柑橘黄化脉明病毒RT-LAMP检测方法的建立

柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）引起,是中国近年来新发生的一种柑橘病害。根据CYVCV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示该方法能特异扩增CYVCV,与其他6种柑橘病原物（柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙病菌）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍;田间样品的检出率为63.33%,与RT-PCR的结果一致,适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CYVCV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

柑橘黄化脉明病毒DTBIA检测方法的建立

通过柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）兔源多克隆抗体（一抗）及Ap标记羊抗兔IgG（二抗）最佳稀释度等条件优化建立了CYVCV直接组织点免疫（Direct tissue blot immunoassay,DTBIA）检测方法,并对其特异性、稳定性和检测效果进行了评价。试验结果显示,一抗、二抗稀释比例分别为1︰8 000和1︰2 000时,DTBIA检测CYVCV效果最佳;应用所建立的DTBIA方法对携带9种不同柑橘病害的柑橘样品进行检测时,仅携带CYVCV样品呈阳性反应;柑橘黄脉病样品植物组织印迹后,印迹膜于4 ℃保存,90 d内可进行有效的CYVCV检测;对田间不同柑橘品种利用DTBIA法检测CYVCV,其结果与一步法RT-PCR符合率为97.92%。可见,该CYVCV检测方法快速、简便、稳定、特异及可靠,可推广应用于田间快速检测CYVCV,对于防范柑橘黄化脉明病毒大面积传播流行具有重要的现实意义。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

运用实时荧光RT-PCR技术检测柑橘碎叶病毒

柑橘碎叶病是由橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)引起的一种重要的柑橘病害,为更快、更准确的检测CTLV,合成了一对特异性引物ASG-Pf和ASG-Pr,建立了运用SYBRGreenI荧光染料法检测CTLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明,该检测体系能特异的检出CTLV,对测试的衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒和鳞皮病毒都不能检出;灵敏度比常规PCR高100倍;适用性广,可检测出多种柑橘类植物中的CTLV。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理,且SYBR GreenI荧光染料成本较低,适用于检测柑橘体内含量较低的CTLV病毒。     

浙江柑橘产区柑橘黄脉病毒的发生、分布与分子特性研究

运用RT-PCR技术对采自浙江12个柑橘产地的181份柑橘样品进行检测,首次从浙江的‘佛手’柑(Citrus bergamia)和‘红美人’橘(C.reticulata)上检测出柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV),其检出率分别为68.0%和47.2%。选取4个CYVCV毒株与11个已知CYVCV毒株进行全序列分析,结果显示CYVCV序列保守性较高,所有15个CYVCV毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为96.9%~99.8%和97.9%~99.4%。虽然采自浙江的4个CYVCV毒株在进化树中聚成单独的簇,但CYVCV毒株间的亲缘关系可能不与其采样地的存在相关性。     

柑橘脉突病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

为了快速、灵敏地检测柑橘脉突病毒(Citrus vein enation virus,CVEV),通过设计特异性引物(EVq F4/EVq R4),优化反应条件,建立了CVEV的实时荧光定量RT-PCR检测体系。该方法特异性良好;检测灵敏度比常规RT-PCR高100倍;标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.992,扩增效率101.8%;检测组内和组间变异系数均小于2.85%,重复性较好。利用所建立的实时荧光定量方法对柑橘植株进行检测发现,‘代代酸橙’和‘象山红’植株中CVEV分布不均匀,其中根部病毒滴度最高,分别为162.52和45.32拷贝·ng~(-1) RNA,皮及叶部病毒滴度相对较低。     

柑橘4种病毒多重PCR检测技术的建立及应用

柑橘衰退病毒(CTV)、柑橘碎叶病毒(CTLV)、柑橘黄化脉明病毒(CYVCV)和柑橘叶斑驳病毒(CLBV)是影响柑橘生产的重要病毒性病害,建立快速、准确的检测方法是防控该病害的基础。本研究通过筛选针对4种病毒基因组保守区域设计的特异性引物,优化影响多重RT-PCR扩增的引物浓度、退火温度,建立了可同时扩增4种病毒的多重RT-PCR检测体系。该检测体系扩增的特异片段大小分别是CTLV 889 bp、CYVCV 612 bp、CTV 462 bp和CLBV 294 bp,扩增产物清晰,特异,检测灵敏度较普通单重RT-PCR灵敏度低约10倍。采用多重RT-PCR和单重RT-PCR对收集到的59份田间样品分别进行检测,结果显示2种方法检测结果一致,4种病毒的检出率在11.9%～54.2%之间。建立的多重RT-PCR方法可准确、快速、灵敏地检测单一或复合侵染的4种柑橘病毒。     

柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立

根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。     

T3基因型柑橘衰退病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立及应用

根据不同基因型柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）ORF1a的序列差异,设计T3基因型CTV的特异性引物T3-4F/R,通过优化得到最佳反应条件建立T3基因型CTV分离株的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性试验。应用该方法测定柑橘植株中T3基因型CTV分离株含量。建立了一种特异性检测T3基因型CTV分离株的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,其灵敏性比普通RT-PCR方法高100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为97.1%,相关性系数为0.992。组内和组间变异系数均小于2.94%,表明该方法重复性好。田间样品中T3基因型CTV含量差异较大,最高含量是最低含量的1 250倍。本研究中建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法能够准确检测柑橘植株内的T3基因型CTV分离株,可用于研究T3基因型的CTV的变化规律。     

不同类型柑橘中黄脉病毒衣壳蛋白基因的保守性及复制水平

为研究不同柑橘品种对柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)变异的影响,将CYVCV毒株CQ01嫁接接种于4类共35个柑橘品种,对不同植株中CYVCV的衣壳蛋白(CP)基因进行分析,结果发现仅有少数位点发生了变异。运用RT-qPCR技术检测不同柑橘品种中CYVCV的相对含量,发现甜橙类品种中CYVCV的相对含量最高,墨西哥来檬中CYVCV的相对含量最低。植株中CYVCV的含量与其症状不存在明显的关联。     

柑橘黄化脉明病毒基因组的长链RT-PCR扩增、克隆及序列分析

为了建立柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)基因组长链RT-PCR扩增体系,构建其全长cDNA克隆,为深入了解CYVCV分子特性及其致病机理奠定基础。根据GenBank中CYVCV基因组序列和5′RACE扩增结果设计引物。以感染CYVCV的代代酸橙(Citrus aurantium‘Daidai’)植株总RNA为模板进行长链RT-PCR扩增,得到CYVCV全基因组cDNA,克隆至pGEM-Teasy载体,并进行序列测定与分析。结果显示,建立了一步扩增CYVCV全基因组的长链RT-PCR方法,扩增出约7.5 kb的目标片段;所获得的4个CYVCV全基因组cDNA序列与GenBank中已登录的相关毒株的核苷酸序列同源性为93%~99%。     

中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。     

葡萄扇叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus,GFLV）RNA2序列设计4对特异性引物,通过引物筛选、体系优化,建立了以FL-HP1-F/R为引物的GFLV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。该方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为100%,相关性系数为0.998,灵敏性分别是常规RT-PCR和巢式RT-PCR的100倍和10倍。重复性试验表明组内和组间变异系数均小于2.59%,显示该方法具有较好的检测稳定性。内参基因的稳定性测试结果表明葡萄EF1和GAPDH基因具有较好的试验稳定性。利用建立的荧光定量方法测定12个葡萄样品中GFLV含量,并检测58个葡萄样品,结果表明不同葡萄样品中GFLV含量差异较大,最高含量是最低含量的81 245.5倍,与ELISA和巢式RT-PCR相比,实时荧光定量方法能检测出更多的GFLV分离物。