发根农杆菌介导的茶树发根高频诱导与遗传转化

以两种野生型发根农杆菌菌株、三种共培养培养基和六种外植体为试材,建立了茶树发根高频诱导体系,最高发根诱导频率达30%以上。最佳发根诱导体系为：OD₆₀₀为0.5~0.8的发根农杆菌菌液侵染已培养60~70βd苗龄无菌苗茎段10~50βmin,在添加100βmmol/L乙酰丁香酮的YMB固体培养基上共培养2βd,在含500βmg/L头胞噻肟钠的MS培养基上诱导发根。发根在不含激素的LG₀培养基上生长迅速,产生大量侧枝和根毛。PCR证实,发根农杆菌Ri质粒T-DNA的rolA、rolB和rolC基因已经插入到发根基因组DNA中。应用此发根诱导体系,以含携带Bt基因的双元载体质粒pCAMBIA2301的发根农杆菌15834,侵染茶树外植体诱导出发根,PCR和GUS组织化学染色证实外源基因已经插入到基因组DNA中并获得表达。     

几种农杆菌的耐酚性能比较与驯化研究

为了明确不同农杆菌菌种对茶多酚的耐受性能变化幅度,以及驯化培养对提高农杆菌茶多酚耐受性、从而提高茶树遗传转化中遗传转化率的作用与可行性,本文比较了茶多酚对四种农杆菌生长的抑制率,进行了耐酚菌株的驯化培养,最后比较了驯化菌株与原始菌株的转化能力。结果表明:茶多酚对几种农杆菌均有明显的生长抑制作用,但不同菌种的耐受性能差异较大;通过驯化培养得到的耐酚菌株EHA105AP,其耐酚性能提高了90.89%,同时,其在茶树叶片和愈伤中的GUS瞬时表达率也分别提高了43.85%和57.55%。     

发根农杆菌转化茶树细胞的应用前景

本文介绍了发根农杆菌转化茶树的机制、感染方法以及影响遗传转化的因素,并阐述了毛状根在茶树生产中的应用现状及前景。     

茶树快速育苗方法研究

针对茶树无性系育苗周期长以致不适应茶产业快速发展需求的问题,本研究开发了一种基质育苗技术,将育苗周期由传统的14-18个月缩短到2个月,加速茶树育种进程。同时,对40个不同茶树品种的扦插发根特性进行了比较研究,证明‘浙农121’发根最快,而‘竹枝春’发根最困难,为品种推广提供有用资料。     

茶树发根中茶氨酸和儿茶素类含量的分析

茶树发根在LG₀培养基和添加1βmg/L IBA的1/2MS培养基上生长迅速,但只在一个培养于LG₀培养基的发根克隆中检测到高含量的茶氨酸,含量达到23.12βmg/g鲜重,高于未转化根的18.77βmg/g鲜重。除茶氨酸外,该发根克隆中也检测到高含量的天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和精氨酸。发根克隆培养于添加1βmg/L IBA的1/2MS培养基,茶氨酸的含量则显著降低,说明培养基组成也是影响发根中茶氨酸的含量的因素之一。茶树发根中也含有少量的儿茶素类单体,主要为儿茶素和表儿茶素。     

黄酮对发根农杆菌介导花生发根转化的影响

植物体内酚类小分子物质促进发根农杆菌Ri质粒毒性区(Vir)活化,从而启动发根农杆菌的转化。选用黄酮含量在408～677μg RTE/g FM间的花生种子。侵染时花生种子的子叶黄酮含量在495～1038μg RTE/g FM之间。花育51号的诱导率最高,为71.0%,根系干质量为0.047 g/根系。相关分析表明,发根农杆菌侵染时的花生黄酮含量与发根诱导率两者间呈线性负相关。研究结果为发根农杆菌转化花生机理研究奠定了基础。     

茶多酚对农杆菌介导的植物遗传转化体系的影响

为研究在农杆菌介导的茶树遗传体系中,茶多酚对农杆菌侵染效率的影响,以LBA4404、EHA105、ATCC15834和K599 4个农杆菌菌株为研究对象,分析其在不同浓度茶多酚处理下的耐酚能力、被膜完整率、吸附性、vir和chv基因表达,以及遗传转化差异。结果显示,4个菌株的耐酚能力依次为LBA4404>K599>EHA105>ATCC15834,其中EHA105和ATCC15834菌株对茶多酚较为敏感;ATCC15834菌株被膜完整率与茶多酚的浓度、静置时间呈负相关,EHA105在600 mg·L^-1茶多酚处理48 h后,其被膜完整率最低;ATCC15834和EHA105对烟草叶肉细胞的吸附能力随着茶多酚浓度的升高而降低,在经茶多酚处理24 h后,ATCC15834中chvB和EHA105中chvB2的表达受到显著抑制,virA表达量与低浓度酚类的敏感性呈正相关性;烟草经农杆菌菌液（含茶多酚）侵染后,瞬时转化效率和稳定转化效率均受到不同程度的抑制,发状根诱导率大大降低。1 000 mg·L^-1茶多酚处理后,ATCC15834的发根诱导率最低,仅为13.85%,坏死率高达33.85%。综上所述,茶多酚会降低农杆菌活力和被膜完整率,chv基因通过降低表达量影响其吸附性,最终导致烟草转化体系中瞬时转化效率和稳定转化效率均受到不同程度的抑制。     

茶树短穗插育苗的研究进展

本文从茶树短穗扦插的成活率与插穗性质的关系，提高插穗发根和成活率的技术措施，扦括发根解剖学研究，茶树扦插全息生物学，生理生化研究等5个方面对茶树短穗扦插研究进行了概述，并指出了今后茶树短穗扦插研究的方向。     

发根农杆菌介导抗菌肽Shival基因转化马铃薯的初步研究

利用已构建载体530 Shiva,转化马铃薯普通栽培种甘农薯1号、澳布、HLS和夏波蒂的试管苗及块茎盘的研究.结果表明,以Kan 50 mg·L-1和100 mg·L-1作为筛选转基因细胞和植株的剂量.对于发根农杆菌侵染马铃薯试管苗应采用新鲜菌落直接涂抹伤口进行侵染,这种方法诱导生根率高且易于操作,根诱导率、成愈率及分化率远高于浸泡法;发根农杆菌转化试管苗,后期愈伤组织分化产生5个幼苗.发根农杆菌菌液侵染甘农薯1号和夏波蒂两品种的块茎盘,7 d后就有很小的毛状根突起产生,2周后即有大量毛状根产生,3周后毛状根产生量有所减少,产生的毛状根3周时其成愈率分别为31.0%和27.0%,愈伤组织分化成苗比较困难,分化出3个幼苗,分化率分别为6.45%和3.70%.转化材料进行冠瘿碱检测表明,分化苗均为胭脂碱阳性反应.环腐病菌接种试管苗结果表明,分化植株与对照相比抗性明显增强.     

ABT生根粉对茶树扦插应用效果的探讨

用ＡＢＴⅠ、Ⅱ号生根粉,采用种浓度处理槠叶齐、７９－１０－０４、茗丰３个品种,认为：ＡＢＴⅠ、Ⅱ号生根粉有促进发根和生长的效应。建议对发根较困难的珍贵茶树品种扦插繁殖时,采用ＡＢＴⅠ号５００ｍｇ／Ｌ（５ｓ）或１０００ｍｇ／Ｌ（１ｓ）浓度的溶液,速蘸插穗基部,促进发根生长。     

Bt基因表达载体的构建及对茶树遗传转化的研究

用限制性内切酶HindⅢ和BglⅡ从pGA4 71质粒中切取Bt基因并转入载体pCAMBIA2 30 1中 ,构建后的质粒含Bt基因、intron -GUS基因和NPTⅡ基因。将构建后的质粒转化大肠杆菌 ,通过三亲交配法分别导入农杆菌菌株LBA4 4 0 4、EHA10 5、pRi15834中。以茶树叶片、愈伤组织为转化的受体材料 ,用农杆菌介导法将其转入茶树中 ,获得了GUS瞬间表达。以潮霉素作为愈伤组织筛选的选择性试剂 ,效果明显优于卡那霉素 ,适宜浓度为 2 0 μ/ml;以卡那霉素作为茶树叶片材料的筛选试剂 ,50 μ/ml为宜。     

贵州绿茶中咖啡碱和儿茶素含量分析

对贵州省243份绿茶样品中咖啡碱和儿茶素类物质采用高效液相色谱方法进行检测。结果表明：贵州省绿茶中儿茶素含量范围为9.14%~27.28%,平均含量15.71%;咖啡碱含量为1.08%~3.33%,平均含量2.24%。各地区茶叶儿茶素品质指数多数为1000~2000,其中黔南地区的最高为1975.51;各地区的儿茶素苦涩味指数主要在8.00~17.04之间,黔西南地区的苦涩味指数最低为8.00。据此分析可得,贵州绿茶具有很高的利用价值,春茶适合开发高品质的名优茶,秋茶适合用于茶叶深加工或有效成分的提取。     

根癌农杆菌介导茶树转化研究

通过检测GUS瞬间表达 ,对影响根癌农杆菌侵染茶树叶片效果的若干因素进行研究。Kan对茶树叶片愈伤组织形成的抑制浓度在 3 0mg/L左右 ,因而对以Kan为筛选标记的载体来说 ,5 0mg/LKan是较为适宜的选择浓度。茶树较为适宜的农杆菌转化系统是用OD6 0 0 为 0 5 - 0 8的LBA4 4 0 4侵染 10分钟左右 ,暗中2 8℃共培养 2 - 3天。硝酸银对农杆菌生长有抑制作用 ,不宜在共培养阶段添加     

茶树无色花色素还原酶基因克隆及表达分析

采用EST测序技术和3′RACE技术,获得了茶树儿茶素代谢途径中的一个重要酶—无色花色素还原酶的全长基因,在GenBank的登录号为EF205148,序列全长1 301 bp,其中开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37.5 kD,理论等电点为5.81。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树无色花色素还原酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约60 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。同源性分析表明茶树无色花色素还原酶基因编码的氨基酸序列与其他植物具有较高的相似性,例如与亚洲棉、草莓和葡萄的相似性分别为70%、68%、71%。利用半定量PCR技术检测总儿茶素含量不同的4个茶树品种中与类黄酮合成相关的黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)、花色素合成酶(ANS)等7个基因的表达情况,结果表明DFR和LAR基因的表达量与茶树中总儿茶素含量呈一定的相关性,而其他基因则与其相关性不大。     

茶树内生防病和农药降解菌的分离

对不同茶树品种的健叶和病叶上分离的内生细菌进行了筛选和鉴定。结果表明,茶树体内存在大量的内生细菌,各品种间内生细菌的数量为2.9×106~39.4×106cfu/(g?fw)。内生细菌的生物功能测定结果表明,菌株TL2的拮抗能力强,先接种菌株TL224h后再接种茶轮斑病菌的防病效果好;同时菌株TL2对氯氰菊酯也表现出较强的降解能力;另外菌株TL2能在茶树上内生定殖。经鉴定,菌株TL2为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。     

四川崇州枇杷茶野生大茶树生化成分及制茶品质初探

通过调查四川崇州枇杷茶野生大茶树的资源现状,根据植物学特征,从中选取具代表性的茶树初分为6种不同类型（依次编号为A类、B类、C类、D类、E类、F类）,测试了其主要生化成分含量,评审了所制红、绿茶样的制茶品质。结果表明,不同类型枇杷茶树游离氨基酸总量为（2.46±0.07）%~（5.69±0.10）%,茶多酚含量为（21.67±0.40）%~（37.16±0.99）%,咖啡碱含量为（4.01±0.18）%~（4.88±0.03）%,水浸出物含量为（33.31±2.49）%~（47.28±1.35）%,儿茶素总量为（77.08±1.18）~（236.47±29.59）mg/g,因此,部分材料可以作为选育高儿茶素、高咖啡碱等特异成分的育种材料。以咖啡碱、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯作为影响红碎茶品质的第一、二、三主成分或综合因子,结合主要生化成分含量、酚/氨值及感官审评结果可推论,E类适制红茶,F类制绿茶品质最优。从茶氨酸及苯丙氨酸的含量比例、儿茶素组分及总量等可推论,6类供试枇杷茶树中,E类茶树进化程度最高,接近栽培型。     

利用发根农杆菌体系检测大豆CRISPR/Cas9系统的靶点

作为一种基因编辑的新技术，CRISPR/Cas系统已被广泛应用于各种生物的基因工程中。但CRISPR/Cas9 基因编辑系统还存在着一定的脱靶现象，确定基因编辑靶点选择的可行性可提高基因编辑效率。本研究选用大豆 GmCO 基因为靶标，使用CRISPR/Cas9基因编辑系统来构建靶点的基因敲除载体，并且利用发根农杆菌K599菌株 对大豆子叶进行侵染，再通过植物组织培养的方法促使大豆外植体长出不定根，通过不定根检测发现在靶点2处出 现了碱基的缺失，说明成功实现了对大豆目标基因的编辑。此方法操作简单，周期短，实现了对大豆中选择靶点的 可行性的快速鉴定，为研究大豆的GmCO 基因功能和遗传改良方面提供了新的技术支持。