分析结果表明,与受体扬麦12相比,Rs-AFP2表达活性高的转基因小麦植株对纹枯病抗性有明显提高,其抗病性可以遗传,而主要农艺性状没有明显差异,证明可以利用Rs-AFP2基因和基因工程途径创制抗纹枯病小麦新种质。     

转TiERF1-RC7双价基因小麦的鉴定及其全蚀病抗性

为探讨TiERF1和RC7基因对小麦抗全蚀病的防御反应,本研究对转TiERF1-RC7双价基因小麦进行了分子检测以及全蚀病抗性的室内和田间鉴定。结果表明,转入的TiERF1和RC7基因在转基因小麦中可以遗传和转录;与受体扬麦18相比,5个转TiERF1-RC7小麦株系在整个生育期抗病性显著提高,苗期的全蚀病严重度在10%以下,成熟期的白穗率在13%以下,而扬麦18的严重度为62.98%,白穗率为26.09%。电子显微镜观察结果表明抗病转基因小麦根表的全蚀病原菌菌丝数量及生长势明显低于感病材料。上述结果说明,转入的TiERF1和RC7基因抑制了全蚀病原菌的侵染及在转基因小麦中繁殖,进而提高了转基因小麦对全蚀病的抗性。