酸不可溶性木质素和漆酶在棉花抗黄萎病中的作用

以抗病海岛棉Pima 90-53、耐病陆地棉冀棉20和感病陆地棉邯208为材料,研究黄萎病菌胁迫下棉花细胞壁的组织结构和木质素含量与棉花抗性的关系,并分析参与木质素合成的胞外漆酶的基因表达水平。结果发现,室内接种黄萎病菌24 h,在Pima 90-53的根部导管组织中没有发现病原菌的侵入,而在冀棉20和邯208的导管组织均有病原菌侵入;接种35 d时,Pima 90-53的茎部导管细胞壁高度木质化且导管堵塞不明显,冀棉20的导管细胞壁中度木质化且导管堵塞不明显,而邯208的导管细胞壁仅发生轻度木质化且导管堵塞严重。对田间病圃种植棉花叶片和叶柄的测定发现,3个品种的酸不可溶性木质素含量与品种的病情指数呈显著负相关(r = 0.99991^*),酸不可溶与可溶性木质素的比值大小与棉花品种黄萎病抗性强弱表现一致。基于此,进一步采用Real-time PCR技术分析参与木质素合成的漆酶基因GhLaccas表达差异发现,在冀棉20接种病菌后各检测时间点的表达量均显著高于邯208,且在冀棉20中GhLaccase表达量较0 h升高9~14倍,在8 h达到最高并在72 h内一直维持较高水平,表现出较高的应答效率。以上结果表明酸不可溶性木质素含量与黄萎病抗性呈正相关,漆酶在棉花抗黄萎病过程中起着重要作用。     

黄萎病菌侵染对感病棉花品种叶片蛋白质组的影响

为进一步探索黄萎病菌与棉花的相互作用,以感黄萎病棉花品种冀棉11为实验材料,在接种大丽轮枝菌V991 3 d后提取叶片蛋白,运用双向电泳和质谱分析技术研究黄萎病菌侵染后叶片蛋白质组学的变化。分析发现,与对照相比差异表达量在2倍以上的蛋白点有22个,其中上调表达的蛋白点10个,下调表达的蛋白点12个。质谱鉴定发现,上调表达的蛋白包括ATP合成酶β亚基,Ru Bis CO活化酶1,Ru Bis CO活化酶α2以及果糖-1,6-二磷酸醛缩酶,下调表达的蛋白包括质体叶绿素AB结合蛋白,核酮糖二磷酸羧化酶大链以及核酮糖二磷酸羧化酶小链。分别对下调表达的蛋白rubisco小亚基基因(RBCS)和叶绿素AB结合蛋白基因(cab)、上调表达的蛋白Ru Bis CO活化酶1基因(RCA1)进行荧光定量PCR,发现接种黄萎病菌后3个基因在m RNA水平与蛋白水平上的变化是一致的。通过分析推测,黄萎病菌通过与参与光合能量代谢的蛋白相互作用,破坏植物的光合作用,近而引起棉花叶片的萎蔫与凋零。     

棉花黄萎病菌毒素ELISA检测方法的建立及其应用

以纯化的棉花黄萎病菌毒素(PLPC)免疫新西兰白兔制备了PLPC特异性抗血清,建立了可特异性检测棉花黄萎病菌毒素的A蛋白双抗体夹心ELISA方法。应用建立的ELISA方法测定了病菌培养滤液、人工接种幼苗和大田病株不同组织中的毒素,结果表明:不同产毒能力菌株(VD 8和VD-5)在25℃下振荡培养3d后就能在培养滤液中检测到毒素,这比生物测定要早2～3d。将VD-8菌株的孢子以灌根方式接种泗棉3号幼苗5d后,就能从接种幼苗的茎杆和叶柄中检测到毒素,这比幼苗自然发病显症要早3～5d。在测定的30份大田病株茎杆、叶柄、叶脉样品中,阳性样品率为100%。这些结果表明建立的ELISA方法可用于菌株产毒能力的测定和大田棉花黄萎病的早期诊断。     

利用WGCNA鉴定棉花抗黄萎病相关基因共表达网络

加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)作为一种典型的系统生物学方法,可用来鉴定协同表达的基因模块,探索模块与目标性状之间的生物学相关性,并挖掘网络中的核心基因。黄萎病(Verticillium wilt)可严重降低棉花(Gossypium spp.)的产量及品质,因此研究抗病基因及抗病机制,对于棉花抗病育种工作具有重要意义。本研究以黄萎病菌侵染不同时间点的海岛棉(Gossypium barbadense)幼苗根尖转录组数据为基础,分析其差异表达基因,并选取在不同样本之间表达水平变异最大的前50%基因(共35,647个)进行WGCNA。结果表明,在黄萎病菌侵染条件下,共有22,850个基因差异表达,其中4685个为所有侵染时间点共有的差异基因。共鉴定到18个基因共表达模块,其中5个为抗黄萎病相关特异性模块(black、mediumpurple3、darkolivegreen、plum3模块分别与侵染2 h、6 h、48 h、72 h时间点正相关;mediumpurple2与侵染2 h时间点负相关)。GO和KEGG富集分析表明,特异性模块可以富集到有生物学意义的富集结果,如刺激响应、钙离子结合、黄酮类化合物合成代谢等抗逆相关通路。通过计算模块内基因的连通性,挖掘出了网络中的核心基因,功能预测表明,这些基因可能在逆境胁迫响应中发挥重要作用。本研究为进一步理解棉花抗黄萎病的分子机制、选育棉花抗病新品种提供了理论指导。     

来源于耐旱荒漠植物蛋白CkND对棉花黄萎病的抑制作用及其抗旱性研究

 利用蛋白组学策略分离了荒漠植物-牛心朴子（Cynanchum komarovii）抗病、抗旱功能相关蛋白CkND。以棉花黄萎病菌为供试菌株,研究了蛋白CkND对棉花黄萎病的抑制作用。结果表明：蛋白CkND对棉花黄萎病菌菌丝生长及孢子萌发具有较好的抑制作用。离体试验中,100 mg·L^-1的蛋白CkND对棉花黄萎病菌菌丝生长抑制效果在24 h、48 h、72 h分别为79.53%、83.01%、87.50％,35 mg·L^-1的蛋白CkND对孢子萌发抑制率为100%;活体试验中,蛋白CkND对棉花黄萎病具有显著的防治效果。另外,本研究将CkND基因构建到pCAMBIA1304表达载体CaMV35S启动子下游,将pCAMBIA1304-CkND通过农杆菌介导转化法转入野生型拟南芥植株中。将33个株系的转pCAMBIA1304 -CkND的 T₂代拟南芥和21株转pCAMBIA1304的T₂代拟南芥,同时进行抗旱性试验。结果显示,转pCAMBIA1304 的T₂代拟南芥14个株系枯死,而转pCAMBIA1304-CkND的 T₂代拟南芥有24个株系的转基因植株存活,且叶片保持绿色,植株生长良好,根系、须根发达,须根数目明显增多。转pCAMBIA1304-CkND拟南芥株高增加了30%,显著提高了植物抗旱性。     

河南省不同地区棉花黄萎病菌分离物致病性及其毒素致萎活性测定

在河南省不同地区分离并鉴定33株棉花黄萎病菌分离物,并进行了致病力和粗毒素致萎活性测定。致病力结果表明,河南省棉花黄萎病菌分离物可分为强、中、弱3种致病力类型,分别占48.5%、21.2%、30.3%。河南省同一地区内不同分离物间致病力差异明显。粗毒素致萎活性测定结果表明,黄萎病菌强致病力分离物分泌的粗毒素对棉苗的致萎力较强,弱致病力分离物分泌的粗毒素对棉苗的致萎力较弱,强、中、弱3种致病力类型分离物在72h时对棉苗的平均致萎指数分别为63.82、52.38、45.83。采用考马斯亮蓝法测定不同分离物粗蛋白含量,结果表明,不同黄萎病菌分离物分泌的粗蛋白含量存在明显差异,且与其所致的病情指数呈显著正相关。     

过氧化物酶同工酶与棉花黄萎病抗性的相关研究

对20个来源及抗性不同的海岛棉和陆地棉品种和2个陆地棉(S)/海岛棉(R)杂交组合 的亲本、 F1、 F2世代的POX同工酶研究表明, 接种黄萎病菌前后, 棉花叶片中的 POX同工酶酶谱发生明显变化, 抗病品种与感病品种的阴性POX同工酶谱带均由原来的3 条 增 至6条, 但两者之间不存在明显差异; 阳性POX同工酶谱带接种前后均只有1条(     

棉花黄萎病不同抗性品种接菌前后体内酶活性及酚类物质含量的变化

研究了对黄萎病不同抗性棉花品种在接菌前后酶活性与酚类物质含量的变化。结果表明 :棉花对黄萎病的抗性与棉株组织中的过氧化物酶 (POD)、多酚氧化酶 (PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性及酚类物质 (主要为二元酚 )含量密切相关。不同抗感黄萎病棉花品种接种病原菌后 ,4个指标都有不同程度地提高 ,并于接种后 3～ 5d内出现峰值 ,峰值高低与抗性程度呈正相关     

丙基双氢茉莉酮酸酯诱导棉花耐黄萎病的效应

温室内以10mg·L 1的丙基双氢茉莉酮酸酯(PDJ)灌根预处理后,再用黄萎病菌(Verticilliumdahliae)孢子悬浮液接种棉苗,处理棉苗与对照相比发病率和病情指数有所降低,表现出对棉花黄萎病的耐病性。对一些生化指标进行测定发现,PDJ灌根和接种都可引起棉苗叶片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性升高和木质素含量的增加,与此同时棉花叶片中的过氧化物酶(POD)活性及丙二醛(MDA)含量也都有所上升,在此基础上对PDJ诱导棉花耐黄萎病的可能生化机制作了归纳。     

抗黄萎病海岛棉叶片在大丽轮枝菌胁迫下的蛋白组学分析

【目的】探讨海岛棉抗黄萎病材料的抗病机理,寻找可能的抗病基因。【方法】以高抗黄萎病海岛棉材料长312为试材,利用蛋白质双向凝胶电泳和质谱鉴定技术探讨棉花在大丽轮枝菌胁迫下蛋白质水平的变化。【结果】在接种大丽轮枝菌2 h后,长312叶片中有11个蛋白表达水平下调,15个蛋白表达水平上调;下调表达的蛋白主要是与光合作用及碳同化相关的一些酶类,推测大丽轮枝菌危害棉花叶片主要是破坏其光合系统;表达水平上调的蛋白主要是一些与光合作用、碳同化相关的酶类及苯醌还原酶、β-D-半乳糖苷酶、14-3-3f蛋白等抗病蛋白。【结论】推测海岛棉对黄萎病的防御机制发生在2个层面:一是被动防御,可能通过叶绿体ⅡA-B结合蛋白、核酮糖二磷酸羧化酶等下调蛋白的同工蛋白上调表达保持抗病海岛棉光合系统的稳定,通过组蛋白和14-3-3f蛋白的高表达保持抗病海岛棉植株细胞的稳定性;二是主动防御,可能通过高表达β-D-半乳糖苷酶和苯醌还原酶等参与海岛棉的抗病反应。