小鼠MyoD基因真核表达载体的构建与检测

为了最终建立诱导小鼠iP S细胞为成肌细胞的方法,试验在克隆小鼠Myo D基因的基础上,将其与pc DNA3.1载体连接,以构建真核表达载体;采用脂质体法将重组质粒转染到小鼠胚胎成纤维细胞中,利用Real-time PCR技术、免疫荧光检测和流式分析等技术对转染前后细胞的Myo D基因表达情况进行检测。结果表明:成功克隆获得Myo D基因,并构建真核表达载体Myo D-pc DNA3.1;转染Myo D-pc DNA3.1的小鼠胚胎成纤维细胞经免疫荧光检测后在荧光显微镜下呈现表达Myo D基因的红色;Real-time PCR检测其Myo D基因相对表达量提高至8.926±0.010;经BD Accuri-C6个人型流式细胞仪检测,约有93%的转染细胞表达Myo D蛋白,在荧光倒置显微镜下可观察到表达Myo D蛋白而呈现的绿色荧光。说明已成功构建特异表达Myo D基因的真核表达载体Myo D-pc DNA3.1。     

牛FABP3转基因小鼠的遗传及表达特性研究

旨在研究和分析牛FABP3基因在小鼠体内遗传和表达特性,对培育优质高产转基因肉牛新品种具有重要意义。本研究利用前期获得的4只FABP3转基因小鼠,通过制定的4组交配方案获得子代小鼠,并利用PCR、实时荧光定量PCR和组织原位表达技术对转基因牛FABP3基因小鼠的子代遗传特征,以及FABP3基因在G0代和G1代小鼠心、肝、肾、骨骼肌组织的表达情况进行了检测。RT-PCR检测结果表明,在G0代转基因小鼠中,牛FABP3基因能够表达;牛FABP3基因在转基因小鼠中可以遗传,G1代转基因小鼠平均阳性率达68.4%;相对定量PCR结果表明,转基因小鼠总FABP3基因在G1代小鼠心肌和骨骼肌中表达量相对于阴性个体有不同程度的增加;组织原位检测表明,在G0代个体中表达量较高,G1代个体中虽能看到绿色荧光,但略有降低。本研究表明,牛FABP3基因存在于小鼠基因组中,并能够被表达,且可以遗传给后代,这为后期进一步研究牛FABP3基因对小鼠骨骼肌脂肪含量的影响奠定坚实基础。     

肌肉生长抑制素在小鼠不同发育阶段心肌组织中的表达

本试验旨在探究肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因在小鼠不同发育阶段心肌组织中的表达情况,分别选取幼年(7日龄)、性成熟(21~28日龄)、体成熟(42~56日龄)和老年(84日龄以上)4个发育阶段的健康小鼠(各3只)为研究对象,采用实时荧光定量PCR、HE染色、免疫组织化学等方法研究小鼠不同发育时期MSTN基因在心肌组织中的表达及不同时期心肌组织的发育。实时荧光定量PCR结果显示,MSTN基因在小鼠不同发育阶段心肌组织中均有表达,且其在小鼠老年时期的表达量最高,体成熟时期的表达量最低;幼年小鼠和性成熟小鼠心肌组织中MSTN基因表达水平显著低于老年小鼠(P0.05),而体成熟小鼠则极显著性低于老年小鼠(P0.01)。HE染色结果显示,小鼠心肌细胞核及肌纤维的生长在不同发育时期明显不同,其中幼年时期的细胞核最多,肌纤维排列相对较紧密,而在性成熟、体成熟、老年时期心肌的发育指标依次降低。免疫组织化学结果显示,MSTN基因主要在心肌细胞核中表达,其各个时期表达量与实时荧光定量PCR的结果相符合。     

肌肉生长抑制素在小鼠不同发育阶段心肌组织中的表达

本试验旨在探究肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因在小鼠不同发育阶段心肌组织中的表达情况，分别选取幼年（7日龄）、性成熟（21~28日龄）、体成熟（42~56日龄）和老年（84日龄以上）4个发育阶段的健康小鼠（各3只）为研究对象，采用实时荧光定量PCR、HE染色、免疫组织化学等方法研究小鼠不同发育时期MSTN基因在心肌组织中的表达及不同时期心肌组织的发育。实时荧光定量PCR结果显示，MSTN基因在小鼠不同发育阶段心肌组织中均有表达，且其在小鼠老年时期的表达量最高，体成熟时期的表达量最低；幼年小鼠和性成熟小鼠心肌组织中MSTN基因表达水平显著低于老年小鼠（P<0.05），而体成熟小鼠则极显著性低于老年小鼠（P<0.01）。HE染色结果显示，小鼠心肌细胞核及肌纤维的生长在不同发育时期明显不同，其中幼年时期的细胞核最多，肌纤维排列相对较紧密，而在性成熟、体成熟、老年时期心肌的发育指标依次降低。免疫组织化学结果显示，MSTN基因主要在心肌细胞核中表达，其各个时期表达量与实时荧光定量PCR的结果相符合。     

CPT1A基因在广西麻鸡的表达研究

该研究旨在阐明CPT1A基因在广西麻鸡组织表达和时序表达谱,为研究鸡体内脂肪代谢提供一定的基础资料。选取胚胎期到性成熟时的广西麻鸡,在不同发育时间点采集胸大肌、腓肠肌、心脏和肝脏组织样品,利用实时荧光定量方法,分析CPT1A基因在不同组织不同发育阶段表达规律。组织表达结果显示,CPT1A在广西麻鸡不同发育阶段4种组织中表达差异性不同。在胚胎期,CPT1A基因在腓肠肌的表达量最高;1日龄和1周龄时,CPT1A在心脏表达量最高;5、7、9、13和16周龄时,CPT1A在胸大肌的表达量最高。时序表达结果显示,CPT1A在肝脏各个发育阶段表达量均较低。CPT1A在胸肌的表达量呈现逐渐上升的趋势,且变化趋势最显著,5、7、9、13、16周龄的表达量显著高于其他试验阶段。时序表达谱显示,CPT1A基因在同一发育阶段4种组织表达量不同,4种组织在不同发育阶段变化趋势不同。     

牛结蛋白基因启动子的克隆及功能的初步分析

<正>旨在克隆牛结蛋白基因不同长度的启动子片段,并对其进行功能分析。本研究采用PCR法扩增牛结蛋白基因不同长度的启动子缺失序列,构建p GL3-desminpro双荧光素酶表达载体,使其转染牛骨骼肌卫星细胞和胎儿成纤维细胞,进行活性检测。同时转染牛Myo G和βα-actin基因启动子的表达载体,以比较结蛋白启动子和Myo G及α-actin启动子的表达活性。结果表明,牛结蛋白基     

小鼠黏着斑相关蛋白在不同组织中的表达分析

黏着斑相关蛋白(focal adhesion associated protein,FAAP)是近几年新发现的一种分布广泛的蛋白,该蛋白由小鼠D10Wsu52e基因编码。为探索D10Wsu52e基因在小鼠各组织中的表达情况,进一步预测该蛋白的功能,提取小鼠心脏、肾脏、脾脏、肺、背肌、腿肌、小肠、睾丸、附睾及卵巢、子宫的总RNA,利用实时荧光定量PCR技术,检测D10Wsu52e基因在各组织中的相对表达量,寻找组织表达规律及其潜在的功能。结果显示:所提取的小鼠11种组织中均有D10Wsu52e基因的表达,其相对表达量在各组织之间差异显著(P<0.05);D10Wsu52e基因在小鼠11种组织中的表达量由高到低依次为背肌、子宫、卵巢、腿肌、附睾、睾丸、肾脏、脾脏、心脏、肺、小肠,其中D10Wsu52e基因在心脏、肺、小肠中的相对表达量显著低于背肌和子宫(P<0.05)。结果表明:D10Wsu52e基因可能对调控啮齿动物多种组织器官,特别是生殖器官及骨骼肌发育具有一定的作用。     

CPT1B基因在灵山香鸡上的时空表达规律研究

本实验旨在阐明CPT1B基因在灵山香鸡上的组织表达和时序表达谱,为研究鸡体内脂肪代谢提供一定的基础资料。选取胚胎期到性成熟时的灵山香鸡为实验材料,在不同发育时间点(9、12、16胚龄,1日龄,1、3、 5、7、10、13、16周龄)采集胸肌、腿肌、心脏、肝脏组织样品,利用实时荧光定量方法分析CPT1B基因在不同组织不同发育阶段的表达规律。结果显示:CPT1B在不同发育阶段4种组织中表达差异性不同,在胚胎期和1日龄,CPT1B基因在肝脏的表达量最高;5、7、10、13周龄时,CPT1B在胸肌的表达量最高;CPT1B基因在4种组织不同发育阶段变化趋势不一致,其在肝脏表达量呈现下降趋势,而在腿肌、胸肌和心脏表达量呈上升趋势,在胸肌的各个发育阶段上升趋势最显著;CPT1B虽然属于肌肉亚型CPT,但不是每个发育阶段在肌肉组织中的表达量最高,在胚胎期,鸡肝脏是CPT1B参与脂肪酸β-氧化的主要场所,而在出雏后到性成熟时期胸肌是CPT1B参与脂肪酸β-氧化的主要场所。     

蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2基因mRNA在小鼠睾丸发育过程中的表达

为探讨蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2 mRNA在小鼠出生后睾丸发育过程中的表达规律,本试验以16组出生后不同发育阶段的昆明种健康小鼠的睾丸组织为材料,经Real-time PCR检测小鼠出生后睾丸中Shp2基因mRNA的表达变化。结果显示,Shp2基因mRNA在小鼠出生后睾丸发育过程中连续表达,且第20~31天出现明显波动,20 d时Shp2表达量极显著增加(P<0.01),然后下降(P<0.01),在31 d再次极显著增加(P<0.01),31 d后,Shp2的表达量又逐渐恢复平稳(P>0.05)。上述结果表明,Shp2基因的连续性表达及在特定发育阶段表达量的明显波动,预示着Shp2参与小鼠出生后睾丸发育的全过程,但具体作用如何还有待进一步研究。     

沙子岭猪跨膜与卷曲螺旋域2(TMCO2)基因克隆、生物信息学及组织差异表达分析

利用RACE法克隆沙子岭猪TMCO2基因cDNA全长并进行生物信息学分析,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对TMCO2基因在沙子岭猪D30时期8个不同组织(睾丸、肌肉、肺、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、脂肪)及睾丸组织8个不同发育阶段(E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150、D180)进行差异表达分析。结果表明:TMCO2基因克隆所得片段长740 bp,其中ORF区为546 bp,编码181个氨基酸。qRT-PCR结果显示,沙子岭猪D30时期TMCO2 mRNA在睾丸组织中表达量最高,其次为脾脏组织,而在其他组织中表达量极低,其中睾丸组织与其他组织表达量差异均为显著(P0.05);睾丸组织不同发育时期中,TMCO2 mRNA在D180时期表达量达到最高,在D1和D150时期表达量略有下降,其中D180与其他时期的差异均为极显著(P0.01),E90、D1、D30、D60 4个生长发育期时期表达量差异不显著(P0.05)。本试验首次克隆了沙子岭猪TMCO2基因cDNA全长并检测了其在猪不同组织及睾丸组织不同发育阶段表达量,为进一步研究TMCO2基因功能奠定基础。     

“花山麻鸡”CPT1A基因时空表达规律研究

试验旨在阐明"花山麻鸡"CPT1A基因的组织表达和时序表达规律,以胚胎期到上市日龄的"花山麻鸡"为试验材料,在不同发育时间点采集胸肌、腿肌、心脏、肝脏组织样品,利用实时荧光定量方法分析CPT1A基因在不同组织不同发育阶段表达规律。在相同发育阶段不同组织差异表达结果显示:在胚胎期(9、12、16日胚龄)和上市日龄(9周龄),CPT1A基因在肝脏的表达量显著高于在心脏、胸肌和腿肌的表达量,在出生后1日龄,CPT1A在心脏表达量最高,1周龄时,CPTA在肝脏的表达量最低;5周龄时,CPT1A在腿肌的表达量最高;7周龄时,CPT1A在腿肌和肝脏的表达量显著高于胸肌和心脏。在同一组织不同发育阶段差异表达结果显示,CPT1A在胸肌、腿肌、肝脏和心脏不同发育阶段表达规律与表达量是不同的。研究表明CPT1A基因在胸肌、腿肌、肝脏和心脏相同发育阶段表达量不同,CPT1A基因在胸肌、腿肌、肝脏和心脏织不同发育阶段表达规律与表达量不同。     

兔骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化及鉴定

为了研究兔骨骼肌卫星细胞体外分离培养及成肌诱导分化效果,试验采用1日龄幼兔腿部肌肉组织,利用胶原酶联合胰酶消化法分离肌卫星细胞,采用差速贴壁法对原代细胞进行纯化,对纯化后的兔骨骼肌卫星细胞进行低血清诱导分化,于培养皿中培养至形成成熟肌管,观察肌管形成状态,分别采用RT-PCR及免疫荧光染色方法对成肌分化标志性基因肌细胞生成素(Myo G)和肌球蛋白重链(MHC)进行检测。结果表明:新分离出的兔骨骼肌卫星细胞呈梭形,折光性强,2%马血清分化培养液培养3 d后开始出现大量肌管,状态良好,大部分肌管出现收缩跳动现象。RT-PCR检测结果显示,Myo G基因在肌管中表达量较高,在未分化的兔骨骼肌卫星细胞内未表达。免疫荧光染色结果显示,MHC基因在成熟肌管内呈阳性表达。     

沙子岭猪GSG1基因克隆、生物信息学分析及组织表达

采用RACE技术克隆猪GSG1(Germ Cell-specific gene 1)基因cDNA1全长并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR对GSG1基因在沙子岭猪睾丸组织8个不同发育阶段(E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150和D180)和30日龄时9个不同组织(睾丸、肌肉、小肠、肺、心脏、肾脏、肝脏、脾脏和脂肪)的表达量。结果表明:GSG1基因cDNA全长为1 257 bp,含1个长993 bp的开放阅读框,编码330个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示,GSG1基因在睾丸组织中的表达量最高,显著高于其余8个组织(P0.05),且其在肌肉、小肠、肺脏、心脏、肾脏和脂肪中的表达水平极低;GSG1基因在睾丸组织的E90、D1、D30和D60这4个发育时期的表达量较低,显著低于D90、D120、D150和D180这4个时期(P0.01)。本试验首次克隆了猪GSG1基因cDNA全长并检测了其在不同组织和不同发育阶段睾丸组织的表达,为进一步研究其调控猪睾丸发育和精子生成的机制奠定了理论基础。     

fat-1转基因小鼠脂类代谢相关基因的表达分析

为了分析fat-1转基因小鼠对3个脂类代谢关键基因(FASN、PPAR、LPL)的组织表达特性,研究利用实时荧光定量PCR技术检测FASN、PPAR和LPL在心脏、肝脏、骨骼肌组织中的表达情况。结果表明:FASN、PPAR、LPL基因在转基因小鼠心脏、肝脏、骨骼肌的表达情况有很大差异。其中PPAR和LPL基因在转基因小鼠肝脏组织中极显著升高(P0.01),而在心脏、骨骼肌的表达量显著或极显著下降(P0.01或P0.05);FASN基因只在骨骼肌中极显著下降(P0.01),而在心脏和肝脏中没有发生明显变化(P0.05)。说明fat-1基因能够在机体脂类代谢的调控过程中发挥重要的作用。     

沙子岭猪ASB17基因克隆、生物信息学分析及组织差异表达研究

本研究利用RACE法克隆沙子岭猪ASB17基因cDNA全长并进行生物信息学分析,应用实时荧光定量PCR对ASB17基因在沙子岭猪D30时期9个不同组织（睾丸、肌肉、小肠、肺脏、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、脂肪）及睾丸组织8个不同发育阶段（E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150、D180）进行差异表达分析。结果显示,ASB17基因克隆所得片段长1 135 bp,其中ORF区为888 bp,编码295个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示沙子岭猪D30时期ASB17 mRNA在睾丸中表达量最高,其次为脂肪及脾脏,而在肌肉及小肠中表达量最低,其中睾丸与肌肉、小肠及肺脏中表达量差异显著（P<0.05）;睾丸组织不同发育时期中,ASB17 mRNA在D120、D150时期表达量达到最高,在D180时期表达量略有下降,其中E90、D1、D30、D60与D90、D120、D150、D180时期差异极显著（P<0.01）;D90与D180时期差异不显著（P>0.05）,与其余时期均差异极显著（P<0.01）;沙子岭猪性成熟期D120、D150、D180 3个时期表达量差异不显著（P>0.05）。本试验成功克隆了沙子岭猪ASB17基因cDNA全长并检测了其在猪不同组织及睾丸组织不同发育阶段表达量,为进一步研究ASB17基因功能奠定基础。     

Balb/c小鼠线粒体转录终止因子3基因克隆及其组织表达分析

旨在获得Balb/c小鼠线粒体转录终止因子3(MTERF3)基因cDNA的序列特征并进行比较分析,揭示该基因的组织特异性表达规律。应用RT-PCR技术克隆Balb/c小鼠MTERF3基因cDNA编码区序列(CDS),采用MEGA6.0软件构建小鼠MTERF3基因系统进化树,并采用Northern blot、RT-qPCR和Western blot技术研究该基因在小鼠大脑、心、脾、肺、肾、肝、骨骼肌和睾丸等8种不同组织中的特异性表达规律。结果显示,Balb/c小鼠MTERF3基因cDNA的CDS序列大小为1239bp,编码412个氨基酸。小鼠MTERF3基因与大鼠MTERF3基因同源性高达91.1%。MTERF3基因mRNA和蛋白质在Balb/c小鼠各组织中均有不同程度的表达。结果表明,成功克隆了Balb/c小鼠MTERF3基因cDNA的完整编码区序列,并揭示了该基因在各组织器官的表达规律,为进一步研究MTERF3基因在实验动物体内的功能奠定了基础。     

microRNA-21和TGFBI基因在猪骨骼肌生长发育中的表达分析

试验旨在研究microRNA-21(miR-21)和转化生长因子β诱导(TGFBI)基因在长白猪骨骼肌中的表达相关性。采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析了miR-21和TGFBI基因在长白成年猪中的组织表达谱,同时比较分析了其在长白猪不同发育阶段(出生前和出生后共28个发育点)背最长肌中的表达相关性。结果表明,miR-21在长白成年猪的各个组织中均表达,且分布相对平衡,在不同发育阶段的背最长肌中呈现波浪式的表达趋势;TGFBI基因在长白猪胚胎期的背最长肌中高表达,在整个背最长肌发育过程中呈现出不同的表达丰度。相关性分析表明,在胚胎期骨骼肌发育过程中,miR-21和TGFBI表达之间为显著的负相关,TGFBI可能是miR-21的调控靶标基因。     

VC对镉染毒小鼠骨骼肌中Musclin基因表达的影响

为探讨VC调控镉中毒小鼠骨骼肌中Musclin基因转录表达规律,用RT-PCR方法研究小鼠Musclin基因表达水平的变化。结果表明,镉对小鼠Musclin基因的表达具有显著抑制作用(P0.05),VC加镉组与加镉组比较,小鼠Musclin基因的表达水平明显升高。表明VC可提高镉中毒小鼠骨骼肌中的Musclin基因的表达水平。     

小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养及鉴定

为了探讨并完善小鼠骨骼肌卫星细胞(satellite cells,SCs)的原代分离培养技术,试验通过对SCs的取材、分离、消化、培养等步骤的改进获得SCs,并应用差速贴壁法进行纯化,从形态学、生长曲线、克隆形成能力、冻存复苏活力、SCs表面标记物的检测、成肌细胞分化能力及RT-PCR鉴定等方面对SCs进行研究。结果表明:分离获得的小鼠骨骼肌SCs呈梭形或纺锤形,细胞饱满且折光性强,生长曲线呈标准的"S"型,克隆形成率高达(56.11±1.73)%,冻存复苏后细胞活率为(96.67±0.87)%,表达desmin、c-Met、Myf5、Myo D等SCs表面特异性标记物,成肌细胞诱导分化后能形成多核肌管并表达成肌细胞表面特异性标记物Mylpf。说明小鼠骨骼肌SCs体外培养获得成功。     

日本血吸虫幼虫巨大致死基因片段的克隆、表达及免疫效果分析

为研究日本血吸虫(Schistosoma japonnicum)幼虫巨大致死基因(Lethal giant larvae)的生物学功能,本研究应用荧光定量RT-PCR分析SjLgL基因在S.japonnicum不同发育阶段的表达情况,构建重组表达质粒pET-SjLgL进行诱导表达,对重组蛋白进行western blot鉴定;重组蛋白刺激免疫动物进行免疫保护试验,检测IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的变化.结果表明,SjLgL基因在S.japonnicum不同发育时期均有表达,成虫期略高于童虫,雄虫高于雌虫.Western blot鉴定结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原性.免疫保护试验结果表明,免疫小鼠分别获得了22.34％的减虫率和55.49％的肝脏减卵率.血清学检测结果显示重组蛋白免疫小鼠后产生了特异性IgG抗体.细胞因子检测结果表明,重组蛋白刺激免疫动物主要诱发产生Th1型的免疫应答.本实验结果表明该重组蛋白在小鼠体内可诱导产生部分免疫保护效果.