运用电激转化技术构建杀虫工程菌

将苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素杀虫蛋白基因(简称Bt基因)导入荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),创建新型微生物农药,在国外已有产品试销。在国内,也已引起广泛重视。本实验室曾运用转座子接合转移技术,将Bt基因导入对小麦全蚀病防治效果显著、并有促进植物生长作用的荧光假单胞菌P303菌株中,构建了兼有杀虫防病作用的工程菌。此后,又运用电激转化技术将带有Bt基因的重组质粒转入P303菌株中,获得了具有杀虫活性的PT410、PT415等工程菌株。     

绿针假单胞菌YL-1抗细菌活性相关基因的克隆和分析

绿针假单胞菌YL-1对植物多种重要病原细菌和病原真菌有较强的抑制作用。采用转座子插入突变技术电转化绿针假单胞菌YL-1,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对3种病原细菌荚壳伯克霍尔德菌Burkholderia glumae、解淀粉欧文氏菌Erwinia amylovora和胡萝卜果胶杆菌Pectobacterium carotovora抑菌效果显著下降的突变体,并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到YL-1染色体基因组上。利用质粒拯救技术克隆转座子插入位点基因、测序和生物信息学分析。结果表明:本研究成功构建了绿针假单胞菌YL-1随机插入突变体库,筛选出7株对3种病原细菌抑制效果明显下降的突变体,但其对立枯丝核菌的抑制效果与野生型菌株YL-1相同;PCR和Southern Blot试验结果表明绿针假单胞菌YL-1的7株突变体均是单拷贝;克隆到7个突变体插入位点的基因序列并测序,生物信息学分析结果表明其中6个突变位点是嗜铁素合成基因簇,1个突变位点是蛋白分泌基因sec Y。     

荧光假单胞菌2P24中phlF基因对抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚产生的影响

Pseudomonas fluorescens2P24是分离自山东小麦全蚀病自然衰退土的1株生物防治菌株,产生抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol;2,4-DAPG)是其主要防病机制。2,4-DAPG是由phlACBD基因簇合成,受多种调控因子调控。本研究用Tn5转座子插入技术,获得1株phlA基因转录增强的突变体,其突变基因为抗生素合成的负调控基因phlF。与野生菌相比,phlF基因的缺失突变体中phlA的转录增强约100倍,抗生素产量提高492倍。同时,菌株2P24的phlF缺失突变体对病原真菌的拮抗作用明显增强。但2,4-DAPG过量表达菌株对多种作物种子根生长有抑制作用。     

利用青枯菌胞外蛋白输出缺失突变体防治西红柿青枯病的研究

作者采用转座子Tn5诱变植物青枯菌获得了世界首例植物青枯菌胞外蛋白输出缺失突变体(简称eep突变体)。该突变体在缺失了许多胞外蛋白(包括有植物细胞壁降解酶、果胶酶类和纤维素酶类)外输功能后,也失去了对寄主的致病力。因此,该类突变体有可能被应用于植物青枯病的生物防治。本文主要是针对eep突变体在番茄上的定埴能力和生防效果进行研究。     

洋葱伯克霍尔德氏菌JX-1防治番茄青枯病机理的初步分析

本研究分离得到一株对茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum具有明显拮抗作用的根围细菌JX-1，其温室防治番茄青枯病的防效达80.89%。形态学、生理生化、16S rDNA序列和gyrB序列分析表明，该菌株属于洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepacia。生防相关性状分析表明，菌株JX-1可产生嗜铁素、蛋白酶等抗菌物质。抗生素合成相关基因分析发现，菌株JX-1还可能产生硝吡咯菌素和藤黄绿脓菌素。转座子随机突变获得2株明显影响菌株JX-1拮抗能力的突变菌株，其中突变体M1710对茄科雷尔氏菌拮抗作用完全消失，序列分析表明Tn5破坏了与非核糖体寡肽产生相关基因tlpks/nrps；而突变体M645则对茄科雷尔氏菌的拮抗作用显著增强，序列分析表明Tn5破坏了gntR基因。上述结果表明，菌株JX-1可产生多种次生代谢产物，并且tlpks/nrps基因和gntR基因在防治番茄青枯病过程中起到重要调整作用。     

内生细菌B3-7 的运动性参与其在小麦根系的内生定殖和对小麦全蚀病的生物防治

 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B3-7 是一株对于小麦全蚀病具有有效生防作用的小麦内生细菌。为了研究B3-7 在小麦根内的定殖机制,本研究将含有转座子TnYLB-1 和温度敏感型复制子的质粒pMarB 转化B3-7 菌株,高温处理后TnYLB-1 插入细菌基因组中,构建转座子插入突变体库。通过筛选,获得1 株在小麦根内定殖能力显著降低的突变体B3-7-458。利用反向PCR 方法分离转座子插入位点的侧翼序列并分析其特征,发现转座子插入导致细菌鞭毛运动性相关基因mota 失活,同时发现mota 失活菌株对于小麦全蚀病的生防能力降低。通过构建互补载体对突变基因mota 进行互补分析,发现互补菌株的运动性、在小麦根系内部的定殖能力以及对于小麦全蚀病的生防能力得以恢复。本研究证明了生防菌蜡样芽孢杆菌B3-7 的mota 基因参与该菌株在小麦根系的内生定殖,也参与了该菌株对于小麦全蚀病的生物防治。     

小麦全蚀病生防细菌的筛选和鉴定

为获得对小麦全蚀病菌有良好拮抗效果的生防菌株,分别从河南省商丘市及驻马店市小麦全蚀病发生田块中采集小麦根际土样,采用稀释平板涂布法共分离到1051株细菌,通过与全蚀病菌G1037菌株进行平板对峙筛选,最终获得9株具有明显拮抗效果且生长状况良好的菌株。16S rDNA序列比对及生理生化性状分析结果表明：菌株P155、P154、P16及P147为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens,菌株P188和P97为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida,菌株LY3为产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes,菌株S38为嗜根寡养单胞菌Stenotrophomonas rhizophila,菌株B20为洋葱伯克霍尔德Burkholderia cepacia。产抗生素相关基因的检测结果发现,菌株P147含吩嗪和硝吡咯菌素合成基因,菌株B20含硝吡咯菌素合成基因。除B20、LY3、S38和P147外,其余菌株均可产生嗜铁素。9株细菌都产蛋白酶。除P97、B20和S38外,其余菌株均可产脂肽类物质。盆栽试验结果表明,9株生防菌对小麦全蚀病都具有较好的防治效果,菌株P155和P154的防治效果最好,相对防效分别为67.11%和63.82%,略高于3%的苯醚甲环唑种衣剂的防治效果。研究结果表明这些细菌具有作为小麦全蚀病生防菌的潜力。     

荧光假单胞杆菌的嗜铁素是控制桉树灰霉病的主要因子

 本文对3个假单胞杆菌菌株(Pseudomonas spp.)及其嗜铁素(pseudobactin siderophore)缺失突变体防治桉树灰霉病进行了研究.平板拮抗活性测定表明,荧光假单胞杆菌(P.fluorescens) WCS374r菌株和恶臭假单胞杆菌(P.putida) WCS358r菌株通过对铁离子的竞争抑制灰霉菌的生长.在接种灰霉病菌之前10 h将WCS358r、WCS374r和WCS417r施用于受伤的桉树叶片后,可分别降低发病率48.9%、58.3%和40.3%;当将3种生防菌分别与灰霉病菌混合后接种桉树叶片,WCS358r和WCS374r仍然能够显著地降低发病率;在接种灰霉病菌12 h后再施用生防菌,WCS358r和WCS374r对病菌仍具有一定的抑制作用,而在24 h后施用生防菌,3个菌株均未表现显著的防治效果.WCS358r和WCS417r的嗜铁素缺失突变体无防病作用,而WCS374r的嗜铁素缺失突变体虽然还能有效地防治灰霉病,但与WCS374r相比,防病效果减弱.本试验结果说明假单胞杆菌的嗜铁素是控制桉树灰霉病的重要因子.     

转座子Tn5诱导的水稻白叶枯病菌毒性基因突变体及其生化行为

 通过接合试验,将转座子Tn5从三个供体菌中引入水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzae Dye)日本系统小种3菌株(JXOⅢ)的细胞内,接合频率分别为0.2×10^-6,0.4×10^-7和0.27×10^-6。随机挑选的接合子总DNA与³²P标记的含有Tn5的探针质粒(pJB4JI:Tn5)杂交,放射自显影显示出同源杂交带。在6000个JXOⅢ的Tn5诱变株中,发现13个菌株对8个供试水稻品种(早生爱国3号,IR26,IR20,IR8,cas209,南粳15,金南风和TN-1)都不致病,表现为不亲和反应。在含有酶解基质的平板上,比较了JXOⅢ和13个毒性基因突变体的胞外水解酶活性和多糖产量。结果发现所有突变体的蛋白酶活性和胞外多糖产量都增强;所有突变体的淀粉酶活性和大多数突变体的果胶酶活性都是从无到有;突变体纤维素酶活性基本不变;大多数突变体的酯酶活性有所降低。     

绿色荧光蛋白标记荧光假单胞菌P303及其生存能力检测

构建了含有荧光假单胞菌自身启动子PP303的中间质粒载体pGFP.然后利用mini-Tn5转座子,通过接合转移,将两个带有不同启动子的绿色荧光蛋白基因分别整合到荧光假单胞菌P303染色体上,获得了在488nm波长下发光稳定的P303m1和P303m3菌株.PCR鉴定和Southern印迹结果均证明绿色荧光蛋白已随机插入P303染色体.SDS-PAGE结果表明,含有PA1/04/03启动子的P303m3菌株GFP表达量低于含有PP303启动子的P303m1菌株,染色体标记的GFP表达量低于质粒标记.室内平板抑菌试验结果表明,P303m1与出发菌株P303抑菌活性相当,对九种植物病原真菌有较强的拮抗作用.定殖、生存竞争能力研究表明,荧光假单胞菌在自然土壤中和大白菜根际都具有较强的定殖能力.P303和P303m1在自然土壤中第60天的菌量分别为1.63×104和3.3×102cfu/g土(湿重),大白菜根际第50天的菌量分别为3.29×106和4.1×104cfu/g根(湿重).     

枯草芽胞杆菌YB-05对小麦全蚀病菌胞内酶活的影响

小麦全蚀病菌是影响小麦产量和质量的主要致病菌之一,前期研究表明枯草芽胞杆菌YB-05对小麦全蚀病菌的生长具有抑制作用。本试验拟通过研究该菌对小麦全蚀病菌相关酶系的诱导变化情况,解析其对小麦全蚀病菌的抑制作用机理。本试验以小麦全蚀病菌Gaeumannomyces gramini（Sacc.）Arx et Oliver var. tritici（Sacc.）Walker为靶标菌,加入终浓度为MIC₅₀枯草芽胞杆菌YB-05发酵液,通过显微镜观察菌株YB-05发酵液对小麦全蚀病菌菌丝结构和形态的影响,通过酶活力测定检测菌株YB-05发酵液对小麦全蚀病菌胞内苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）防御酶活的影响,同时检测菌株YB-05发酵液在离体/活体条件下对小麦全蚀病菌线粒体复合酶Ⅱ/Ⅲ活力的影响。小麦全蚀病菌经菌株YB-05发酵液处理后,显微镜观察到其菌丝变粗、断裂,顶端膨大,分枝增多;处理8 d后,胞内的PAL、POD、CAT、PPO和SOD活性比对照依次高24.52%、72.67%、81.81%、80.36%和112.48%;离体条件处理,线粒体复合酶Ⅱ和Ⅲ的活性与对照组相比差异不显著,而活体条件处理下差异显著,线粒体复合酶Ⅱ和Ⅲ分别比对照组分别降低43.95%和55.87%。菌株YB-05发酵液通过结合小麦全蚀病菌线粒体复合酶Ⅱ和Ⅲ的相关基因,从而影响该基因的表达,抑制小麦全蚀病菌线粒体复合酶Ⅱ和Ⅲ的活力,影响小麦全蚀病菌的呼吸,进而导致抑制小麦全蚀病菌菌丝畸变,从而影响小麦全蚀病菌的正常生长。     

利用小麦内生细菌防治小麦全蚀病的初步研究

植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内,并与植物建立了和谐关系的一类细菌。内生细菌对植物的益生作用主要表现为促进植物生长、抑制植物病原物、增加植物的抗逆性和他感作用等几个方面。小麦全蚀病（wheat take-all）作为一种世界毁灭性病害,目前,由于缺乏抗病品种和有效的化学防治药剂,所以利用微生物之间的拮抗作用来控制小麦全蚀病危害具有广阔的应用前景。本研究通过从小麦里分离出内生细菌,从中筛选出对小麦全蚀病菌具有拮抗作用的菌株,在研究其拮抗机制和定殖作用基础上,对其防治小麦全蚀病的作用进行了初步研究。     

荧光93菌体和代谢物对全蚀病菌和小麦生长影响的初步研究

对荧光假单胞菌工程菌剂“荧光93”菌体和代谢物的作用特性进行了比较。结果表明:该菌剂能保护小麦根系免遭全蚀病危害,对植株生长有促进作用。菌体的抑菌能力强于代谢物,浸种处理防效分别为44.8％和27.8％;代谢物具有更强的刺激植株生长作用,在无病条件下,代谢物灌根处理鲜重增加34.5％,菌体处理鲜重增加7.5％。培养基成份对代谢物的作用有一定影响:以马铃薯葡萄糖培养产生的代谢物,抑菌效果好;营养肉汁酵母粉培养产生的代谢物,促生作用好。据此推断,荧光93菌剂代谢产物中含有抑制全蚀病菌和刺激植株生长的物质。     

Yield Trends during Take-all Decline in Spring Barley and Wheat Grown Continuously1

The effects of take-all, nitrogen and cropping sequence on grain yield were compared for spring barley and spring wheat grown in extended monoculture. Initial crops showed least take-all and maximum yields. Yields fell to a minimum more rapidly in wheat than in barley while the take-all intensity increased to a maximum; take-all decline occurred and yields improved from the 4th and 5th years respectively. Without nitrogen, yields were at their lowest level; application of nitrogen increased yields considerably with responses in proportion to the rate applied. At optimum rates, yield losses were 33% for wheat and 11% for barley with maximum disease intensity but only 9% and 3% respectively with take-all decline. Potential maximum yields in the absence of take-all were calculated to be greater with barley than with wheat.     

植物青枯病原细菌胞外蛋白相关基因的克隆

 用含有转座子Tn5的铜绿假单胞杆菌PAO1826(pMO75∷Tn5,Km^r)诱变我国马铃薯青枯菌小种3号菌株PO41,获得6000多个胞外多糖正常产生的接合子。经SDS-PAGE电泳,筛选出2个胞外蛋白减少9种的突变株PM2644和PM239,其可以引起烟草叶片典型的过敏性反应,致病力比野生型菌株显著降低,皆为原养型菌株。Southern杂交的结果表明,突变株染色体上只有1个转座子插入位点。标记交换证明,9种胞外蛋白缺失与转座子插入相偶联的频率为100%。以聚半乳糖醛酸酶和内葡聚糖酶2种胞外酶为指示蛋白进行定量测定的结果表明,在突变株上清液中和菌体细胞内都没有这2种胞外酶的存在。以突变株PM2644为受体菌,通过基因功能互补的方法,从野生型青枯菌基因文库筛选到2个阳性克隆pPSP1和pPSP2,它们既能恢复2个突变株产生胞外蛋白的能力,也能将2个突变株的致病力恢复到接近野生型菌株的水平。     

Frequency, Diversity, and Activity of 2,4-Diacetylphloroglucinol-Producing Fluorescent Pseudomonas spp. in Dutch Take-all Decline Soils

ABSTRACT Natural suppressiveness of soils to take-all disease of wheat, referred to as take-all decline (TAD), occurs worldwide. It has been postulated that different microbial genera and mechanisms are responsible for TAD in soils from different geographical regions. In growth chamber experiments, we demonstrated that fluorescent Pseudomonas spp. that produce the antibiotic 2,4-diacetylphloroglucinol (2,4-DAPG) play a key role in the natural suppressiveness of two Dutch TAD soils. First, 2,4-DAPG-producing fluorescent Pseudomonas spp. were present on roots of wheat grown in both of the TAD soils at densities at or above the threshold density required to control take-all of wheat; in a complementary take-all conducive soil, population densities of 2,4-DAPG-producing Pseudomonas spp. were below this threshold level. Second, introduction of 2,4-DAPG-producing strain SSB17, a representative of the dominant geno-typic group found in the Dutch TAD soils, into the take-all conducive soil at population densities similar to the densities of indigenous 2,4-DAPG producers found in TAD soils provided control of take-all similar to that observed in the TAD soil. Third, a mutant of strain SSB17 deficient in 2,4-DAPG production was not able to control take-all of wheat, indicating that 2,4-DAPG is a key determinant in take-all suppression. These results show that in addition to the physicochemically different TAD soils from Washington State, 2,4-DAPG-producing fluorescent Pseudomonas spp. are also a key component of the natural suppressiveness found in Dutch TAD soils. Furthermore, it is the first time since the initial studies of Gerlagh (1968) that at least part of the mechanisms and microorganisms that operate in Dutch TAD soils are identified. Although quantitatively similar, the genotypic composition of 2,4-DAPG-producing Pseudomonas spp. varied between the Dutch TAD soils and the TAD soils from Washington State.     

Enhanced field control of wheat take-all using cold tolerant isolates of Gaeumannomyces graminis var. graminis and Phialophora sp. (lobed hyphopodia)

Cold tolerant isolates of Gaeumannomyces graminis var. graminis ( Ggg ) and Phialophora sp. (lobed hyphopodia), which produced at least comparable growth rates at 5°C to those of pathogenic G. graminis var. tritici ( Ggt ), were shown to control take-all disease in wheat effectively in 2 years of field experiments in New South Wales, Australia. The addition of oat inoculum of these fungi at the rate of 60 kg/ha to the seeding furrow significantly ( P  ≤ 0.05) reduced disease and increased grain yields by 33–45% compared to the Ggt alone treatment. The use of 30 kg/ha of oat inoculum also significantly ( P  ≤ 0.05) reduced disease and increased grain yields by 21–44%. These high levels of take-all control were obtained consistently from four field experiments on three different soil types with different pHs. A treatment inoculated with Ggg alone showed no disease symptoms and produced grain yields similar to that of untreated wheat. This fungus is, therefore, non-pathogenic to wheat. At high rates of inoculation of Ggg and Phialophora sp. (lobed hyphopodia), 65–80% of tillering wheat plants (GS 32) had root systems colonized by these fungi. In contrast, two Pseudomonas spp. and an isolate each of Ggg and Phialophora sp. (lobed hyphopodia), which did not grow at 5°C, were ineffective in controlling take-all. Take-all assessments during heading (GS 61-83) were highly correlated ( R ²=0.6047, P ≤0.0005) with the relative yield increase or decrease of inoculated treatments compared to the Ggt alone treatment. The use of a Ggg isolate (90/3B) and a Phialophora sp. (lobed hyphopodia) isolate (KY) for take-all control has been patented. These fungi are being developed for commercial use.     

小麦Stpk-V同源基因的克隆及全蚀菌诱导下的表达特征分析

<正>由禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var.tritici)侵染引起的小麦全蚀病是小麦上一种重要的根部病害,广泛分布于世界各小麦种植区。近年来,小麦全蚀病在黄淮冬麦区发生呈上升趋势。选育和种植抗病品种是解决小麦全蚀病危害的根本途径,抗病基因研究是抗病育种的基础性工作。随着目前克隆基因数量的日益增加,利用已知抗病基因的保守序列或根据已有抗病基因的序列信息克隆抗病基因已经成为抗病及相关基因克隆