龙眼APETALA1(AP1)同源基因的克隆与序列分析

根据植物APETALA1(AP1)同源基因的高度保守性,设计合成一对特异引物,从龙眼基因组DNA中扩增出一条长400bp左右的基因片段,插入到pMD-T载体中。测序后分析表明,扩增得到了龙眼AP1同源基因片段。该片段序列包含两个内含子(长96bp和165bp),编码区编码36个氨基酸。与其它植物AP1同源基因的相应区域氨基酸序列具有较高的同源性,其中与花椰菜AP1基因同源性高达91%,与欧亚种葡萄、苹果、柑橘、枇杷的AP1基因同源性都在80%以上。     

西瓜NBS类同源序列的克隆与分析(摘要)

R基因产物是植物抵抗病原物侵害的重要组成部分,在目前已经发现的植物抗病基因中,NBSLRR类占了绝大多数,在植物抗病基因中占有重要地位。NBS结构域是NBS-LRR基因编码蛋白中最保守的部分,含有8个保守基序,包括P-loop(又称Kinase-1a)、Kinase-2a、Kinase-3a和GLPL疏水结构域等。对西瓜NBS的克隆和分析将有助于筛选西瓜抗病基因及各种抗病基因的分子标记,而且通过对西瓜NBS的结构、表达和调控的研究,将有助于深入阐释西瓜的抗病机制。以根结线虫抗病西瓜材料‘红籽瓜’和感病西瓜材料‘ZDPI0006’为试材,根据西瓜NBS保守区设计简并引物及特异引物50对,根据葫芦科抗病基因序列在西瓜基因组数据库搜索同源序列,并以此设计特异引物1对,分别提取西瓜叶片g DNA和RNA并反转录成c DNA,采用PCR扩增西瓜抗病基因同源序列,琼脂糖电泳检测回收目标条带,克隆测序后结果提交到Gene Bank进行序列比对,提交至Pfam在线分析蛋白质功能,利用Clustalx与其他物种的抗病基因进行同源性分析,利用dnasp等软件进行序列多态性分析。结果表明,49对引物中共有43对引物在抗、感材料中成功扩增到目的片段,其中有4对引物在抗感材料中扩增出差异片段,简并引物W856在抗、感材料间扩增到一条约750bp的差异片段,测序结果提交至NCBI比对显示其与预测的黄瓜抗TMV的N端类似蛋白存在88%的同源性,根据葫芦科抗病基因在西瓜基因组数据库搜索同源序列设计的特异引物W6580在抗、感材料间扩增出大小一致的约800bp的片段,测序结果提交至NCBI比对,结果显示其与预测的黄瓜抗线虫类似蛋白存在90%的同源性,dnasp软件分析显示抗、感材料之间存在4个单核苷酸多态性位点。     

果树R基因同源序列克隆的初步研究

用2对根据已知植物抗病基因(R基因)编码的蛋白质的NBS保守区而设计的特异简并引物,对荔枝、龙眼、芦柑、柚子及银杏的基因组DNA进行体外扩增.其中一对引物(P1/P2)在荔枝、龙眼、芦柑和柚子中获得的扩增产物均表现为一条大小约500bp的明亮谱带,而银杏扩增产物的亮带则在约750bp处,且弥散在400 ～ 1000bp之间.另一对引物在荔枝、龙眼、芦柑和柚子中没有特异扩增带,而在银杏中获得了一条400 ～ 600bp的较亮的宽带.将荔枝、龙眼、芦柑和柚子的500bp特异扩增带以及银杏的400 ～ 600bp条带回收克隆,并分别筛选几类阳性克隆进行测序.共获得15个片段的序列.经比较发现,来自荔枝、龙眼、芦柑和柚子的12个片段均属于NBS-LRR类抗病基因同源序列(RGA),与已知R基因相应区段的氨基酸序列的一致性为15.5% ～ 47.1%;而3个来自银杏的片段均不是RGA,其中1个与反转录酶有较高的同源性,另2个在GeneBank中没有找到同源序列.该结果显示,应用同源扩增技术克隆果树RGA是可行的,但银杏作为古老的裸子植物,其抗病基因的结构与现代物种可能有很大差异.     

利用RAPD分析鉴别荔枝的焦核突变体

 采用随机扩增多态性DNA 方法, 对荔枝品种三月红、怀枝和它们的9 个自然焦核突变体进行了多态性分析。经500 个随机引物的筛选, 发现仅1 个引物OPL212 能在品种与突变体间扩增出多态性片段,其中2个焦核怀枝的特异片段大小为1 645 bp, 4 个焦核三月红的特异片段大小为722 bp , 初步认为这两条特异片段可能与荔枝的焦核基因相关。     

砂梨扩展蛋白基因cDNA克隆及全序列分析

设计植物EXP扩展蛋白简并引物,以砂梨果实cDNA为模板,克隆得到EXP基因cDNA片段,该片段长465 bp。根据该片段序列,分别设计2条5’和3’末端扩增的特异引物,利用RACE技术,获得了该片段的5’端和3’端序列。用DNAMAN5.22软件对3个序列进行拼接和分析,获得了该基因的cDNA全长,命名为Pyp-EXP。该cDNA全长为1 395 bp,5’端起始密码子ATG始于72 bp,3’端终止子TAG止于830 bp,Ploy+(A)从1 363～1 395 bp。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EF602031。Pyp-EXP核苷酸序列有一个759 bp完整的开放阅读框,编码区与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃的同源性分别为96%,96%,94%和86%;该cDNA推导编码252个氨基酸,含有1个组氨酸(His_Phe_Asp,HFD)功能域,与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃中相应序列同源性分别为98%,97%,95%和93%。该基因的克隆为研究扩展蛋白的时空表达及其在果实发育和成熟过程中的作用奠定了基础。     

月季CBF 转录因子基因的克隆及表达分析

 根据CBF（C-repeat binding factor）AP2/EREBP 保守区设计1 对简并引物,采用PCR 方法对月季‘寒锦4 号’（Rosa hybrida‘Hanjin 4’）CBF 转录因子基因中间片段进行克隆;再根据中间片段区域设计了两对特异引物,采用反向PCR 方法对该基因的5'和3'端的序列进行克隆,将中间片段与反向PCR 产物拼接得到CBF 基因全长序列,命名为RhCBF,GenBank 注册编号为EF582843;该基因序列长758 bp,ORF 为603 bp,编码200 个氨基酸;同时,根据基因序列设计1 对特异引物,利用荧光定量PCR分析月季CBF 在不同逆境胁迫下的表达情况。结果显示低温和盐均可以诱导RhCBF 的表达,而干旱处理不能诱导其表达。     

白菜Pol胞质雄性不育系和保持系蕾期基因表达差异的SRAP分析

将SRAP技术用于基因差异表达研究, 用30对SRAP引物组合对白菜Pol胞质雄性不育系和保持系的cDNA进行扩增, 得到两条特异片段BcCMS1、BcCMS2。对特异片段克隆测序分析后发现, BcCMS1与大白菜细胞生成相关染色体的19个氨基酸有63%的相似性, BcCMS2与芥蓝抑制开花的基因FLC3部分碱基有88%的相似性。这两个序列在GenBank中的登录号分别为DQ914921、DQ914922。此结果显示在胞质雄性不育中细胞质基因改变了部分核基因的表达。     

不同性别黄瓜EIN3基因片段克隆及序列分析

根据GenBank植物EIN3基因家族的保守序列设计了1对引物,以纯雌性系、强雌性系、雌雄同株系、两性花株系的不同性别黄瓜总DNA为模板,经PCR扩增得到6个725 bp左右的基因片段并进行序列比较分析。结果表明,不同性型黄瓜EIN3基因编码区有14个SNPs,平均51 bp发现1个SNP,检出率为1.96 %;其中有3个酶切位点突变,且发现编码区的SNPs有8个突变导致了氨基酸改变;初步建立了1个RFLP-BfmⅠ的酶切体系,发现在两性花株WI1983H中出现特异的酶切条带。     

沙地葡萄茎痘相关病毒RT-PCR检测

为建立快速、灵敏、可靠的沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)检测方法,以总RNA为模板,采用2组GRSPaV特异性引物对29个品种52株葡萄样品进行RT-PCR检测,并对扩增产物进行了测序和分析。结果表明,从20个品种25株葡萄样品中检测到GRSPaV,平均带毒株率为48.1%。外壳蛋白基因片段引物F1/R1从25个样品中扩增到905bp的特异片段,复制酶基因片段引物F2/R2从20个样品中扩增到498bp的特异片段,表明GRSPaV外壳蛋白基因比复制酶基因更加保守,RT-PCR检测时采用F1/R1则更为适宜。PCR产物测序结果与GenBank中登录的GRSPaV序列比较,同源性为97.90%～98.11%。     

成熟猕猴桃果实中乙烯受体基因Ad-ETR2的克隆与序列分析

在分析GenBank登录的植物乙烯受体家族氨基酸和核苷酸保守区序列基础上,设计简并引物,通过RT-PCR扩增出1个657bp大小的cDNA片段,测序结果表明,该片段穴Ad-ETR2雪编码219个氨基酸,它与其它植物乙烯受体核苷酸同源性为79.9%～86.5%,氨基酸的同源性为85.4%～95.9%,序列分析推断该基因片段可能是与番茄Le-ETR1结构和功能类似的一类乙烯受体。     

黄瓜抗病基因类似序列( RGA) 的同源性分析和Southern鉴定

 使用ClustalW和DNAMAN 3.0分析了本实验室克隆的15个黄瓜抗病基因类似序列(RGA)之间以及与烟草的N 基因、亚麻的L6基因和拟南芥的RPS2基因之间的同源性, 并对这些RGA进行了PCR和Southern验证与分析。结果表明: 15个黄瓜RGA中, 核苷酸序列同源性最高的是CsRGA2、CsRGA4和CsRGA5, 其次是CsRGA6、CsRGA7、CsRGA8和CsRGA9, CsRGA1和CsRGA3也存在较高的同源性; 其余的RGA同源性较低。在氨基酸序列上也表现了相同的特征。与N、L6和RPS2等抗病基因的产物之间同源性最高46% , 最低22%。根据核苷酸序列设计了15对特异引物, 用PCR方法验证了所有黄瓜RGA的存在, 其中CsRGA3在黄瓜品种间表现出多态性。利用特异引物PCR方法合成了15个黄瓜RGA的地高辛探针, 与EcoRⅤ酶解的黄瓜‘215’、‘129’和‘L18’的基因组DNA进行Southern杂交, 证实了各个RGA在基因组上的存在, 同时发现, CsRGA9、CsRGA11～CsRGA15都是多拷贝,CsRGA3是单拷贝, 其余为双拷贝。     

基于SRAP的三倍体无子西瓜品种指纹分析和杂种纯度鉴定

为了解三倍体无子西瓜品种SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)扩增特点及其在三倍体西瓜杂种纯度鉴定中的适应性,利用SRAP引物组合对当前生产上推广的9个三倍体无子西瓜品种进行了指纹分析和杂种纯度鉴定研究。结果表明,1)30对引物组合中筛选出多态性引物组合24对,共产生109条多态性带,平均每对引物组合产生多态性带4.5条,单个组合的多态性比率在12.5%～80%。2)结合多对SRAP引物组合,可以鉴别不同品种。3)在黑蜜5号及其父母本的指纹分析中,发现有1对引物组合(ME4/EM3)在黑蜜5号杂交种上扩增出了特异的条带,可以区分母本和杂交种,试验证明该引物组合能够用于黑蜜5号的杂种纯度鉴定。     

扁桃PGIP基因的克隆及其序列分析

以晋扁一号扁桃(Prunus dulcis Miller.)基因组DNA为模板,用已登录的扁桃PGIP(多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)基因保守序列设计引物进行PCR扩增,得到了6个PGIP基因片段并克隆到PBS-T载体中。根据测序结果分析,可利用其中的3个片断,分别命名为PdPGIP1(717bp),PdPGIP2(864bp)和PdPGIP3(796bp),与公共数据库中的序列相似性比较,其中PdPGIP2和PdPGIP3各包含2个外显子和1个内含子,内含子符合GT-AG规律。其核苷酸序列分别与Genbank中登录的3个扁桃以及桃(P.persica Linn.)、杏(P.armeniaca Linn.)、美洲李(P.americana Marsh.)、中国李(P.salicina Lindl.)、马哈利樱桃(P.mahaleb Linnaeus)、苦樱桃(P.emarginata Walp.)、梅(P.mume Sieb.)的mRNA、DNA序列显示出极高的同源性,基本都在90%以上,其中PdPGIP1、PdPGIP2、PdPGIP3与Genbank中登录的3个扁桃PGIP基因的同源性为92%～99%。对氨基酸序列保守性分析发现,含有多数植物PGIP抗病基因表达蛋白特有的亮氨酸重复序列。证明我们所克隆的目的片段为PGIP基因。     

Rose (Rosa hybrida L.) EST-derived microsatellite markers and their transferability to strawberry (Fragaria spp.)

The ‘Genome database for Rosaceae (GDR)’ provides a large collection of expressed sequence tags (ESTs) harboring simple sequence repeats (SSRs) from several Rosaceae genera, including Rosa (rose). Primer pairs flanking SSR were designed for 312 unique Rosa ESTs based on GDR database. Eight rose (Rosa hybrida L.) genotypes were tested for PCR amplification, and 287 (92%) of the primer pairs generated allele-specific PCR bands that were readily scored. From 183 (63.7%) primer pairs that evidenced polymorphic alleles among the eight rose cultivars, 20 pairs evidencing EST sequence homology to known gene functions and high levels of polymorphism were selected and utilized for DNA fingerprinting and genetic diversity assessments of 47 rose hybrids. A total of 202 polymorphic bands were scored and generated unique fingerprints for each rose hybrid. The Nei–Li genetic similarity coefficients among 1081 pair-wise comparisons of 47 cultivars exhibited a broad range of genetic variations from 0.30 (‘Grand King’ and ‘Carnival’) to 0.99 (‘First Red’ and ‘Red Champ’). UPGMA cluster analysis divided 47 hybrids into five major groups and two sub-groups. The cross-species transferability of 273 EST-SSR primer pairs was evaluated using four genotypes of the strawberry, a genus member of the Rosaceae family. PCRs on the DNA samples of strawberry were successful for 165 primer pairs; among these, 123 pairs amplified 243 polymorphic bands. As surrogates of the marker transfer, the phenetic relationship among the four strawberry genotypes was evaluated. Genetic similarity coefficients varied from 0.78 (‘Maehyang’ and ‘Janghyee’) to 0.64 (‘Janghyee’ and ‘Pragana’). The results of cluster analysis showed that the three octaploid strawberry cultivars were quite similar, whereas the diploid ‘Pragana’ was related distantly at the genomic DNA level. The EST-SSR markers developed in the present study can be efficiently utilized for genetic diversity studies in Rosaceae.     

甘蓝LFY基因的克隆及序列分析

以甘蓝ZQ启动抽薹的茎尖为材料,分别提取DNA和RNA,以两对引物扩增并序列拼接得到甘蓝LFYZQ基因DNA序列和cDNA完整编码区,长度分别为2 560、1 239 bp,与花椰菜、拟南芥、芥菜和萝卜同源性分别达到91 %、87 %、86 %、87 %。该基因含有3个外显子（452、394、393 bp）和2个内含子（514、807 bp）,共编码412个氨基酸,内含子剪接位点均符合经典GT-AG法则。将LFYZQ与网上公布的12种十字花科植物LFY氨基酸序列按分子进化分成两类：甘蓝LFYZQ与花椰菜以及Jonopsidium属植物Jonopsidium acaule这3个分为一类;其余10种植物分为第二大类。LFYZQ蛋白分子量为46 kD,是一个不稳定的疏水蛋白,存在N-十四（烷）酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酰胺化位点共4种活性位点。     

苹果柱型基因Co的一个AFLP 标记的SCAR转换

 将苹果柱型基因的一个AFLP 标记成功地转换成了简单实用的SCAR 标记。首先对AFLP 标记片段进行序列测定, 然后根据序列特点设计了两对特异引物CoA1/ CoA2 和CoA1/ CoA3 , 每条引物长20 bp。PCR 结果表明CoA1/ CoA2 可以扩增出216 bp 和148 bp 两条带, 其中216 bp 的为柱型性状的特征带; CoA1/CoA3 可以扩增出273 bp 和205 bp 的两条带, 其中273 bp 的为柱型性状的特征带。两对引物在杂交后代中扩增出的特征带与柱型性状的分离重组率都很低(CoA1/ CoA2 为6. 3 % ±2. 5 %; CoA1/ CoA3 为7. 3 % ±2. 6 %) , 所以它们都可以作为该SCAR 标记的特异引物所用。     

普通核桃(Juglans regia)3个群体遗传结构的SSR分析

以新疆伊犁野核桃、喀什实生核桃及部分栽培品种共80份种质材料为试材,利用来自黑核桃的7对SSR引物进行群体遗传结构分析。结果显示,7对引物多态性带比率为92.3%～100%,均具有较高的多态性;伊犁野核桃、喀什实生核桃及栽培品种3个群体的期望杂合度分别为0.2325、0.3085、0.305,香农系数分别为0.3361、0.4669、0.4646,多态性带百分率分别为56.52、95.83、86.84%,表明3个核桃群体具有较高的遗传多样性水平,3个指标均显示喀什群体的最高、伊犁的最低;从3个群体中随机选出10个株系或品种进行聚类分析,所有参试株系或品种相互交叉,说明伊犁野核桃、喀什实生核桃和栽培品种之间存在基因渗透和交流(基因流Nm=2.0934);讨论了伊犁野核桃、喀什实生核桃和栽培品种的亲缘演化关系,研究结果为"我国是世界栽培核桃的起源中心之一"的论断进一步提供了分子证据。     

节瓜ACC 合酶基因CqACS 的克隆与表达分析

为分析ACC 合酶与节瓜雌性之间的关系，以雌性自交系（A36）和普通雌雄同株自交系（SX）为材料，克隆得 到节瓜ACC 合酶（CqACS）基因，并与葫芦科中已知的ACC 合酶基因进行同源序列比对分析、构建进化树；对A36 幼苗 叶片进行赤霉素（GA3）处理后用qRT-PCR 对CqACS 基因进行表达分析，并统计赤霉素处理前后20 节内的雌花率。结果 表明，CqACS 基因在雌性自交系A36 中的长度为1 318 bp，普通雌雄同株自交系SX 中长度为1 637 bp。经对比分析，SX 比A36 多了91、97、117 bp 3 个片段，除此之外只有2 个碱基的差别。同源序列比对发现，A36 中的CqACS 基因与西瓜中 的Cit-ACS1 基因同源性最高，为95.31%，与黄瓜中的Cs-ACS1 基因同源性为91.13%；SX 中的CqACS 基因与西瓜中Cit- ACS1 基因同源性为78.04%，与黄瓜中的Cs-ACS1 基因同源性为76.06%。GA3 处理后，A36 的平均雌花节率（20 节位内） 为45%，而对照为90%；qRT-PCR 分析发现，与对照相比，CqACS 基因在GA3 处理后的相对表达量显著上调，且在第3 次 处理后4 h 上调最大。     

葡萄A病毒四川分离物的外壳蛋白基因克隆与原核表达

葡萄A病毒（Grapevine Virus A,GVA）是葡萄病毒属（Vitivirus）的典型种,在世界葡萄产区广泛分布。采集10株“藤稔”葡萄成熟枝条,使用6种葡萄病毒ELISA试剂盒检测发现10个样本中有6个感染4种不同的葡萄病毒。以GVA的ELISA阳性植株为材料进行RT-PCR扩增,首次获得了GVA四川分离物SL10的完整外壳蛋白基因（CP）。该基因全长597 bp,将其与GeneBank收录的15个GVA分离物的CP序列进行比对和构建系统进化树。把不同地理起源的GVA分离物分成2个变异组;其中Ⅰ组包括3个分离物(与Ⅱ组的其他分离物只有75.9%～80.1%的序列同一性);其余的13个分离物组成Ⅱ组（组内分离物具有84.4%～99.5%的序列同一性）。构建了GVA CP的原核表达质粒PET-30-GVAcp并转化BL21菌株,经IPTG诱导,目的基因得到了大量表达。