柑橘AOS1-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

对柑橘中茉莉酸（Jasmonic acid,JA）生物合成途径中的关键限速酶丙二烯氧化物合酶AOS家族基因进行注释,确定其受溃疡病菌Xanthomonas citri subsp. citri(Xcc)诱导的表达模式。从甜橙数据库中共注释出3个AOS家族成员,其中CsAOS1-2对溃疡病菌响应最强烈;CsAOS1-2在‘晚锦橙’（甜橙,易感溃疡病）和‘金弹’（金柑,抗溃疡病）中均受病原菌诱导,但在‘晚锦橙’中表达量上调幅度远高于金弹;CsAOS1-2全长2 656 bp,开放阅读框1 599 bp,编码532个氨基酸,分子量为59 499.81,为非分泌性蛋白,其349～510 aa为典型的P450功能域;Cs AOS1-2的表达无组织特异性;‘晚锦橙’和‘金弹’的AOS1-2启动子均含有参与植物激素和逆境应答的顺式作用元件,但在数量和类型上存在差异;烟草瞬时转化亚细胞定位分析显示CsAOS1-2定位在叶绿体中。CsAOS1-2强烈响应柑橘溃疡病菌的侵染,推测其与柑橘溃疡病敏感性具有密切的关系。     

溃疡病菌侵染早期柑橘细胞程序性死亡的响应特征及机制

为进一步研究柑橘溃疡病抗性与细胞程序性死亡的关系， 以高感品种晚锦橙（甜橙类，Citrus sinensis Osbeck）和高抗品种金弹（金柑类，Fortunella crassifolia Swingle）为试材，从抗性特征、发病早期的相关信号变化、抗氧化酶活性和基因表达变化等方面探讨柑橘细胞程序性死亡响应溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri）侵染的特征及机制。接种溃疡病菌后，晚锦橙叶片出现明显的海绵状凸起，为典型的溃疡病症状；而金弹则出现超敏化反应细胞坏死症状。接种前，过氧化氢（H2O2）在金弹中的基础水平较晚锦橙高；接种后，两品种的H2O2含量均上升，但金弹上升幅度高于晚锦橙。随着H2O2水平升高，代表膜脂过氧化程度的丙二醛（MDA）含量在两个品种中均增加，但金弹中增加幅度更大。抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）活性在晚锦橙和金弹叶片中均呈下降趋势；过氧化氢酶（CAT）活性在两个品种中均提高且差异不大；过氧化物酶（POD）活性在两个品种中均提高，但晚锦橙的上升更快，且提高程度低于对照。参与细胞程序性死亡正调控的基因CsCEP1-1、CsCEP1-2和CsMCA1在两个品种中均受溃疡病菌诱导上调表达，但金弹中的表达水平显著高于晚锦橙；参与细胞程序性死亡负调控的CsDAD1-1、CsDAD1-2、CsMLO2和CsMLO3的转录水平在晚锦橙中变化不大，而金弹中随着接种时间的延长逐渐降低。结果表明，溃疡病菌胁迫下晚锦橙和金弹在发病早期均启动了超敏化反应，但在金弹中更为强烈，有助于诱导发生细胞程序性死亡，而限制病原菌的生长，这可能是金弹抗病性强的内在原因之一。     

柑橘超量表达CsNBS-LRR通过SA信号途径增强对溃疡病抗性

克隆了柑橘CsNBS-LRR基因，分析该基因在柑橘溃疡病菌（Xcc）、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导下的表达特征，通过在晚锦橙中超量表达验证其功能。结果表明，CsNBS-LRR的开放阅读框为3 633 bp，编码1 210个氨基酸。其在感病品种晚锦橙中受Xcc诱导下调表达，而在低感品种四季橘中上调表达；在四季橘中受水杨酸诱导明显上调表达，而晚锦橙中上调幅度较小；两品种CsNBS-LRR受茉莉酸甲酯诱导均不明显；超量表达载体转化晚锦橙获得4个阳性植株；抗性评价表明超量表达CsNBS-LRR明显提升了转基因植株对柑橘溃疡病的相对抗性（病情指数为野生型的75% ~ 88%）；转基因植株中水杨酸含量和水杨酸合成途径中关键基因转录水平明显提高；水杨酸信号途径中的PR基因转录水平也升高。综上所述，CsNBS-LRR是柑橘抗溃疡病的1个抗病基因，它可能通过对水杨酸途径的调控一定程度上增强柑橘对溃疡病抗性。     

柑橘CsNCED3-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

柑橘溃疡病是世界柑橘的一种重要病害，对柑橘产业造成严重的经济损失。对柑橘中9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）基因家族进行注释，并克隆出受柑橘溃疡病菌诱导表达的CsNCED3-2，确定了其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库共注释出14个NCED基因家族成员，根据系统发育树和功能结构域将其分为4个亚类；CsNCED3-2其序列全长2 377 bp，开放阅读框1 830 bp，编码609个氨基酸，属于RPE65超家族成员和类胡萝卜素双加氧酶家族成员，是非分泌性蛋白；在‘晚锦橙’和‘金弹’叶片注射溃疡病菌后的各个时间点，‘晚锦橙’叶片中CsNCED3-2的相对表达量总体高于‘金弹’，并且两品种的相对表达变化呈相反趋势；与茎、叶和种子相比，CsNCED3-2在两品种果皮中表达量较高；两品种的CsNCED3-2上游启动子均含有参与植物激素和逆境应答相关的顺式作用元件ABRE（脱落酸响应）、TCA-element（水杨酸响应）、MYC/MYB（干旱响应）等，但数量和类型存在差异。     

柑橘响应黄龙病侵染的韧皮部蛋白2基因CsPP2B15的克隆与表达分析

黄龙病病原菌诱导柑橘筛孔胼胝体过度积累是其致病的一个重要因素。柑橘韧皮部蛋白（Phloem Protein,PP）在筛孔胼胝体积累中起着重要作用。为研究柑橘韧皮部蛋白响应黄龙病亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）侵染的功能,克隆获得了一个响应黄龙病侵染差异表达的PP基因CsPP2B15的编码区和长1.5 kb的启动子序列,并以高感品种锦橙和耐病品种酸柚老叶和嫩叶为材料,进行基因表达分析。结果发现,CsPP2B15在高感品种锦橙嫩叶中受CLas诱导显著上调表达,而在耐病品种酸柚嫩叶中受CLas诱导显著下调表达,且在叶肉中的表达量显著高于叶脉。嫩叶和嫩梢被认为是柑橘响应黄龙病侵染的早期原初侵染部位。因此,CsPP2B15可能在CLas侵染柑橘早期中起重要作用。CsPP2B15启动子的顺式作用元件预测分析发现,CsPP2B15启动子含有许多与逆境和激素有关的顺式作用元件。进一步构建了CsPP2B15启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定均表明,CsPP2B15启动子具有较强的韧皮部组织特异性。     

过氧化氢酶基因CsKat01与柑橘溃疡病相关性分析

为了探究过氧化氢酶基因Cs Kat01在柑橘抵御溃疡病过程中的作用,对感病品种‘晚锦橙’和抗病品种‘四季橘’中Cs Kat01进行了生物信息和表达分析,并探究了溃疡病菌接种处理后两品种中CAT酶活性和H2O2含量的关系。克隆Cs Kat01的编码序列并对该基因及其编码蛋白进行结构和功能分析,发现Cs Kat01编码框全长为1482bp,共编码493个氨基酸残基,蛋白序列中含有典型的CAT结构域;通过启动子序列克隆和分析发现‘晚锦橙’和‘四季橘’核心启动子区域均含有水杨酸、茉莉酸和脱落酸的响应元件,但数量不同;利用q RT-PCR分析水杨酸、茉莉酸、脱落酸和柑橘溃疡病菌(Xcc)对Cs Kat01的诱导表达特性,发现Cs Kat01的高表达可能使柑橘相对更感病;结合Xcc诱导后植物组织中Cs Kat01酶活性和H2O2含量,综合分析Cs Kat01、CAT酶活、H2O2含量和柑橘对溃疡病抗性之间的关系,推测Cs Kat01基因可能通过调控CAT的酶活性,改变H2O2含量进而影响柑橘对溃疡病的抗性。     

甜橙SWEET2a促进柑橘溃疡病菌侵染

柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染感病种质冰糖橙叶片后，在侵染部位形成典型的火山口凸起症状，但在抗病种质枸橼C-05叶片侵染部位呈现逐渐褐色坏死，未形成溃疡病典型症状。基于前期冰糖橙和枸橼C-05叶片接种Xcc的转录组测序结果，分析鉴定的20个甜橙SWEET受Xcc诱导表达变化，结果显示SWEET2a和SWEET17d在冰糖橙中受Xcc诱导上调表达，SWEET12b在枸橼C-05中受Xcc诱导上调表达；实时荧光定量PCR验证，SWEET2a在冰糖橙叶片中受Xcc诱导高表达而在枸橼C-05叶片中表达变化不显著；SWEET2a在不同柑橘种质同源基因编码的氨基酸序列相似性为94.6%，其启动子顺式作用元件在冰糖橙和枸橼C-05中的种类和数量存在较大差异。冰糖橙和枸橼C-05叶片瞬时过表达结果显示，SWEET2a促进Xcc的繁殖，且拟南芥过表达转基因株系接种毒性菌Pst.DC3000(Pseudomonas syringae tomato DC3000)后，单位叶面积菌含量显著高于野生型。SWEET2a蛋白部分定位于质膜，表明SWEET2a...     

柑橘CsMYB41和CsMYB63响应溃疡病菌侵染的表达

MYB转录因子不仅在植物生长发育中起着重要作用，且在植物抗病反应中承担着重要的调节功能。本研究中以溃疡病感病品种纽荷尔脐橙（Citrus sinensis Osbeck）和抗病品种四季橘（C. madurensis）为材料，基于前期构建的溃疡病诱导柑橘转录组数据库，筛选获得2个受柑橘溃疡病菌Xanthomonas citri subsp. citri(Xcc)显著诱导的MYB基因：CsMYB41(Cs1g06220)和CsMYB63(Cs4g12760)。利用PCR技术克隆了纽荷尔脐橙的CsMYB41和CsMYB63，并对其结构特征及表达特性进行分析。PCR克隆测序分析发现，这2个基因的全长分别为1 304 bp、1 398 bp，开放阅读框（ORF）为1 047 bp、1 170 bp，各编码349、390个氨基酸。蛋白质同源序列比对和结构分析表明，这2个基因属于MYB类转录因子家族中的R2R3-MYB亚家族；进化树分析表明，CsMYB41和CsMYB63蛋白分别与可可、蓖麻等MYB41和MYB63蛋白高度同源。亚细胞定位结果显示，CsMYB41和CsMYB63定位在细胞核中。实时荧...     

柑橘响应黄龙病菌侵染的NAC基因的克隆及表达分析

挖掘柑橘抗黄龙病（Huanglongbing,HLB）基因是抗病育种的基础和关键。以感染黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)早期（2个月）锦橙根和叶片中脉比较转录组数据为基础，筛选到9个响应柑橘黄龙病侵染诱导的NAC基因，从中选3个差异表达水平较高的基因克隆，分别命名为Cs NAC21/22、Cs NAC68和Cs NAC78。生物信息分析表明3个基因均符合NAC基因家族的特征；烟草亚细胞定位结果表明，Cs NAC68定位在细胞核，Cs NAC21/22和Cs NAC78定位在细胞核和细胞质。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明，3个候选基因在易感HLB的锦橙、耐病的马蜂柑和高耐病的九里香的组织和病原菌诱导表达特征呈现明显差异。以健康植株为对照，Cs NAC68和Cs NAC78主要在锦橙的根中响应CLas感染，显著上调表达，Cs NAC68在九里香叶肉和马蜂柑根中响应CLas感染，显著上调表达；Cs NAC21/22主要在锦橙根和马蜂柑叶肉中显著下调表达。以‘锦橙’叶片为试材通过q RT-PCR分析候选基因响应SA、J...     

CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征

由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。     

柑橘溃疡病菌分化及防治研究进展

对柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)的分类地位、菌系分化和致病机理进行了总结,重点阐述了运用生物学、血清学和分子生物学方法鉴定溃疡病菌遗传变异的研究进展,并介绍了该病的防治方法。     

枸橼种质对柑橘溃疡病的抗性鉴定

柑橘溃疡病(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)是严重阻碍柑橘产业发展的世界性检疫病害,防控困难,选育抗病品种为防治溃疡病的唯一有效办法。枸橼C-05是柑橘属独特的抗溃疡病种质,为抗性机理和抗病育种提供了种质基础。为了进一步评价枸橼C-05的抗性,另外收集了13份枸橼种质,对其进行溃疡病的离体和活体抗性评价。叶片形态学观察表明,14份枸橼种质存在较大的形态学差异。采用离体与活体注射接种不同浓度的柑橘溃疡病菌,根据叶片的感病症状、病斑周围黄色晕圈大小等典型溃疡病症状,综合评价枸橼类种质的抗病性。结果表明:枸橼种质之间对溃疡病的抗性存在极大差异,溃疡病的抗性评价综合病情指数显示枸橼C-05、园香橼、矮果香橼、美国枸橼、普通枸橼和印度大果综合病情指数较小,表现为极抗病或抗病,其他枸橼种质表现不同程度的感病性;枸橼种质的抗病或感病性与其叶片形态特征无关。枸橼C-05和5个抗病枸橼种质对柑橘溃疡病具有针对性的抗性,这对进一步研究抗病机理和抗病育种具有重要意义。     

柑橘溃疡病抗性相关的SSR标记筛选

以抗柑橘溃疡病的‘宜昌橙2586’与易感病的‘岭南沙田柚’进行杂交,随机选取F₁ 代材料80 株,开展溃疡病抗性田间接种鉴定。鉴定结果表明,溃疡病抗性在F1 代分离明显,若将免疫和高抗类型均视为抗病,中抗、中感和感病类型均视为感病,则抗感的分离比例接近1︰1。采用集合分离分析法BSA (Bulked Segregant Analysis),结合SSR 分子标记技术,筛选到1 个与柑橘溃疡病抗性相关的分子标记CCR-110。利用F₁ 代分离个体和公认的抗感材料对标记进行验证分析,发现该标记表现较好的抗性相关性。F₁ 群体相关分析表明,该标记与柑橘溃疡病抗性的相关系数为0.79;采用最大似然法计算重组率为9.38%±3.5%,通过 Kosambi 函数将其转换成图距单位（cM）,遗传距离为9.11 cM;感病的甜橙类、柚类、枳类没有此标记,抗病的金柑类、宜昌橙类、香橙类、宽皮柑橘类的多数材料出现此标记。     

柑橘响应溃疡病菌转录因子基因CsAP2-09的克隆与功能分析

对柑橘中AP2转录因子进行注释,并克隆柑橘溃疡病相关的Cs AP2-09,研究外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、机械损伤以及溃疡病菌对该基因的诱导表达,确定其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库一共注释出12个AP2成员,据系统发育和结构可以将其分为4个亚类;可能与抗、感溃疡病相关的Cs AP2-09基因全长4 159 bp,开放阅读框1 467 bp,编码488个氨基酸,具有典型的AP2结构,同时也具有一些结构特殊性;该基因在细胞核中优势表达,与定位信号预测结果吻合;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,如BOX-W1、CGTCA-motif、TCA-element、WUN-motif等;诱导结果表明Cs AP2-09对外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利及机械损伤均有响应;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因明显上调表达,而在感病品种纽荷尔中变化趋势不显著。上述研究表明Cs AP2-09是一个响应溃疡病菌侵染的,可作为研究柑橘抗溃疡病的候选基因。目前已将其在锦橙中超表达,共筛选出8个转基因植株,后期将对其进行抗病性评价以确定其分子育种价值。     

响应黄龙病侵染的柑橘乙醇脱氢酶基因CsADH1的克隆与表达分析

对前期在感染黄龙病的‘晚锦橙’中发现的明显差异表达的柑橘乙醇脱氢酶（CsADH1）基因进行克隆测序分析，结果表明，CsADH1 的 CDS 序列长为 1 143 bp，编码 380 个氨基酸。蛋白质结构预测显示，CsADH1 含有乙醇脱氢酶 GroES（ADH_N）和 ADH_zinc_N 保守结构域。进化树分析显示，CsADH1 蛋白与拟南芥、蓖麻和中国莲的 ADH 蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示，CsADH1 蛋白定位在细胞质中。以感病‘晚锦橙’的根和叶脉为材料，qPCR 分析显示 CsADH1 在感病根和叶脉中均上调表达，且根中的表达水平是叶脉中的 10 倍。离子胁迫试验和外源植物生长调节剂诱导试验表明，Zn、水杨酸（SA）、生长素（IAA）和脱落酸（ABA）均显著诱导 CsADH1 上调表达，并且根中的表达水平明显高于叶中。本结果表明，CsADH1 可能在柑橘根响应黄龙病菌侵染中起着重要作用。