豫北及冀南地区4个小麦禾谷孢囊线虫群体的种类鉴定

禾谷孢囊线虫病(Cereal Cyst Nematode,CCN)是世界上为害小麦等禾谷类作物的重要根部线虫病害,许多国家受害严重[1].该病的病原禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae group)是一个复合种群组,包括12个有效种和几个未命名的种,其中发生普遍、危害严重的有燕麦孢囊线虫(H.avenae)、菲利普孢囊线虫(H.filipjevi)、大麦孢囊线虫(H.hordecalis)和麦类孢囊线虫(H.latipons)[1].我国1987年在湖北省天门县首次在小麦上发现禾谷孢囊线虫病,Wang等[2]鉴定病原为燕麦孢囊线虫(H.avenae);后陆续在河南、安徽、山东等多个省份发现该病,病原均为该种线虫.2010年Li等[3]在河南许昌报道发现了菲利普孢囊线虫(H.filipjevi).     

南方、爪哇和花生根结线虫的快速灵敏的PCR鉴定方法

 为了研制南方、爪哇和花生根结线虫快速灵敏的检测和鉴定方法,分别分离了4个南方根结线虫和3个爪哇根结线虫特异性的随机扩增多态性DNA (RAPD)片段。在这些RAPD标记DNA序列的基础上,设计了多对SCAR PCR引物,并用源于国内外的南方、爪哇、花生、北方和象耳豆根结线虫群体验证其扩增特异性和灵敏度。最终确定了3对高效扩增的SCAR引物,它们组合使用可以可靠灵敏地鉴定南方、爪哇和花生根结线虫。3对引物的扩增灵敏度达1/3条的二龄幼虫、雄虫或雌虫,这表明本研究研制的PCR鉴定法可用于生产实践中土样和根样中3种根结线虫快速灵敏的鉴定。     

小麦条锈菌水源11类群的RAPD分析及SCAR标记的建立

鉴于水源11类群近年来一直处于优势地位,为简化其检测手段,本研究利用RAPD技术对该类群的8个主要致病类型进行了多态性分析,以寻找其中主要流行类型的特异性分子标记。结果如下:共筛选出10个碱基随机引物190条,其中94条可得到稳定清晰的扩增图谱,用该94条引物进行RAPD分析,发现各致病类型间遗传变异丰富;以引物S1410扩增得到了水源11-4的特异性DNA条带;以引物S1412和S1304扩增得到了水源11-14的特异性DNA条带;对引物S1304扩增得到的特异性DNA条带回收、克隆和测序,设计了1对19bp/18bp的引物,并成功地将其转化为对水源11-14特异的SCAR标记。以上结果表明,通过规模筛选来寻找小麦条锈菌生理小种的特异性DNA片段,并将其转化为稳定的SCAR标记,有可能建立起中国小麦条锈菌流行生理小种的快速分子鉴定体系。     

甘肃小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3区序列特征及HS-RFLP分析

禾谷孢囊线虫是危害禾谷类作物的重要病原,严重威胁我国小麦主产区的小麦产量和品质.利用通用引物对甘肃、河南、安徽禾谷孢囊线虫群体28S rDNA-D2/D3区和rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定,利用UPG-MA方法分析了甘肃省7个种群、河南1个种群、安徽1个种群的禾谷孢囊线虫群体D2/D3区和ITS区的系统发育关系;用9种限制性内切酶对7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行了RFLP分析.结果表明:中国甘肃的禾谷孢囊线虫rDNA-D2/D3区片段长度约为780 bp,rDNA-ITS片段长度约为1 040 bp.7个甘肃禾谷孢囊线虫群体、1个河南安阳群体、1个安徽蚌埠群体的D2/D3区和新西兰的H.aucklandica群体亲缘关系很近;其ITS区同澳大利亚的H.australis、北京通州的H.avenae(AY148382)的亲缘关系很接近.RFLP分析表明,9种限制性内切酶酶切禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS共产生了22个酶切片段,不同酶切的RFLP分布型在7个种群间没有差异.甘肃省禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区具有高度的保守性,与中国的C型群体相近,但不同于欧洲的A型群体和印度的B型群体.这是首次报道甘肃CCN种群分子特征.     

甘肃小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3区序列特征及ITS-RFLP分析

禾谷孢囊线虫是危害禾谷类作物的重要病原,严重威胁我国小麦主产区的小麦产量和品质。利用通用引物对甘肃、河南、安徽禾谷孢囊线虫群体28SrDNA-D2/D3区和rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定,利用UPG-MA方法分析了甘肃省7个种群、河南1个种群、安徽1个种群的禾谷孢囊线虫群体D2/D3区和ITS区的系统发育关系;用9种限制性内切酶对7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行了RFLP分析。结果表明:中国甘肃的禾谷孢囊线虫rDNA-D2/D3区片段长度约为780bp,rDNA-ITS片段长度约为1040bp。7个甘肃禾谷孢囊线虫群体、1个河南安阳群体、1个安徽蚌埠群体的D2/D3区和新西兰的H.aucklandica群体亲缘关系很近;其ITS区同澳大利亚的H.australis、北京通州的H.avenae(AY148382)的亲缘关系很接近。RFLP分析表明,9种限制性内切酶酶切禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS共产生了22个酶切片段,不同酶切的RFLP分布型在7个种群间没有差异。甘肃省禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区具有高度的保守性,与中国的C型群体相近,但不同于欧洲的A型群体和印度的B型群体。这是首次报道甘肃CCN种群分子特征。     

陕西省小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS区序列与RFLP分析

 采用线虫通用引物TW81和AB28对采自陕西的20个小麦禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行PCR扩增、克隆和测序。利用Mega软件的UPGMA方法分析了陕西省小麦禾谷孢囊线虫群体及其与GenBank公布的近缘种的系统发育关系,结果表明陕西省小麦孢囊线虫群体的rDNA-ITS区片段的长度为1 045 bp,且均为禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）,ITS区序列同源性为99.56%,只有3处碱基存在差异。其ITS区同中国河南（EU106175）、北京（AY148382）、山东（HM370427）的禾谷孢囊线虫H. avenae,澳大利亚的H. australis（AY148395）及俄罗斯的H. pratensis（AY148351）的亲缘关系最为接近。利用8种限制性内切酶Ava Ⅰ（Eco88 Ⅰ）、Alu Ⅰ、Hha Ⅰ（Cfo Ⅰ）、Hae Ⅲ（BsuR Ⅰ）、Hind Ⅲ、Hinf Ⅰ、Rsa Ⅰ和Mva Ⅰ（Bst N1）对20个陕西省CCN群体的ITS区PCR扩增产物进行限制性内切酶谱（RFLP）分析,结果表明8种限制性内切酶酶切ITS-PCR产物后共产生22个酶切片段,20个种群的PCR-RFLP谱型一致,表明陕西省小麦禾谷孢囊线虫是同一个群体且与已报道的中国CCN群体的“C”型一致,有别于欧洲的“A”型群体和印度的“B”型群体。这是首次报道陕西省小麦禾谷孢囊线虫种群的分子特征。     

马铃薯晚疫病菌抗甲霜灵的SCAR标记

建立马铃薯晚疫病菌抗甲霜灵SCAR(sequenced characterized amplified region,序列特征扩增区域)标记,以马铃薯晚疫病菌对甲霜灵高抗菌株HD01-3和对甲霜灵高感菌株DK98-1为亲本,通过无性单游动孢子分离和有性杂交获得菌株HD01-3无性后代群体、菌株DK98-1无性后代群体以及F1代分离群体,以此为试验材料,利用BSA法(bulked segregant analysis,分离群体分组分析法)构建抗感基因池对后代菌系的甲霜灵抗性进行RAPD(random amplified polymorphic DNA,随机扩增多态性DNA)分析。从178条RAPD随机引物中找到一条特异性引物S2054,其可以扩增出一个与晚疫病菌对甲霜灵抗性相关的遗传标记,将该特异条带回收、克隆、测序,发现此标记大小为457bp,根据测序结果设计特异PCR引物,用于扩增抗感基因池,成功地将特异RAPD标记转化为SCAR标记。初步建立了马铃薯晚疫病菌抗甲霜灵SCAR标记,辅助监测晚疫病菌对甲霜灵的抗性。     

山西省中南部小麦上孢囊线虫的发生、分布及种群特征

本研究于2011-2017年对山西省主要市(县)小麦上孢囊线虫的发生与分布进行了较系统的调查研究,从运城、晋城、临汾、长治、晋中、太原等市小麦产区百余个乡镇采集和分离小麦根及根围土壤样品1 131份,其中336份检出有孢囊线虫,检出率为29.7%;运城市和临汾市小麦根及根围土壤样品孢囊检出率高,分别达到42.3%和32.5%,晋中市、长治市、太原市以及晋城市等地区也发现有不同程度的分布。因地区、栽培制度和土壤质地等的不同,土壤中线虫的群体密度也存在较大的差异,白雌虫密度最高的群体分布在运城市的一些地区(每100mL土壤中白雌虫数平均达到101个)。通过形态学鉴定明确山西省小麦上孢囊线虫群体种类较为单一,均为禾谷孢囊线虫Heterodera avenae,未发现我国小麦上另一重要的孢囊线虫种类——菲利普孢囊线虫H.filipjevi。小麦孢囊线虫在山西不同地区的发生和分布情况为山西省针对性地开展小麦上孢囊线虫的综合治理提供了有价值的信息。     

鲁豫皖交界地区四个小麦禾谷孢囊线虫群体致病型鉴定

为了明确鲁豫皖交界地区小麦禾谷孢囊线虫的致病类型,利用23个国际鉴别寄主品种和1个当地小麦品种温麦19对采自山东菏泽、安徽颍上、河南商丘和淮阳的4个小麦禾谷孢囊线虫群体致病型进行了鉴定。4个群体的致病型不同于国际上已命名的16个小麦禾谷孢囊线虫致病型。13个A组鉴别寄主对山东菏泽与安徽颍上群体具有相同的抗性反应,这2个线虫群体属于同一致病型;河南商丘群体与上述2个群体的毒性相似,但大麦寄主KVL191对山东菏泽群体和安徽颍上群体表现为抗病,而对河南商丘群体表现感病;河南淮阳群体的致病谱较宽,明显不同于其它3个群体。对照小麦品种温麦19对4个小麦禾谷孢囊线虫群体均表现感病。     

山东省寄生烟草的孢囊线虫种类鉴定及种内群体间rDNA-ITS-RFLP分析

 在山东省5个植烟县/市采集烟草线虫土壤样本24份,其中10份土样中分离到孢囊线虫的孢囊,对之进行系统的形态学观测。孢囊阴门锥突出,双半膜孔,下桥和泡囊发达,阴门裂长（44.1±3.5） μm,阴门窗长（50.4±4.8） μm、宽（36.6±4.1） μm,下桥长（83.8±4.7） μm、宽（11.0±0.9） μm。利用大豆孢囊线虫特异性引物对分离到的孢囊线虫群体进行了分子鉴定。形态学和分子鉴定结果表明,山东省寄生烟草的孢囊线虫为大豆孢囊线虫Heterodera glycines Ichinohe,1952。对这10个孢囊线虫群体rDNA-ITS区进行了PCR扩增产物用7种限制性内切酶进行酶切和测序比对。发现,所有孢囊线虫群体均能扩增出一条大约1 000 bp大小的片段;用Alu Ⅰ、Bsh 1236 Ⅰ、Hae Ⅲ、Hha Ⅰ 、Mva Ⅰ 、Rsa Ⅰ酶切后,产生的酶切表型均相同;用Ava I酶切后,产生了2种酶切表型。所测孢囊线虫群体与GenBank收录的大豆孢囊线虫序列相似度高达99%以上。     

河南省小麦主产区菲利普孢囊线虫与禾谷孢囊线虫发生情况调查

为了解河南省小麦主产区菲利普孢囊线虫与禾谷孢囊线虫的发生情况,作者分别于2014年和2015年5月通过随机采样调查方法,从商丘、漯河、许昌、新乡、鹤壁、安阳、濮阳、焦作等八地区19个县市采集到61份小麦孢囊线虫(CCN)的根围土壤样品,分析了样品的孢囊密度,发现采自商丘、新乡、鹤壁、安阳和濮阳地区的样品孢囊密度普遍较高,CCN发生比较严重;利用双重PCR技术对样品的CCN种类进行了快速检测鉴定,检测出禾谷孢囊线虫单一侵染的样品有33份;菲利普孢囊线虫单一侵染的样品有9份,与禾谷孢囊线虫复合侵染的样品有19份。菲利普孢囊线虫主要采自商丘、漯河、许昌、新乡、焦作等五个地区,其中商丘地区发生比较普遍。该研究可为河南省小麦的品种布局和孢囊线虫的综合防治提供指导。     

山东省小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS序列特征和基于ISSR的遗传多样性分析

小麦孢囊线虫病(CCN,Heterodera avenae)已成为山东省小麦生产上的一种重要病害,研究CCN群体间和群体内的遗传多样性可以为其综合防治提供理论依据。本实验研究了山东省17地市34个群体的r DNA-ITS区,并采用ISSR分子标记技术对其中10个地市的27个种群做了遗传多样性分析。结果表明,在r DNA-ITS系统发育树中,山东省34个小麦孢囊线虫群体与H.pratensis、H.australis及中国H.avenae群体亲缘关系较近。3个ISSR引物共扩增出31条条带,多态性条带百分率(PPB)为100%。菏泽、潍坊、烟台群体遗传多样性较高,枣庄、威海、淄博、滨州群体遗传多样性相对较低。M antel检测和聚类结果表明,群体间的遗传分化与地理距离并无显著的相关性,AM OVA分析结果显示,在总的遗传变异中17.7%的变异发生在群体间,82.3%的变异发生在群体内。研究结果显示山东省H.avenae具有较高的遗传多样性,且群体间已发生了一定程度的遗传分化。     

小麦对小麦孢囊线虫抗病性研究进展

 由小麦孢囊线虫引起的小麦孢囊线虫病发生分布范围广,防治困难,严重危害我国小麦生产。在我国危害小麦的孢囊线虫主要包括禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)和菲利普孢囊线虫(H. filipjevi)。种植抗病小麦品种是防治小麦孢囊线虫病最经济有效的措施,近10年来,我国科学家制定了小麦孢囊线虫抗性评价标准,测试了我国主推小麦品种和部分引进种质资源对小麦孢囊线虫的抗感性,鉴定到太空6号、新麦11、VP1620和Madsen等抗小麦孢囊线虫的优良材料,利用抗源创制了一系列的抗小麦孢囊线虫种质材料,从组织细胞学、基因组和转录组等解析了小麦抗孢囊线虫的机制。本文主要从小麦孢囊线虫致病型分化、抗性评价、抗性基因鉴定、抗性机制解析和抗病基因利用等方面进行综述。     

小麦孢囊线虫病生防真菌08F04菌株的鉴定及防效测定

小麦禾谷孢囊线虫病已成为我国黄淮麦区的重要病害,目前生产上尚缺乏有效的防控方法。菌株08F04是作者从禾谷孢囊线虫孢囊上分离的1株寄生真菌。本研究通过形态学和分子生物学方法,将其鉴定为球孢白僵菌Beauveriabassiana（Bals．）Vuill。2011和2012年对该菌株进行了盆栽和田间防效试验,菌株08F04麦粒砂培养物6％（w／W）土壤处理的盆栽试验孢囊减退率分别达到65．03％和50．95％;田间试验中,菌剂08F0420g·m-2沟施处理土壤,2011年在许昌和荥阳的孢囊减退率分别为58．28％和32．13％,2012年分别达到58．49％和44．50％。结果表明,菌株08F04是防治小麦禾谷孢囊线虫病具有较大潜在开发价值的生防菌株。     

Genetic relationships and isozyme variability in the Heterodera avenae complex determined by isoelectrofocusing

Isozyme variability was assessed among the principal species of the cereal cyst nematode complex to complete and enhance the information provided by classical nematode systematics, in order to clarify inter- and intraspecific relationships within this complex. Twenty populations of cereal cyst nematodes ( Heterodera avenae , H. filipjevi , H. latipons and H. mani ) were compared by means of five different isoenzymatic systems (esterase, malate dehydrogenase, phosphoglucoisomerase, phosphoglucomutase and superoxide dismutase) using isoelectrofocusing (IEF) on the electrophoretic separation. The results are in agreement with previous morphological and biochemical characterizations, which established genetic diversity between the Gotland strain and H. avenae and identified the Gotland strain with H. filipjevi . Populations from Israel, all included in the H. avenae group, exhibited well-defined intraspecific dissimilarity. The highest degree of polymorphism was found in the H. avenae group for all five enzymatic systems studied. The H. mani population was also included in the H. avenae group by these isozyme analyses. Malate dehydrogenase, phosphoglucoisomerase and phosphoglucomutase isozymes, fractionated for the first time by IEF in the cereal cyst nematode complex, displayed a higher level of polymorphism than using conventional electrophoresis. Isoelectric focusing has proved to be a useful tool for detecting genetic diversity within and among species of the cereal cyst nematode complex and for taxonomic purposes.     

河南郑州小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因ITS序列和RFLP分析

 采用PCR技术对河南郑州禾谷孢囊线虫群体的核糖体基因(ribosomal DNA,rDNA)内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers,ITS)进行扩增,获得片段长度约为1040bp。利用UPGMA方法分析了河南郑州禾谷孢囊线虫群体与近缘种的系统发育关系,结果表明:中国Heterodera avenae群体,H.australis和H.pratensis亲缘关系很近。8种限制性内切酶(Restriction Enzyme,RE)酶切禾谷孢囊线虫ITS的扩增产物,其中HindⅢ、AvaⅠ不能酶切PCR产物;Alu Ⅰ酶切PCR产物,获得560bp和480bp2个片段;RsaⅠ和Hinf Ⅱ酶切后分别得到3个片段(700、320、20bp和820、180、40bp);CfoⅠ是3个酶切位点(740、150、110、40bp);HaeⅢ和MvaⅠ能分别清晰地观察到3个片段(420、350、180bp和400、340、280bp),但有微小片段无法清晰观察到。9个种群所得RFLP图谱一致,说明郑州禾谷孢囊线虫群体可能是同一种群且不同于欧洲群体(typeA)和印度群体(typeB)的C型。     

青海、陕西部分地区禾谷孢囊线虫 rDNA-ITS-RFLP的特征分析

 采自我国青海、陕西等省地11个寄生小麦的孢囊线虫群体经形态学鉴定为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)。用PCR技术扩增获得的rDNA-ITS片段长度约为1 060 bp。用Hinf Ⅰ、Taq Ⅰ、Hpa Ⅱ、Hae Ⅲ、Pst Ⅰ、Alu Ⅰ 等6种限制性内切酶酶切ITS扩增产物;青海10群体YBT10A、HY65A、HY61B、ZHZ162B、HY5B、HHX8A、GH132A、HY92A、HY127B、DT142A 的6个酶的RFLP图谱完全一致;陕西YL4A群体的Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ和Hpa Ⅱ酶切结果与青海群体的上述3种酶切结果相同,但Alu Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切结果比青海孢囊线虫群体都多1条1 060 bp片段,而YL4A群体Taq Ⅰ酶切结果较为复杂。对比已知Avenae组成员RFLP图谱,青海群体与北京房山H.avenae群体的RFLP图谱一致;而陕西YL4A的Alu Ⅰ图谱与H.avenae法国群体一致,Pst Ⅰ和Taq Ⅰ却与Avenae组成员已知酶切结果均不一致。河南3个禾谷孢囊线虫群体除Taq Ⅰ酶切结果比青海CCN群体多1条520 bp片段以外,其他5种酶的RFLP都一致,而与澳大利亚的禾谷孢囊线虫H.avenae群体的RFLP图谱一致。     

Identification of <Emphasis Type="Italic">Pratylenchus thornei</Emphasis>, the cereal and legume root-lesion nematode,based on SCAR-PCR and satellite DNA

Two different molecular tools for the diagnosis of the cereal and legume root-lesion nematode Pratylenchus thornei were developed. A randomly amplified DNA (RAPD) fragment specific to P. thornei was identified. After sequencing the fragment, longer primers were designed that complement the terminal sequences of the RAPD fragment, and this pair of specific primers was used to amplify the sequence-characterized amplified region (SCAR). Using the developed pair of SCAR primers, the SCAR fragment specific to P. thornei was easily amplified with DNA extracts obtained from different life stages of the nematode. The described SCAR-PCR-based assay has the potential to be optimized for routine practical diagnostic tests. In addition, the use of a species-specific satellite DNA sequence to distinguish P. thornei from other Pratylenchus spp. is discussed.