转cry1Ab/cry2Aj、cry1Ab/vip3DA玉米对棉铃虫、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗虫性评价

为评估转cry1Ab/cry2Aj、cry1Ab/vip3DA玉米对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)、甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)和斜纹夜蛾Prodenia litura(Fabricius)的抗虫性,在室内测定了3个转cry1Ab/cry2Aj玉米品系和1个转cry1Ab/vip3DA玉米品系对3种害虫幼虫存活和生长发育的影响,研究了该系列Bt玉米不同组织器官对害虫的杀虫活性和控制效果。结果显示,棉铃虫初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片96h后死亡率为87.50%~90.00%,取食花丝和雌穗的幼虫96h后几乎全部死亡;甜菜夜蛾初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片、花丝和雌穗168h后死亡率为22.50%~68.33%,幼虫的生长发育受到明显抑制,体重抑制率达85.00%~95.00%;斜纹夜蛾初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片、花丝和雌穗96 h后死亡率显著高于非转基因亲本对照,168h后幼虫死亡率达90.00%以上。研究表明,转cry1Ab/cry2Aj和cry1Ab/vip3DA玉米品系对棉铃虫和斜纹夜蛾的初孵幼虫表现出较好的抗性,可以作为转多基因抗虫玉米育种的备选材料。     

Cry1Ac杀虫蛋白对甜菜夜蛾飞行能力的影响

转Bt基因作物上害虫取食Bt杀虫蛋白后存活并羽化的成虫飞行能力对于其飞离Bt作物,寻找庇护所中敏感个体进行交配、产卵,从而稀释抗性基因频率,实现“高剂量/庇护所”抗性治理策略具有重要意义。本文对取食含不同浓度Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料的初羽化（未取食补充营养）甜菜夜蛾飞行能力进行了测试,结果表明,幼虫取食含25、50、100 μg/g和200 μg/g Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料存活并羽化的成虫飞行距离、飞行速度和飞行时间均差异显著（p<0.05）。取食含较低浓度Cry1Ac杀虫蛋白（25 μg/g和50 μg/g）的人工饲料有促进成虫飞行的倾向,尽管与取食不含Cry1Ac杀虫蛋白的对照相比,成虫飞行距离、飞行速度和飞行时间均未达到显著增加的水平,但强飞行个体比例明显增加。随着饲料中Cry1Ac杀虫蛋白浓度的升高,羽化的成虫飞行能力显著下降。雄蛾飞行能力下降的程度比雌蛾更加明显。这些数据为转Bt基因作物上迁飞性害虫的种群动态规律及其潜在的抗性治理策略提供了科学依据。     

Cry1Ac和Cry2Ab蛋白对大草蛉生长发育及酶活力的影响

为明确转Cry1Ac和Cry2Ab基因棉花对大草蛉的影响,运用Bt蛋白与人工饲料混合的方法,以大于转基因棉花叶片中蛋白含量20倍的剂量饲喂大草蛉初孵幼虫,初步研究了Cry1Ac和Cry2Ab对大草蛉生物学参数和消化酶、解毒酶活性的影响。结果表明：取食含Bt蛋白饲料的大草蛉幼虫的发育历期、体重、蛹重、成虫体重、羽化率等生物学参数与对照相比均没有显著差异;在大草蛉幼虫体内可以检测到含量较高的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白,分别为974.92~1 282.39 ng/g鲜重和5 592.62~6 082.92 ng/g鲜重,而在大草蛉成虫体内检测到的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白含量非常低,分别为0.29~0.39 ng/g鲜重和50.34~56.71 ng/g鲜重;取食含Bt蛋白的饲料对大草蛉幼虫的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、氨肽酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性有一定的影响,但对大草蛉成虫影响与对照差异不显著。表明大草蛉取食含Bt蛋白的人工饲料后,虽然体内可以检测到一定含量的Bt蛋白,但对大草蛉的生长发育并没有显著的直接不利影响。     

取食转Bt基因棉对斜纹夜蛾幼虫存活的影响

以常规棉泗棉3号为对照,测定了取食转Bt基因棉GKl2的不同部位(花、蕾、铃和不同空间部位叶片)10d对斜纹夜蛾初孵幼虫存活率的影响。结果表明：棉花品种和植株部位对斜纹夜蛾幼虫存活率均产生显著影响,但两者之间没有交互作用。取食Bt棉顶部新叶(倒1叶)、中上部展开叶片(倒3叶和倒6叶)和蕾10d的斜纹夜蛾幼虫,其存活率与对照没有显著差异。取食Bt棉下部成熟叶片(倒14叶)4d后,幼虫存活率方显著低于对照。取食Bt棉花朵的幼虫初期(≤4d)存活率低于对照,但随着对照死亡率的增加,6～10d内两者差异不再显著。取食Bt棉棉铃的幼虫存活率始终低于对照,但两者差异基本不显著。根据GKl2对棉铃虫和斜纹夜蛾杀虫效果的比较,初步探讨了斜纹夜蛾为害趋势加重的原因。     

斜纹夜蛾取食Cry1Ca蛋白后中肠组织病理变化

Cry1Ca对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾等多种鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性，它在转多种Bt蛋白基因策略中，可用于扩大杀虫谱，并可用于当前Bt蛋白的抗性治理，是极具潜力蛋白之一。为明确Cry1Ca对斜纹夜蛾的作用机制，我们利用透射电镜观察了幼虫取食Cry1Ca后中肠组织的病理变化。结果表明斜纹夜蛾取食含Cry1Ca蛋白的饲料2 h后中肠组织开始表现明显的病理变化，且随取食时间的增加病变越来越严重。具体表现为：中肠细胞微绒毛肿胀、扭曲、断裂和脱落；细胞核拉长或畸形、核膜模糊、染色质不均匀或聚集；线粒体变形、空泡化和内脊模糊不清；内质网杂乱无章、肿胀变形和数量变少。研究结果可为更好地利用Cry1Ca防治斜纹夜蛾提供理论依据。     

转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫的抗性

为明确转Bt基因玉米对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的抗性,采用室内玉米离体组织生测法测定取食转Cry1Ab-ma基因抗虫玉米CM8101心叶、花丝和籽粒后草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫存活数量、存活幼虫的体重、蛹重、化蛹和羽化等参数,分析转Cry1Ab-ma基因抗虫玉米CM8101三种组织对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫的抗性。结果显示,转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101心叶可完全杀死草地贪夜蛾1龄幼虫,2龄幼虫有存活,存活率为10.0%,但不能化蛹与羽化;花丝可杀死大部分草地贪夜蛾1龄幼虫,存活率为3.3%,并阻断其生活史,但对2龄幼虫杀伤力弱,存活率为73.3%,存活幼虫化蛹率和羽化率分别为20.0%和13.3%;籽粒可完全杀死草地贪夜蛾1龄幼虫,2龄幼虫有存活,存活率为13.3%,有少量可化蛹,化蛹率为3.3%、有少量羽化,羽化率为3.3%。表明转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101在短期内对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫有良好的控制作用。     

Cry2Ab杀虫蛋白对小地老虎幼虫致死效果及体内酶活性的影响

为治理小地老虎的危害,研究了Bt杀虫蛋白对小地老虎幼虫的控制作用.室内生物测定结果表明,Cry2Ab杀虫蛋白对小地老虎初孵幼虫的致死效果高于Cry1Ac杀虫蛋白.取食含有Cry2Ab杀虫蛋白人工饲料的小地老虎幼虫体内的中肠总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性高于对照,当人工饲料中Cry2Ab杀虫蛋白含量达到12μg/g时,小地老虎幼虫中肠氨肽酶活性显著升高;而取食含有Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料的小地老虎幼虫中肠蛋白酶活性无显著变化.此外,小地老虎幼虫取食含有Cry2Ab杀虫蛋白的人工饲料后,体内谷胱甘肽-S-转移酶活性显著升高,而取食合有Cry1Ac杀虫蛋白的人工饲料后其变化不明显.     

四种Bt毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫毒力测定及中肠组织病理学变化

为更好地了解苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis毒素蛋白对二点委夜蛾Athetis lepigone的毒力以及作用机理,通过饲喂含有Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab和Vip3Aa四种不同Bt毒素蛋白饲料,测定Bt毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫的毒力,并观察取食4种毒素蛋白后幼虫中肠组织的病理学变化。结果显示,二点委夜蛾幼虫取食毒素蛋白后72 h,Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫的杀虫活性较高,校正死亡率为84.7%和76.4%;Vip3Aa和Cry2Ab毒素蛋白的毒力较弱。二点委夜蛾幼虫取食4种Bt毒素蛋白后,中肠柱状细胞微绒毛脱落,杂乱地分散在肠腔内,杯状细胞变形和腔内微绒毛脱落,线粒体和内质网等变形破裂,细胞核的核膜消失、核质凝聚和形状发生变化,经Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白处理后中肠细胞的病变症状和速度明显高于Cry2Ab和Vip3Aa毒素蛋白处理。表明Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫杀虫活性较高,显著高于Cry2Ab和Vip3Aa毒素蛋白,且对其中肠细胞的破坏作用也较强。     

转基因棉和常规棉叶片对抗Cry1Ac近等基因系棉铃虫生长发育的影响

利用室内饲喂法,以抗Cry1Ac近等基因系棉铃虫为材料,比较转基因棉花33B和SGK321及其对照亲本DP5415和石远321对抗、感棉铃虫生长发育的影响。结果表明,抗性棉铃虫在取食常规棉叶后表现出一定的适合度代价。取食DP5415和石远321两种常规棉花后,抗性品系棉铃虫的幼虫存活率显著低于敏感品系,取食33B和SGK321两种转基因棉花的抗性棉铃虫,不仅其幼虫存活率显著高于敏感品系,而且致死中时间也比敏感品系延长。取食9天后,抗性品系在常规棉花石远321和DP5415上发育到3龄和4龄幼虫的比例显著低于敏感品系,取食33B和SGK321转基因棉花的抗性品系发育到3龄幼虫的比例均显著高于敏感品系。抗性品系在常规棉上的蛹重均显著低于敏感品系,部分取食转基因棉花的抗性品系棉铃虫可以化蛹,而敏感品系不能在转基因棉花上化蛹。     

转Bt基因玉米(瑞丰125、DBN9936、DBN9978)对亚洲玉米螟的抗虫效果研究

评价转Bt基因玉米对靶标生物亚洲玉米螟的杀虫作用是转基因玉米研发的重要一环。本文采用室内生测法对3种转Bt基因抗虫玉米‘瑞丰125’(表达Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白),‘DBN9936’‘DBN9978’(表达Cry1Ab杀虫蛋白)对亚洲玉米螟敏感品系ACB-S及抗Cry1Ab品系ACB-AbR、抗Cry1Ac品系ACB-AcR、抗Cry1F品系ACB-FR、抗Cry1Ah品系ACB-AhR、抗Cry1Ie品系ACB-IeR的杀虫活性进行测定,同时采用心叶期和抽丝期人工接虫法进行田间抗虫效果鉴定。结果表明,取食3种Bt玉米的ACB-S幼虫, 3 d死亡率100%,而取食对照常规玉米3 d存活率100%。取食3种Bt玉米的5个抗性品系幼虫除ACB-AbR和ACB-AcR有2%~6%的个体存活4~5 d, 6 d死亡率也达到了100%,其余品系均在3 d全部死亡,而取食对照玉米5~6 d的死亡率仅为4%~14%,差异显著。田间心叶期食叶级别及穗期活虫数、雌穗被害和茎秆被蛀等为害等级说明3种Bt玉米高抗亚洲玉米螟。明确了‘瑞丰125’‘DBN9936’和‘DBN9978’对亚洲玉米螟有很高的杀虫活性和田间防治效果。5个Bt蛋白抗性亚洲玉米螟品系幼虫在常规玉米上显示一定的适合度劣势。     

我国棉铃虫对Bt蛋白Cry1Ac抗性现状及分子机制研究进展

棉铃虫Helicoverpa armigera是一种全球性的重要农业害虫,主要为害棉花、玉米和大豆等作物。长期种植单价Bt棉花（表达Cry1Ac蛋白）会使棉铃虫田间种群承受单一、持续的选择压力,必然会导致棉铃虫对Cry1Ac的抗性发生演化。该文概述我国棉铃虫田间种群对Cry1Ac的抗性现状、自然庇护所对棉铃虫Cry1Ac抗性演化的延缓作用以及棉铃虫对Cry1Ac抗性的遗传多样性,并对今后我国关于棉铃虫Bt抗性的治理对策进行了展望。     

The selective feeding of cotton bollworms (Helicoverpa armigera) on transgenic and non-transgenic cotton leaves from consecutive cultivation fields

Abstract

The aim of this study was to determine whether target-insects selectively feed on transgenic or non-transgenic crops after consecutive cultivation in fields. We sampled leaves from insect-resistant single-transgenic cotton (expressing Cry1Ac gene), pyramided-transgenic (expressing Cry1Ac and CPTI genes) and conventional cotton that were consecutively cultivated for three years in a field. Cotton bollworm (Helicoverpa armigera) collected from the cotton field was reared and its next-generation larvae were fed the three types of cotton leaves in a laboratory. The leaf area damaged by the cotton bollworm larvae was not significantly different among single-transgenic, pyramided transgenic and conventional cotton leaves. There was no significant difference found in the leaf damage among the combination groups of the three cotton types. The survival rate of the bollworms was comparable among the combination groups. The results demonstrated that the cotton bollworms did not selectively feed on transgenic or non-transgenic cotton leaves after consecutive cultivation, which may be due to the resistance evolution of the target-insects and decreased Bt content in transgenic cotton leaves.     

转基因棉花对草间小黑蛛生长发育及其相关酶活性的影响

为评估转基因抗虫棉花对天敌的安全性,用取食常规棉(中棉所49)、单价棉(中棉所45)和双价棉(2009002)的棉铃虫幼虫饲喂草间小黑蛛,采用酶联免疫和分光光度计法研究转基因抗虫棉对草间小黑蛛生长发育及其相关酶活性的影响。结果显示,与常规棉花相比,单价棉花使草间小黑蛛4～5龄幼虫发育历期显著延长,对其余龄期影响不显著;双价棉花对草间小黑蛛1～3龄幼虫发育历期影响不显著,4～5龄幼虫发育历期显著延长,6龄后大量死亡。2种转基因棉对草间小黑蛛体重及其体内外源蛋白含量的影响均不显著,除谷胱甘肽-转移酶和单价棉处理的过氧化物酶外,对其它相关酶活性亦无显著影响。     

甜菜夜蛾中肠碱性磷酸酶alp2基因的克隆、表达及功能分析

为探究甜菜夜蛾Spodoptera exigua中肠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase protein 2,ALP2)是否为Cry1Ac杀虫蛋白的受体,采用同源克隆和RACE技术克隆了编码alp2基因的完整c DNA序列,利用荧光定量PCR比较了甜菜夜蛾幼虫中肠不同龄期ALP2表达量的差异,利用Ligand blot方法检测了中肠ALP2与Cry1Ac杀虫蛋白的结合。结果表明,alp2基因序列全长1 629 bp(Gen Bank序列号为KP420013),编码542个氨基酸,预测在氨基酸序列N端包含1个由21个氨基酸组成的信号肽,在C端存在1个GPI修饰的锚定位点,且在整个氨基酸序列中存在多个糖基化修饰位点。在整个甜菜夜蛾幼虫期均有ALP2表达,但不同龄期的表达量差异显著,1龄幼虫期表达量最低,4龄幼虫期最高。Ligand blot方法检测结果表明原核表达的ALP2片段与活化的Cry1Ac杀虫蛋白可以结合。研究表明,甜菜夜蛾中肠的ALP2可能是Cry1Ac的受体之一。     

棉铃虫四个丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆与表达分析

为明确棉铃虫Helicoverpa armigera丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,serpin）的种类及其表达特性,利用PCR技术克隆棉铃虫的serpin基因,使用生物信息学软件预测其结构并进行系统进化分析,采用实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR,RT-qPCR）技术比较serpin基因在棉铃虫不同发育阶段和组织中的表达量及取食Cry1Ac后其表达量的变化。结果表明,共获得serpin-a、serpin-b、serpin-c、serpin-e四个棉铃虫serpin基因,全长为1 119~1 254 bp,编码373~418个氨基酸,均包含一段具有反应中心环的保守结构域,且与斜纹夜蛾Spodoptera litura、草地贪夜蛾S.frugiperda等鳞翅目昆虫serpin的同源性较高。serpin-a和serpin-e在棉铃虫4龄幼虫期的表达量最高,serpin-b和serpin-c分别在成虫期和蛹期表达量最高。serpin-a在中肠和围食膜中表达量最高,serpin-b在头、中肠和表皮中表达量最高,serpin-c在头部表达量最高,serpin-e在中肠和血淋巴中的表达量显著高于其他组织。棉铃虫取食低浓度Cry1Ac后,中肠的serpin-b和serpin-e的表达量显著增加。推测不同serpin基因在棉铃虫不同发育时期和组织中可能发挥不同的作用,其中serpin-b和serpin-e可能参与棉铃虫对Cry1Ac的解毒过程。     

棉铃虫V-ATP酶亚基A基因克隆及表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera液泡型ATP酶(vacuolar-type proton ATPase,V-ATP酶)亚基A对棉铃虫生长发育的影响及其在Bt杀虫机制中的作用,采用PCR结合RACE技术克隆了棉铃虫V-ATP酶亚基A基因序列,通过实时荧光定量PCR技术测定了其在棉铃虫不同发育历期和幼虫肠道不同组织中的表达量;并比较了4龄幼虫取食含Cry1Ac蛋白饲料后中肠中该基因表达量的变化。结果显示,棉铃虫V-ATP酶亚基A基因全长2 578 bp(Gen Bank登录号KP090287),开放阅读框1 863 bp,编码621个氨基酸。V-ATP酶亚基A高度保守,不同物种间氨基酸序列同源性大于90%。V-ATP酶亚基A在棉铃虫整个生育期都有表达,在4龄幼虫体内表达量最高,是卵期的3.00倍;在幼虫肠道不同组织中,中肠中表达量最高,是后肠中的2.65倍。4龄棉铃虫幼虫取食含Cry1Ac蛋白的人工饲料后,中肠V-ATP酶亚基A的表达受到抑制,表达量为对照的0.39~0.81倍。表明V-ATP酶亚基A基因可能参与棉铃虫的生长发育和代谢过程,并可能与抵御Cry1Ac的毒杀作用有一定关系。