甘蓝Ogura 细胞质雄性不育相关基因BoMF1启动子的克隆及功能分析

 通过TAIL-PCR 染色体步移技术,从甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）基因组中克 隆到胞质雄性不育（OguCMS）相关基因BoMF1 翻译起始位点上游521 bp 的启动子序列。软件分析预测 表明,该启动子序列中存在多个顺式作用元件,包括TATA-box、CAAT-box、MYB 结合位点、植物激 素响应单元等。为了研究该启动子的表达特性,亚克隆了BoMF1 转录起始位点上游521 bp 序列,将其置 换pBI121 中的CaMV35S 启动子,驱动其下游的GUS 基因,构建植物表达载体pBI121-BoMF1P,以pBI121 空载体作为阳性对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法转入拟南芥。结果表明,甘蓝BoMF1 启动子序列 能驱动GUS 基因在拟南芥花药发育晚期的花药和花粉中特异表达,表达具有组织特异性。     

蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能初步分析

利用hiTAIL-PCR法,从蜡梅（Chimonanthus praecox）基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6翻译起始位点上游1 266 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。为进一步分析CpAGL6启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS组织化学染色及GUS酶活性定量检测,结果显示,CpAGL6基因启动子能够驱动GUS基因在转基因烟草的叶、茎、花中表达,并且在不同花期表达强度存在差异,在根中几乎不表达。转基因植株经黑暗、赤霉素和4 ℃低温处理后,GUS酶活性均有所增加。结果表明,CpAGL6启动子主要驱动GUS报告基因在花器官和绿色器官组织中表达,推测其在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。     

甜樱桃砧木PcMPK3基因启动子的克隆及对病原菌感染的响应

【目的】探明PcMPK3基因的表达调控规律。【方法】利用染色体步移技术从甜樱桃矮化砧木Gisela 6中克隆PcMPK3基因的启动子序列PcMPK3pro。利用Neural Network Promotor Prediction、softberry、PLACE和PlantCARE网站在线预测PcMPK3基因的基础启动子、转录起始位点和顺式作用元件。将PcMPK3pro定向替换植物表达载体pBI121-SN1的CaMV35S组成型启动子,构建重组表达载体pBI-PcMPK3pro:GUS,瞬时转化烟草叶片。【结果】结果表明,PcMPK3pro含有启动子核心元件TATA-box和CAAT-box等多种响应胁迫的顺式作用元件。受病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000,Pst DC3000)侵染,PcMPK3pro能驱动GUS报告基因表达且GUS酶活性显著提高。【结论】推测PcMPK3基因参与植物响应病原菌感染的胁迫过程。     

菠萝AcSERK1 启动子的转录起始位点及胚性细#br# 胞特异性鉴定

 AcSERK1 是菠萝（Ananas comosus）体细胞胚发生初期特异表达的基因,为探讨其转录调控 规律,对其5′上游调控序列的转录起始位点及启动特性进行了鉴定。采用hiTAIL-PCR 技术从菠萝基因组 DNA 中克隆了AcSERK1 完整的5′上游调控序列,利用5′RACE 技术鉴定出其转录起始位点位于起始密码 子（ATG）上游258 nt（G）处。以AcSERK1 5′上游完整调控序列取代pBI121 中的CaMV 35S 启动子,构 建植物表达载体AcSERK1（–2 090/+258）︰︰GUS,并在菠萝不同组织器官中进行瞬时转化分析,发现AcSERK1 5′上游完整的调控序列（–2 090/+258）能够启动GUS 在胚性细胞中特异性表达,与AcSERK1 表达规律相 同,说明该启动子为胚性细胞特异性启动子,对调控外源基因在体细胞胚早期特异表达有重要意义。     

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。     

菠萝AcSERK1启动子的转录起始位点及胚性细胞特异性鉴定

AcSERK1是菠萝(Ananas comosus)体细胞胚发生初期特异表达的基因,为探讨其转录调控规律,对其5′上游调控序列的转录起始位点及启动特性进行了鉴定。采用hiTAIL-PCR技术从菠萝基因组DNA中克隆了AcSERK1完整的5′上游调控序列,利用5′RACE技术鉴定出其转录起始位点位于起始密码子(ATG)上游258 nt(G)处。以AcSERK1 5′上游完整调控序列取代pBI121中的CaMV 35S启动子,构建植物表达载体AcSERK1(–2090/+258)︰︰GUS,并在菠萝不同组织器官中进行瞬时转化分析,发现AcSERK15′上游完整的调控序列(–2090/+258)能够启动GUS在胚性细胞中特异性表达,与AcSERK1表达规律相同,说明该启动子为胚性细胞特异性启动子,对调控外源基因在体细胞胚早期特异表达有重要意义。     

番木瓜凝乳蛋白酶基因启动子的克隆及功能研究

 采用 PCR技术从番木瓜品种‘穗中红’克隆了木瓜凝乳蛋白酶基因的部分序列及其5'侧翼序列,构建含有两种长度启动子片段的植物表达载体,并用基因枪轰击番木瓜叶组织和农杆菌转化烟草叶盘。结果表明,克隆产物长719 bp,163 bp 3'侧翼序列与 GenBank中的番木瓜凝乳蛋白酶基因序列同源性为99%,556 bp的 5'侧翼序列有基础启动子区,转录起始位点位于ATG上游38bp的T。序列登录号为 AY803756。预测在启动子区存在 TATA-box、CAAT-box、WUN和HSE等顺式作用元件。两种启动子片段驱动的GUS基因瞬时表达和稳定表达结果表明,该启动子片段具有乳管特异表达活性。     

苹果和梨AFS基因启动子的克隆、序列比对及功能分析

苹果（Malus × domestica L.）和梨（Pyrus communis L.）果实在低温储存过程中虎皮病的发生与果皮中受乙烯诱导的α–法尼烯合酶基因（AFS）的表达及α–法尼烯的积累密切相关。采用TAIL-PCR技术分别从‘富士’苹果和‘丰产’梨中克隆到了约2 kb的α–法尼烯合酶基因（AFS）启动子序列,并提交至GenBank中（登录号分别为KM676083和KM676082）。序列比对发现两启动子同源性仅为48.31%,远低于其下游编码区97%的相似度。顺式作用元件在线预测分析发现二者同时存在乙烯、脱落酸、茉莉酸、水杨酸等激素响应元件,低温、厌氧、病原菌等胁迫响应元件,以及3个节律性表达元件和2个诱导子响应元件。对‘丰产’梨中AFS基因表达模式的分析也证实了部分预测的诱导因素对其表达有调控作用。将‘丰产’梨AFS基因启动子序列进行系列删除,与GUS报告基因构建融合表达载体转化烟草,利用GUS染色方法分析了不同长度启动子的转录活性差异,发现缩短至153 bp的启动子片段仍具有较强的转录活性,且长度在276 bp至573 bp的启动子片段其驱动下游基因转录的活性较其他片段更强。通过后续对各作用元件尤其是乙烯响应元件的研究将有助于进一步从分子水平认识虎皮病的发生机制。     

杏CCD1和CCD4启动子克隆及顺式作用元件分析

以‘轮台小白杏’杏果实为材料，根据转录组数据库中的CCD1和CCD4基因片段，通过基因组步移法克隆了两个启动子pPaCCD1和pPaCCD4，获得了长度分别为2 233和1 838 bp的启动子序列。利用PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测分析，结果表明两个启动子均含有多个光响应、脱落酸和茉莉酸甲酯等共有顺式作用元件，此外，PaCCD1启动子中含有刺激诱导和种子特异性调控等响应元件，PaCCD4启动子中含有赤霉素、低温和增强转录水平等响应元件，这暗示PaCCD1和PaCCD4的表达可能受光信号、激素和胁迫等多种信号的共同调节。为进一步确定其启动子核心区，基于基因结构特征与顺式作用元件的分布情况，分别构建两个不同长度缺失启动子与GUS基因融合的表达载体并瞬时转化烟草叶片。GUS活性检测发现，在PaCCD1的启动子上游–2 174 ~–1 700 bp、–1 700 ~–1 200 bp、–1 200 ~–600 bp区间内均包含影响启动子活性的顺式作用元件；PaCCD4启动子在上游–1 740 ~–1 200 bp和–1 200 ~–600 bp这两个区间内含有顺式作用元件，随着启动子片段的缺失，PaCCD1和PaCCD4的GUS活性逐渐减弱。PaCCD1的启动子核心区域在–1 200 ~ 2 174 bp区段内，PaCCD4的启动子核心区域在–1 200 ~ 1 740 bp区段内。     

芜菁花青素合成关键酶DFR基因启动子的克隆及功能分析

在已经克隆的‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁二氢黄酮醇4–还原酶（DFR）基因的基础上,通过染色体步移法从两种芜菁基因组中克隆了BrDFR1和BrDFR2基因上游1 296和1 297 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,启动子片段中包含TATA box、CAAT box、光调控元件、ABA应答元件、伤害应答元件、低温应答元件、防御与胁迫应答元件、MeJA应答元件等多个顺式作用元件。启动子BrDFR1P和BrDFR2P仅在15个核苷酸位点存在差异。将BrDFR1P和BrDFR2P分别连接到pCAMBIA1301植物表达载体上,构建Promoter::GUS载体,通过农杆菌介导遗传转化烟草。GUS组织化学染色检测表明,BrDFR1P和BrDFR2P均能驱动GUS基因表达。构建BrDFR1P和BrDFR2P的一系列缺失体,融合GUS基因后遗传转化烟草。染色结果表明,BrDFR1P和BrDFR2P缺失片段均具有相应的起始下游基因转录的活性特征。     

TAIL-PCR方法快速克隆银杏查尔酮合成酶基因及序列分析(英文)

热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法已广泛应用于从多种生物克隆已知DNA序列的侧翼序列。对传统的TAIL-PCR方法进行改良:(1)将TAIL技术应用于TAIL-PCR中第3步PCR循环。(2)以10bp的随机简并引物即RAPD引物代替基因侧翼简并引物。以银杏品种家佛手的叶基因组DNA为模板,利用简并引物克隆到银杏查尔酮合成酶基因(CHS)片段序列Gbchs1,以此序列设计3条特异引物,利用改良的热不对称交错PCR方法克隆到CHS基因Gbchs2。结果表明,Gbchs2长1238bp,编码304个氨基酸并包含3’末端序列。GbCHS2蛋白质序列与其他植物的CHS蛋白质序列高度同源,包含CHS蛋白质保守的环化作用活性位点,催化活性位点、香豆素活性位点、及催化活性基序。改良后的TAIL-PCR方法为基因全长的克隆提供了一种简单快速高效的新方法。     

莲种子防御素基因序列分析及表达载体构建

从莲种子发育中期胚cDNA文库中克隆得到的防御素基因cDNA全长561bp,GenBank登录号为EF421192。分析发现该基因234bp的开放读码框编码77个氨基酸的多肽序列,除信号肽序列外与其它不同来源的植物防御素基因有较高同源性,将其命名为NnDefensin。NnDefensin蛋白带有30个氨基酸的信号肽,具有8个半胱氨酸的高度保守结构等典型的植物防御素特征,成熟肽部分含有γ–硫素蛋白功能结构域。在系统进化上NnDefensin与单子叶植物中的粳稻和小麦的同源蛋白,以及车前草同源蛋白亲缘关系较为接近。通过PCR扩增克隆莲胚防御素基因片段并连接到载体pBI121和带有花生油体蛋白种子特异启动子的载体pAhOleo17.8︰GUS中,成功构建了35S启动子控制的植物表达双元载体pBI121-NnDef和种子特异表达双元载体pAhOleo-NnDef,为该基因的功能鉴定及通过基因工程方法提高转基因植物以及种子的抗病能力奠定基础。     

柿果ACC合成酶基因的克隆与植物表达载体的构建

以柿果组织中分离的总RNA为模板,经RT-PCR扩增到约1.1 kb的富有柿果ACC合成酶(Fuyu-ACS)的 基因片段,将此片段克隆到pGEMR-T easy vector上,经测序分析与Genbank中平核无柿果的DK-ACS1基因核苷酸 序列的同源性为99％。设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ACS- Fuyu片段。2个片段经双酶切消化后,分别以正反2个方向插入到植物表达载体pBI121的35 S启动子和NOS终止 子之间,构建成Fuyu-ACS基因的植物表达载体。     

番茄果实特异性LYC-B 干扰载体的构建及在不同颜色果实中的表达特异性验证

为了研究番茄LYC-B 干扰对类胡萝卜素合成主要酶和主要代谢产物的影响，构建了果实特异性的番茄红素β- 环
化酶LYC-B 干扰载体，并验证了其在不同颜色番茄果实中的有效性。依据X13437.1 扩增番茄果实特异启动子E8，构建了果
实特异性载体E8-pBI121，其在粉色、红色、绿色和紫色的番茄果实中均能表达。依据X86452.1 扩增番茄LYC-B 从61～861
bp 间长度为801 bp 的片段LYC-B1 和从 480～781 bp 间长度为302 bp 的片段 LYC-B2，构建了以CaMV 35S 为启动子的LYC-B
干扰表达载体pBI121-B1B2，以E8 替换CaMV 35S，构建了果实特异性干扰载体E8-pBI121-B1B2。采用农杆菌注射法分别
侵染番茄叶片和果实，GUS 染色显示，pBI121-B1B2 在叶片、果实和种子中均表达，E8-pBI121-B1B2 只在果实和种子中表达。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

菊花叶绿素a/b结合蛋白基因CmLhcb1及其启动子的克隆和表达分析

 以切花菊品种‘公子’cDNA为模板克隆出叶绿素a/b结合蛋白同源基因cab,其开放阅读框为798 bp,编码266个氨基酸。经多物种间比对分析,确认其属于cab基因家族的Lhcb1类,命名为CmLhcb1。同源克隆菊花品种‘清露’Lhcb1基因,氨基酸序列与‘公子’完全相同。CmLhcb1在叶片中的表达量比在茎、花和根中高,弱光和GA₃处理使CmLhcb1表达上调,多效唑处理后CmLhcb1表达量受到抑制。CmLhcb1的表达受昼夜节律调节,白天表达量显著高于夜间。通过high-efficiency TAIL-PCR（hiTAIL-PCR）方法克隆到‘公子’切花菊CmLhcb1起始密码子上游序列715 bp和‘清露’起始密码子上游序列716 bp,序列经PLACE数据库的比对分析,发现有很多与非生物和生物胁迫相关的元件,主要与光照、GA、ABA、水分、水杨酸和病毒相关,CmLhcb1启动子是光诱导型启动子,具有GT1-box和Z-box。